白藜蘆醇通過下調(diào)POLD1抑制乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

王夢(mèng)欣，梁至潔,2*，黃東琳，萬言，蔣洪棉，黎洪棉，陳茂劍，韋長(zhǎng)元

0 引言

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）被認(rèn)為是癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力的生物學(xué)行為基礎(chǔ)[1]，眾多細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子參與了癌細(xì)胞EMT的調(diào)控[2]。近年來也有學(xué)者逐漸發(fā)現(xiàn)一些藥物或者治療手段可以通過逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的EMT狀態(tài)從而達(dá)到降低細(xì)胞耐藥性和殺傷細(xì)胞的目的[3]。

乳腺癌細(xì)胞中異常的DNA復(fù)制與侵襲能力密切相關(guān)。DNA聚合酶-δ（polymerase delta,Pol-δ）是DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶，而DNA聚合酶的催化亞基基因POLD1編碼的蛋白P125是Pol-δ的活性亞基之一。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)POLD1在乳腺癌組織中高表達(dá)，與患者的臨床分期[4]及細(xì)胞的侵襲能力[5]關(guān)系密切，可能是調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的重要靶點(diǎn)之一。

白藜蘆醇（resveratrol,RSV）已被證實(shí)能對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲[6]、EMT[7]及衰老[8]等多種生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控，其對(duì)乳腺癌的療效是肯定的，進(jìn)一步探索其中的調(diào)控機(jī)制有利于尋找更多的作用靶點(diǎn)和調(diào)控涉及的通路。POLD1是乳腺癌細(xì)胞維持腫瘤相關(guān)行為的重要基因，但目前尚無研究指出RSV對(duì)POLD1的調(diào)控機(jī)制。本研究擬探索RSV對(duì)POLD1的調(diào)控作用，并探究POLD1在RSV抑制MDAMB-231細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

MDA-MB-231細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。POLD1過表達(dá)重組慢病毒顆粒購自上海復(fù)百澳生物科技有限公司。胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM培養(yǎng)基和青、鏈霉素溶液均購自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室、6孔板、24孔板均購自美國(guó)Corning公司?；|(zhì)膠購自美國(guó)BD公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購自索萊寶生物試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用一抗（GAPDH、POLD1、Vimentin）均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；E-cadherin和N-cadherin均購自美國(guó)Abcam公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、抗鼠IgG（H+L）抗體、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液均購自碧云天公司。凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 u/ml+鏈霉素0.1 mg/ml的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中維持生長(zhǎng)，2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/毫升，接種于96孔板中，每孔100 μl（共分為7組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)基，按分組分別加入含終濃度為0、1、2.5、5、10、25、50 μmol/L RSV的DMEM 100 μl，另設(shè)空白對(duì)照組加入DMEM 100 μl，繼續(xù)以同樣條件孵育48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)孵育4 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值。比較7組細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)12 h后，加入POLD1過表達(dá)重組慢病毒（帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）標(biāo)簽），另設(shè)不加病毒的空白對(duì)照組和空載陰性對(duì)照組，同時(shí)加入2 μg/L病毒增強(qiáng)液，12 h后換新鮮完全培養(yǎng)基。72 h后加入嘌呤霉素（2 mg/L）篩選。1周后嘌呤霉素濃度減半繼續(xù)篩選1周。獲得POLD1-OE和POLD1-NC穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染驗(yàn)證 GFP熒光法測(cè)定轉(zhuǎn)染效率：慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，使用倒置熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量比例（即暗場(chǎng)細(xì)胞數(shù)與明場(chǎng)細(xì)胞數(shù)的比），一般要求熒光細(xì)胞比例高于80%。

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)法測(cè)定轉(zhuǎn)染效率：分別用TRIzol法提取未處理的MDA-MB-231細(xì)胞（Ctrl組），POLD1-NC細(xì)胞（POLD1-NC組），POLD1-OE細(xì)胞（POLD1-OE組）的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書操作）后，行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)（按TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書操作）。

POLD1引物、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成。POLD1上游引物：5′-GCTCCGCTCCTACACGCTCAA-3′；下游引物：5′-GGTCTGGTCGTTCCCATTCTGC-3′。GAPDH上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’；下游引物：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)POLD1、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平（POLD1-NC組、RSV+POLD1-NC組和RSV+POLD1-OE組）。將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞收集于 1.5 ml EP管中，RIPA細(xì)胞裂解液裂解，BCA方法測(cè)量蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液充分混合后煮沸 5 min使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉1.5 h，一抗孵育過夜（4℃）：POLD1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、GAPDH（體積稀釋比均為1:1 000），次日用TBST浸洗30 min，分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1:1 000稀釋）室溫下孵育1 h，TBST浸洗30 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，并在凝膠成像系統(tǒng)中掃描拍照。利用Image lab軟件對(duì)Western blot檢測(cè)的條帶灰度值進(jìn)行圖像分析，用GAPDH蛋白表達(dá)量進(jìn)行組間矯正，得到蛋白表達(dá)半定量分析柱狀圖。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔板中，100 μl基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按照1:7比例稀釋，取70 μl稀釋膠均勻鋪到Transwell小室上室。各組細(xì)胞用胰酶消化并用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，分別取1×105個(gè)/毫升、100 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液600 μl刺激遷移。于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h 后，移除上室細(xì)胞。用棉簽擦拭清除上室中未穿膜的細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定40 min，下室用結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)穿膜的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞在6孔板中鋪板，培養(yǎng)至100%融合。融合的單層細(xì)胞以100 μl吸頭垂直劃線，再用PBS將劃掉的細(xì)胞洗凈，以相應(yīng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。在0和24 h對(duì)劃痕進(jìn)行拍照，用Image J軟件處理圖像，通過對(duì)初始劃線（0 h）和后期觀察點(diǎn)（24 h）劃痕的面積對(duì)比來計(jì)算劃痕愈合率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV濃度依賴性殺傷MDA-MB-231細(xì)胞活性

CCK-8法結(jié)果顯示，RSV對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有顯著的殺傷能力，所有RSV刺激組的MDA-MB-231細(xì)胞存活率較0 μmol/L組下降，同時(shí)細(xì)胞的存活率隨著RSV刺激濃度增加而降低，濃度上升至5 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），說明RSV的腫瘤殺傷力呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖1。我們將25 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 不同濃度RSV作用下MDA-MB-231細(xì)胞存活率Figure 1 Viability of MDA-MB-231 cells after different concentration of RSV treatment

2.2 綠色熒光觀察

POLD1-NC及POLD1-OE細(xì)胞株在普通顯微鏡下可見細(xì)胞輪廓突起于表面，熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，帶綠色熒光的細(xì)胞比例超過90%，證實(shí)90%以上的MDA-MB-231細(xì)胞株皆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染POLD1-NC或POLD1-OE，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后GFP表達(dá)量 (×100)Figure 2 GFP expression in MDA-MB-231 cells after lentiviral transfection observed under fluorescence microscope (×100)

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證POLD1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞效率

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Ctrl組與POLD1-NC組細(xì)胞中POLD1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.954）；而POLD1-OE組細(xì)胞中的POLD1 mRNA表達(dá)水平顯著高于Ctrl組和POLD1-NC組（均P＜0.001），見圖3。

圖3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的POLD1 mRNA含量Figure 3 mRNA expression level of POLD1 tested by qRTPCR after transfection

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

相對(duì)于POLD1-NC組，RSV+POLD1-NC組及RSV+POLD1-OE組的POLD1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P=0.003;P=0.013）；相對(duì)于RSV+POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中的POLD1表達(dá)水平更高（P=0.007），見圖4。

圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中POLD1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平Figure 4 Protein expression levels of POLD1,E-Cadherin,N-Cadherin and Vimentin in each group detected by Western blot

RSV 刺激后，各組E-Cadherin 的蛋白表達(dá)顯著升高（均P＜0.001），N-Cadherin及Vimentin可觀察到降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.136;P=0.060）。相對(duì)于RSV+POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中E-Cadherin表達(dá)則顯著降低（P＜0.001），N-Cadherin及Vimentin可觀察到升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.879;P=0.054）。相對(duì)于POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中N-Cadherin及Vimentin的表達(dá)低于POLD1-NC組（P=0.002;P=0.007），下降幅度小于RSV+POLD1-NC組；E-Cadherin的蛋白表達(dá)量可觀察到升高（P＞0.001），見圖4。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，POLD1-NC組穿膜細(xì)胞為34.5±2.08個(gè)，RSV+POLD1-NC組穿膜細(xì)胞為21.75±4.99個(gè)，RSV+POLD1-OE組穿膜細(xì)胞為34.75±3.30個(gè)。RSV+POLD1-NC組與其他兩組相比穿膜細(xì)胞數(shù)明顯較少（均P=0.001），見圖5。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞侵襲能力 (×200)Figure 5 Invasion ability of MDA-MB-231 cells in each group detected by Transwell assay (×200)

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)過24 h愈合時(shí)間后POLD1-NC組愈合率為（32.03±2.02）%，RSV+POLD1-NC組愈合率為（13.43±1.53）%，RSV+POLD1-OE組愈合率為（28.35%±0.89）%，RSV+POLD1-NC組與其他兩組相比，愈合率減少（均P＜0.001），見圖6。

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合率 (×100)Figure 6 Healing rate of MDA-MB-231 cells in each group detected by cell wound scratch assay (×100)

3 討論

POLD1表達(dá)水平或活性的升高會(huì)引起腫瘤細(xì)胞大量增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]，此外其還與癌細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)。Sanefuji等[10]報(bào)道，POLD1是評(píng)估肝癌細(xì)胞活性及侵襲能力的重要指標(biāo)之一，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞血管侵犯的程度相關(guān)。Sigurdson等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，過度的POLD1表達(dá)會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)POLD1不僅在乳腺癌組織中高表達(dá)[4]，且高表達(dá)的POLD1還常與更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更差的預(yù)后關(guān)系密切（P＜0.05）[12]。同時(shí)POLD1還參與了乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)過程，沉默乳腺癌細(xì)胞中POLD1的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移侵襲能力[13]。此外POLD1還被發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，POLD1表達(dá)的異?？梢鸺?xì)胞耐藥性增強(qiáng)，敲除POLD1表達(dá)后細(xì)胞的藥敏性可恢復(fù)至正常水平[14]。

EMT被認(rèn)為是評(píng)價(jià)耐藥性的指標(biāo)之一，其機(jī)制與EMT癌細(xì)胞具有部分腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）的特性、耐藥通路激活[15]、高表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子（ATP-binding cassette,ABC）蛋白加速了藥物的外流[16]有關(guān)。故而，如何靶向抑制細(xì)胞的EMT狀態(tài)從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性成為了一些學(xué)者的關(guān)注重點(diǎn)。RSV對(duì)癌細(xì)胞EMT的抑制或逆轉(zhuǎn)已被廣泛證實(shí)[17]，此外還被證實(shí)可以通過抑制EMT從而逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[18-19]，因此也被當(dāng)做是一種抑癌治療的增敏劑。

本研究也發(fā)現(xiàn)RSV 能夠顯著抑制MDAMB-231 細(xì)胞的侵襲遷移能力，同時(shí)下調(diào)N-Cadherin及Vimentin的表達(dá)，上調(diào)E-Cadherin的表達(dá)，再次驗(yàn)證了RSV對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT的抑制作用。同時(shí)我們還首次發(fā)現(xiàn)了RSV對(duì)POLD1蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用。如前所述，POLD1與乳腺癌EMT關(guān)系密切，然而POLD1在RSV抑制EMT過程中的作用尚不明確。既往文獻(xiàn)提示RSV的重要靶點(diǎn)P53是調(diào)控POLD1表達(dá)的上游因子，而P53是調(diào)控POLD1啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵上游，據(jù)此我們可以推測(cè)RSV可能主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控POLD1表達(dá)。本研究使用慢病毒構(gòu)建異位表達(dá)POLD1的MDA-MB-231細(xì)胞株，使細(xì)胞在RSV刺激下依然能保持POLD1的表達(dá)水平，模擬POLD1上游因子調(diào)控失常的效果。隨后發(fā)現(xiàn)，RSV對(duì)POLD1-OE細(xì)胞的侵襲遷移能力及EMT水平的抑制作用顯著弱于對(duì)正常的MDA-MB-231細(xì)胞，說明下調(diào)POLD1可能是RSV抑制MDAMB-231細(xì)胞EMT的關(guān)鍵機(jī)制之一。

綜上所述，RSV對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有殺傷作用，并可能通過下調(diào)POLD1的表達(dá)進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的EMT過程。此外我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的POLD1可以在一定程度上拮抗RSV對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT的抑制作用，因此我們推斷POLD1可能是調(diào)控MDAMB-231細(xì)胞EMT過程的關(guān)鍵通路之一。由于EMT調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的錯(cuò)綜復(fù)雜，故本研究還存在一定的局限性，因此，本課題組將進(jìn)一步探索RSV對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞EMT過程的作用機(jī)制，為臨床研發(fā)抗癌新藥和治療靶點(diǎn)提供新的思路。