CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤與三陰性乳腺癌新輔助化療療效的關(guān)系

孔天東，陳露，段方方，王留晏，周寒麗，趙曉麗，劉萌萌，劉丹娜

0 引言

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅婦女健康的世界性疾病，死亡率僅次于肺癌，位居惡性腫瘤第二位[1]。2020年，美國新確診乳腺癌約27萬例，4.2萬例乳腺癌患者死亡[2]。在所有乳腺癌中，三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一種特殊類型，TNBC約占所有乳腺癌的16%，確診后5年生存率明顯低于其他類型乳腺癌患者[3]。TNBC一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，對化療的敏感度顯著降低，中位生存時間縮短至6月以下[4]。TNBC較其他乳腺癌具有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，術(shù)后3年復(fù)發(fā)率和5年死亡率均較高[5-6]。由于缺乏ER、PR和HER-2表達(dá)，對其他類型乳腺癌治療有效的藥物通常對TNBC無效[7]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes,Tils）主要存在于腫瘤微環(huán)境，主要由異質(zhì)性淋巴細(xì)胞構(gòu)成，在多種實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，尤其是CD8+Tils細(xì)胞數(shù)量減少和免疫失活關(guān)系密切[8]。近年來，CD8+Tils與免疫治療的療效關(guān)系研究成為熱點(diǎn)，但結(jié)論尚不明確。在TNBC中，CD8+Tils相關(guān)研究較少，也無針對性的表達(dá)情況及療效預(yù)后分析，本研究擬探討CD8+Tils在TNBC患者中的表達(dá)情況及其與新輔助化療療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

本研究回顧性分析2013年6月—2019年6月在河南大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的126例三陰性乳腺癌患者臨床病理資料，術(shù)前均行新輔助化療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號：2019-12-017-K06）。因本研究為回顧性分析，僅采集患者臨床病理資料，不涉及干預(yù)患者治療方案，不會對患者生理帶來任何風(fēng)險，且最終數(shù)據(jù)不會泄露任何個人隱私，已申請免除知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理明確診斷為乳腺癌且免疫組織化學(xué)ER（-）、PR（-）、HER2（-），若免疫組織化學(xué)HER2為（+）或（++），須經(jīng)FISH檢測為未擴(kuò)增；（2）臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期；（3）均為女性患者；（4）年齡18～75歲；（5）PS評分0～2分；（6）術(shù)前完成4～6周期新輔助化療后，再行手術(shù)治療；（7）術(shù)后標(biāo)本或組織保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病例資料不完整，缺乏必要的檢查化驗(yàn)結(jié)果，例如心、肝、腎檢查化驗(yàn)指標(biāo)，術(shù)前腫瘤影像學(xué)評估不完善者；（2）術(shù)前穿刺組織或術(shù)后標(biāo)本腫瘤組織過少，無法再行相關(guān)免疫組織化學(xué)檢測；（3）研究者認(rèn)為應(yīng)該排除的患者，主要包括病史資料記錄不完整、術(shù)后隨訪記錄不完全或缺失、術(shù)前臨床分期有誤、無法判斷是否真絕經(jīng)等。

1.2 試劑與檢測

即用型CD8兔抗人單克隆抗體購自福州邁新公司。所有標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，2 μm連續(xù)切片，烘干機(jī)烘烤，并經(jīng)二甲苯、梯度酒精、蒸餾水脫蠟，使用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶，后加入兔抗人CD8單克隆抗體，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)1 h；PBS沖洗后滴加二抗，室溫孵育20 min；DAB顯色，蘇木精對比染色，鹽酸酒精分化、脫水、透明、封片、顯微鏡下觀察。操作步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書（MaxVision試劑盒KIT-5030）進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對照，以慢性扁桃腺炎組織作CD8的陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

CD8+Tils密度計(jì)算：CD8+Tils陽性著色均定位于細(xì)胞膜，呈淡黃色至棕褐色粗顆粒。于低倍鏡下觀察整張切片，選取CD8+Tils細(xì)胞豐富的5個高倍視野（×400）計(jì)算其陽性細(xì)胞比例，取平均值。陽性細(xì)胞比例＜10%為低表達(dá)、10%～40%為中表達(dá)、≥40%～90%為高表達(dá)。根據(jù)CD8+Tils表達(dá)中位值將患者分為低密度組和高密度組[9]，本研究Cut-off值為10%，即CD8+Tils表達(dá)比例＜10%為低密度，記為（-）；≥10%為高密度，記為（+）。

1.4 隨訪

通過病歷或電話隨訪獲得患者術(shù)后病理情況、生存狀況、無病生存時間（disease-free survival,DFS）。隨訪日期截至2020年6月30日。DFS定義為自術(shù)后第1天至腫瘤復(fù)發(fā)或任何原因死亡或至隨訪截止日期的生存時間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26和R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并行Log rank檢驗(yàn)。將DFS作為因變量，年齡、分級、月經(jīng)狀況、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67指數(shù)、PS評分、腫瘤大小、脈管受侵、手術(shù)方式、新輔助化療方案等作為自變量進(jìn)行Cox單因素、多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+Tils的表達(dá)情況與入組患者臨床資料特征的關(guān)系

CD8+Tils表達(dá)高密度有45例（35.7%），具體情況見表1。

表1 CD8+淋巴細(xì)胞高密度浸潤與入組患者臨床病理資料關(guān)系 (n(%))Table 1 Relation between high-density infiltration of CD8+lymphocytes and clinicopathological data of involved patients (n(%))

2.2 CD8+Tils的表達(dá)及與pCR的關(guān)系

46例患者術(shù)后病理完全緩解（pathological complete remission,pCR）。將126例患者根據(jù)CD8+Tils表達(dá)情況分為高密度組（n=45）和低密度組（n=81），高密度組有30例（66.7%）達(dá)pCR，低密度組有16例（19.8%）達(dá)pCR，兩組pCR率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.467,P=0.000），見圖1～2。

圖1 高低密度CD8+Tils組pCR率對比Figure 1 Comparison of pCR rates between high-and low-density CD8+Tils groups

圖2 三陰性乳腺癌組織高低密度組CD8+Tils的表達(dá)Figure 2 Expression of CD8+Tils in high-and low-density groups of triple negative breast cancer tissue

2.3 CD8+TiLs浸潤與DFS的關(guān)系

截至隨訪日期，79例因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移達(dá)到DFS事件終點(diǎn)（其中35例生存），14例因非本病原因死亡，33例處于無復(fù)發(fā)生存狀態(tài)。CD8+Tils高密度浸潤患者中位DFS為49.0月（95%CI:37.2～60.8），與CD8+Tils低密度浸潤患者DFS 25.0月（95%CI:20.0～30.0）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.480,P=0.000），見圖3。

圖3 CD8+Tils浸潤密度對三陰性乳腺癌患者DFS的影響Figure 3 Effects of CD8+TiLs infiltration densities on DFS of TNBC patients

2.4 單因素及多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示：年齡、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯與預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05）。將上述單因素分析有意義的變量納入多因素分析，另外結(jié)合臨床實(shí)際情況，將單因素分析無意義的CD8+Tils強(qiáng)制納入多因素分析，結(jié)果顯示病理高分級、腫瘤＞2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）、脈管侵犯（+）、CD8+Tils低密度表達(dá)均為長期生存的不良影響因素（P＜0.05）。另外CD8+Tils為獨(dú)立預(yù)后因素，腫瘤組織高密度表達(dá)者，預(yù)后良好，HR為0.52，降低進(jìn)展風(fēng)險48%，見表2。

表2 不同臨床病理特征生存風(fēng)險的單因素及多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analyses of survival hazards for different clinicopathological features

3 討論

目前雖然乳腺癌整體治療效果及生存預(yù)后較之前有很大提高，但TNBC改善并不明顯，治療手段也較為有限[10]。對于局部晚期乳腺癌患者，尤其是TNBC患者，新輔助化療是一種重要治療手段，新輔助治療的主要目的是提高治愈率[11]，降低術(shù)后復(fù)發(fā)。研究表明，對TNBC患者，新輔助治療后病理完全緩解的患者生存率明顯提高[12]。但新輔助化療達(dá)到pCR的患者比例較低（20%～40%），因此，迫切需要探索TNBC患者新輔助化療療效有意義的生物標(biāo)志物。

近年來，隨著免疫治療的興起，對免疫標(biāo)志物的探索也成為熱點(diǎn)，Tils曾被認(rèn)為是免疫治療有效的生物標(biāo)志物，還有多項(xiàng)研究[13-15]表明，Tils尤其是CD8+高度浸潤與多種上皮腫瘤患者的長期預(yù)后相關(guān)，但尚缺乏在TNBC中的研究。Liu等[16]研究表明CD8+淋巴細(xì)胞浸潤可能與基底細(xì)胞乳腺癌預(yù)后相關(guān)。但基底細(xì)胞乳腺癌并不等同于TNBC，目前如何分型基底細(xì)胞乳腺癌尚存困難，難以在臨床推廣。本研究入組126例TNBC患者，檢測患者腫瘤組織的CD8+Tils浸潤程度，根據(jù)平均陽性細(xì)胞表達(dá)程度，以10%為界，分為低密度組和高密度組。結(jié)果顯示，CD8+Tils高密度浸潤與年齡＜60歲、病理高分級、臨床高分期有關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

在CD8+Tils浸潤與療效預(yù)后方面，國內(nèi)外在其他實(shí)體瘤方面進(jìn)行了一些研究。林晶等[17]研究顯示CD8+T細(xì)胞浸潤程度越高，胃癌患者預(yù)后越好。盧慧敏等[18]研究顯示CD8+T細(xì)胞高浸潤是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素，浸潤程度越高，預(yù)后越好。本研究觀察了不同浸潤密度與TNBC患者術(shù)后pCR的關(guān)系，結(jié)果顯示高密度CD8+Tils浸潤者術(shù)后pCR率明顯高于低密度組（66.7%vs.19.8%,P=0.000），這與de Groot等[19]研究結(jié)果一致。另外，本研究還觀察了不同CD8+浸潤密度導(dǎo)致的術(shù)后DFS差異，CD8+Tils高密度浸潤患者中位DFS為49.0月（95%CI:37.2～60.8），較CD8+Tils低密度浸潤患者（DFS:25.0月，95%CI:20.0～30.0）有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。初步證實(shí)CD8+Tils可能是TNBC患者療效及預(yù)后的有效指標(biāo)。

本研究采用Cox分析對臨床各項(xiàng)指標(biāo)以及CD8+Tils浸潤與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行研究，多因素分析結(jié)果表明病理高分級、腫瘤＞2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）、脈管侵犯（+）、CD8+TiLs低密度浸潤均為長期生存的不良影響因素，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外CD8+Tils為TNBC獨(dú)立預(yù)后因素，這與Liu等[16]研究結(jié)果一致，腫瘤組織高密度表達(dá)者，預(yù)后良好，HR為0.52，降低DFS進(jìn)展風(fēng)險48%。

本研究具有潛在局限性：針對CD8+TiLs浸潤密度評估并沒有一個客觀標(biāo)準(zhǔn)，不同的病理中心可能有較大差異。另外由于三陰性乳腺癌發(fā)病率較低，能夠行術(shù)前新輔助化療的患者較少，而符合本研究入組條件的合格病例更少，因此入組患者跨度較長，有可能對最終研究結(jié)果造成偏倚。而且因?yàn)榻M織樣本的局限性，本研究無法觀察化療前后CD8+Tils浸潤情況的變化，尚需要進(jìn)一步開展前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)評估化療對腫瘤組織Tils浸潤變化情況的影響。