穩(wěn)定性同位素及礦物元素指紋組合技術(shù)溯源不同產(chǎn)地牦牛肉研究

項(xiàng)洋，郝力壯，柴沙駝

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青海高原牦牛研究中心，西寧 810016)

牦牛是生活在海拔3000m以上高寒地區(qū)的特有家畜品種，牦牛肉不僅具有高蛋白、低脂肪，富含礦物元素[1]，且是公認(rèn)的無(wú)污染綠色食品[2]。隨著人們生活水平的提高，綠色有機(jī)特色食品日益受到消費(fèi)者關(guān)注和喜愛(ài)。近年來(lái)，由于畜產(chǎn)品市場(chǎng)不規(guī)范，消費(fèi)者對(duì)動(dòng)物源性食品安全越來(lái)越關(guān)注。因此，為保護(hù)牦牛這一特色畜產(chǎn)品，同時(shí)便于畜產(chǎn)品質(zhì)量安全與監(jiān)管，亟待解決產(chǎn)地溯源的技術(shù)問(wèn)題，為牦牛肉優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)提供技術(shù)支持。目前，穩(wěn)定性同位素、礦物元素溯源技術(shù)是判別食品產(chǎn)地的一項(xiàng)有效的分析手段。國(guó)內(nèi)外已有利用穩(wěn)定性同位素溯源技術(shù)對(duì)羊肉[3] [4]、牛肉[5]、羅非魚(yú)[6]、雞肉[7]等溯源的相關(guān)研究報(bào)道，也有利用礦物元素溯源技術(shù)對(duì)羊肉[8] [9]、經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[10]、茶葉[11，12]、谷物[13]、葡萄酒[14，15]、咖啡[16]、橄欖油[17]、蜂蜜[18]等進(jìn)行了溯源研究，但兩種技術(shù)相結(jié)合溯源牦牛肉的研究未見(jiàn)報(bào)道。

由于動(dòng)物源性食品生長(zhǎng)環(huán)境多變，單一的溯源技術(shù)判別率受到飼喂方式、海拔高度、土壤環(huán)境等影響，研究復(fù)合溯源技術(shù)判別率為動(dòng)物性食品溯源提供了選擇。本研究將采用穩(wěn)定性同位素和礦物元素組合技術(shù)分析，探索不同地域來(lái)源牦牛肉樣品更為有效的溯源指標(biāo)及方法，為復(fù)合溯源技術(shù)在牦牛肉上的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

分別從青海省大通縣、青海省河南縣、四川省紅原縣、四川省九龍縣4個(gè)牦牛肉主產(chǎn)地各隨機(jī)采集10頭3～5歲公牦牛背最長(zhǎng)肌(10～14肋骨間)樣品500g，放入自封袋在-20℃冰箱中冷凍保存。

石油醚(60℃～90℃沸程)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BV3級(jí)濃硝酸，購(gòu)自北京化學(xué)試劑研究所；BV3級(jí)雙氧水，購(gòu)自北京化學(xué)試劑研究所；內(nèi)標(biāo)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 儀器設(shè)備

TB-4002型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī)(Christ公司)；QM-3SP2型行星式球磨儀(南京大學(xué)儀器廠(chǎng))；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；2050 Soxtec型自動(dòng)索氏提取儀(丹麥Foss公司)；vario PYRO cube元素分析儀(德國(guó)Elementar公司)；IsoPrime100穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(英國(guó)Isoprime公司)；Mars 240/50微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；Agilent 7700x ICP-MS(美國(guó)Agilent公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

1.3.1.1冷凍干燥 將樣品切成1cm3小丁，平鋪在托盤(pán)中冷凍干燥48h，取出后放入干燥器中保存。其中，真空冷凍干燥機(jī)冷限溫度≤-62℃，真空度≤10Pa，相對(duì)濕度≤70%。

1.3.1.2粉碎 將凍干樣品放入行星式球磨機(jī)中粉碎1h。其中，行星式球磨儀公轉(zhuǎn)頻率為44HZ，轉(zhuǎn)速為290r/min，自轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為580r/min。

1.3.1.3脫脂 稱(chēng)取2～3g粉碎好的牦牛肉樣品，放在全自動(dòng)索氏提取儀中，加入70mL的石油醚(沸程為60℃～90℃)。165℃浸泡30min，淋洗1h，溶劑回收10min，完成以上三步后將樣品取出，此時(shí)為脫脂牛肉樣品及粗脂肪樣品，備用[19]。

1.3.2穩(wěn)定性碳、氮同位素比率檢測(cè) 稱(chēng)取2～4mg樣品放入錫箔杯中，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀，在其內(nèi)燃燒并還原轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2，CO2再經(jīng)過(guò)稀釋器稀釋?zhuān)詈筮M(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。具體工作參數(shù)如下：

元素分析儀條件：燃燒爐溫度為1020℃，還原爐溫度為600℃，載氣He流量為230 mL/min。

稀釋儀條件：He稀釋壓力為4bar，CO2參考?xì)鈮毫?bar，N2參考?xì)鈮毫?bar。

質(zhì)譜儀條件：用USGS24(δ13CPDB=-16‰)標(biāo)定鋼瓶CO2參考?xì)?，采用兩點(diǎn)校正，用USGS24和IAEA600(δ13CPDB=-27.5‰)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正；用IAEA N1(δ15Nair=0.4‰)標(biāo)定鋼瓶N2參考?xì)?，用IAEA N1和USGS43(δ14Nair=8.44‰)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。

穩(wěn)定性碳、氮同位素比率分別以δ13C‰，δ15N‰表示，其中，穩(wěn)定性碳同位素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為V-PDB，穩(wěn)定性氮同位素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為空氣(Air)。

1.3.3穩(wěn)定性氫同位素比率檢測(cè) 稱(chēng)取0.3mg樣品裝入銀杯(6mm×4mm)，平衡72h，并按順序放入120位自動(dòng)進(jìn)樣器中，利用自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品送入元素分析儀，高溫裂解生成CO和H2，最后進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。具體的工作參數(shù)如下：

樣品裂解溫度為1450℃，He載氣流速為120 mL.min-1，H2參考?xì)鈮毫?bar；

穩(wěn)定性氫同位素比率以δ2H‰表示，其中，穩(wěn)定性氫同位素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為V-Smow；

穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素測(cè)定結(jié)果的計(jì)算為：δ‰=(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1)×1000，式中，R代表標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品中輕重同位素與輕同位素的豐度比，即分別為13C/12C，15N/14N，2H/1H。

1.3.4礦物元素檢測(cè) 稱(chēng)取0.2g左右的牦牛肉粉樣品，置于潔凈的消解管中，加入6mL BV3級(jí)濃硝酸預(yù)消解1h，之后加入2mL BV3級(jí)雙氧水預(yù)消解0.5h，放入微波消解儀中進(jìn)行消解。

1.3.4.1微波消解條件 微波在8min內(nèi)從0℃增加至120℃，在此條件下保持2min；5min內(nèi)從120℃增加至160℃，在此條件下保持5min；5min內(nèi)從160℃增加至180℃，在此條件下保持15min。消解后用超純水定容至100mL。

1.3.4.2將定容好的樣品用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)ICP-MS自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)：樣品快速提升2mL/min(0.5rps)40s；分析前穩(wěn)定0.4rps 30s；多元素同時(shí)分析0.1rps；ICP-MS定量分析模式：He氣模式，單位質(zhì)量數(shù)采集數(shù)采集點(diǎn)數(shù)為3，數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)為3次，積分時(shí)間As為1s，Se、Cd為2s，Pb為3s，其他元素為0.3s；ICP-MS具體工作參數(shù)：射頻功率為1600W，載氣流速為1.0L/min，蠕動(dòng)泵流速0.1rps，霧化室溫度為2℃，氧化物指標(biāo)為0.45%，雙電荷指標(biāo)為1.01%；使用外標(biāo)法進(jìn)行定量。采用Ge、In、Bi等多元素混合作為內(nèi)標(biāo)，其中Ge(72)作為質(zhì)量數(shù)9～89各元素內(nèi)標(biāo)；In(115)作為質(zhì)量數(shù)95～159各元素內(nèi)標(biāo)；Bi(209)作為質(zhì)量數(shù)163～238各元素內(nèi)標(biāo)。當(dāng)內(nèi)標(biāo)元素RSD值大于3%時(shí)，樣品需重新測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s多重比較，獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，進(jìn)行判別分析、主成分分析和聚類(lèi)分析。判別分析采用逐步判別分析，先驗(yàn)概率選擇“根據(jù)組樣品數(shù)計(jì)算”。聚類(lèi)分析采用系統(tǒng)聚類(lèi)，其中聚類(lèi)距離為歐式距離，聚類(lèi)方法采用離平方和法。

表1 不同地域間牦牛肉中穩(wěn)定性同位素組成差異分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域間牦牛肉中穩(wěn)定性同位素組成差異分析

通過(guò)使用IRMS測(cè)得河南縣、大通縣、紅原縣及九龍縣4個(gè)縣牦牛肉中的δ13C值，結(jié)果如表1所示。由表1可知，4個(gè)地域間牦牛肉中的δ13C的平均值由大到小依次為：河南縣>紅原縣>九龍縣>大通縣。通過(guò)Duncan法多重比較發(fā)現(xiàn)紅原縣與其他3縣有顯著差異(P<0.05)，但九龍縣與青海省兩縣無(wú)顯著差異。四川兩縣樣品的變異系數(shù)均大于青海兩縣，說(shuō)明青海的數(shù)據(jù)分布較四川兩縣均勻。

4個(gè)地域間牦牛肉中δ15N的平均值由大到小依次為大通縣>紅原縣>九龍縣>河南縣。經(jīng)Duncan法多重比較可看出大通縣、紅原縣無(wú)顯著差異(P>0.05)，河南縣、九龍縣無(wú)顯著差異(P>0.05)，但大通縣、紅原縣與河南縣、九龍縣有顯著差異(P<0.05)。通過(guò)變異系數(shù)可看出青海省大通縣變異系數(shù)最小。

4個(gè)地域間牦牛肉中δ2H的平均值由大到小依次為大通縣>河南縣>紅原縣>九龍縣。4個(gè)地區(qū)間差異顯著(P<0.05)。四川省九龍縣變異系數(shù)較大可能是其中有兩個(gè)樣品數(shù)值與其他樣品相差較大而造成?？傮w而言，4個(gè)縣中青海省的兩個(gè)縣變異系數(shù)由大到小排序順序相一致，四川省則有所不同。

2.2 不同地域間牦牛肉中礦物元素組成差異分析

對(duì)3個(gè)地域牦牛肉樣品中的50余種礦物元素進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單個(gè)樣品K-S檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，大部分礦物元素不服從正態(tài)分布。利用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)得出Na、Fe、As、Se、Mo、Cd、Cs、Ti 8種礦物元素存在顯著差異(p<0.05)。大通縣除礦物元素Cs低于四川兩縣，其余礦物元素均高于其他3縣。礦物元素Na、Fe由大到小排序均為大通縣>紅原縣>九龍縣>河南縣；礦物元素Se、Mo由大到小排序均為大通縣>河南縣>紅原縣>九龍縣；礦物元素Cd由大到小排序均為大通縣、九龍縣>河南縣、紅原縣。礦物元素Cs由大到小排序均為紅原縣>九龍縣>大通縣>河南縣；礦物元素Ti由大到小排序均為大通縣>河南縣、紅原縣、九龍縣。紅原縣大部分礦物元素的變異系數(shù)大于其他3縣，說(shuō)明紅原縣采樣較不均勻。

表2 不同地域牦牛肉樣品中礦物元素組成

2.3 主成分分析

從牦牛肉樣品中篩選出的δ13C、δ15N、δ2H三種穩(wěn)定性同位素指標(biāo)和Na、Fe、As、Se、Mo、Cd、Cs、Ti8種礦物元素指標(biāo)做主成分分析，結(jié)果表明，前3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為68.451%，礦物元素Na、Fe是第一主成分主要包含的信息，占方差貢獻(xiàn)率的36.048%；穩(wěn)定性氮、氫同位素和礦物元素Ti是第二主成分主要包含的信息，占方差貢獻(xiàn)率的19.876%；穩(wěn)定性碳同位素是第三主成分主要包含的信息，占方差貢獻(xiàn)率的13.221%。

利用前3個(gè)主成分標(biāo)準(zhǔn)化得分做散點(diǎn)圖，大通縣樣品和九龍縣大部分樣品分別位于第二主成分的正、負(fù)兩側(cè)；河南縣的樣品較為集中，紅原縣的樣品較為分散，但總體來(lái)說(shuō)，以上提取的主成分可將4個(gè)縣的樣品完全區(qū)分開(kāi)。

表3 主成分的特征向量及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

圖1 牦牛肉樣品主成分標(biāo)準(zhǔn)化得分圖

2.4 聚類(lèi)分析

在距離為5的位置將樹(shù)切斷，可將其分為5類(lèi)。第一類(lèi)大部分為大通縣樣品，占樣品總數(shù)量的90%，其中含有紅原縣樣品1個(gè)；第二類(lèi)全部為紅原縣樣品，占樣品總數(shù)量的50%；第三類(lèi)樣品主要是九龍縣樣品，占樣品總數(shù)量的80%，其中還包括3個(gè)紅原縣樣品；第四類(lèi)包含4個(gè)縣的樣品，河南縣的樣品數(shù)量最多；第五類(lèi)全部是河南縣樣品，占樣品總數(shù)量的70%。

圖 2 牦牛肉聚類(lèi)分析圖(1.河南縣;2.大通縣;3.紅原縣;4.九龍縣)

2.5 判別分析

為了進(jìn)一步證實(shí)同位素指標(biāo)與礦物元素指標(biāo)結(jié)合對(duì)牦牛肉產(chǎn)地判別的可行性，對(duì)地域間差異顯著的同位素及礦物元素進(jìn)行判別分析。先后有穩(wěn)定性碳同位素、穩(wěn)定性氫同位素、礦物元素Ti 3種指標(biāo)引入判別模型中，并建立如下的判別模型：

Y河南縣=-5170.804-427.879δ13C-

0.401δ2H+40486.142Ti

Y大通縣=-5348.870-435.115δ13C-

0.374δ2H+44043.218Ti

Y紅原縣=-5393.637-436.267δ13C-

0.543δ2H+41929.526Ti

Y九龍縣=-5208.884-427.786δ13C-

0.693δ2H+41771.548Ti

對(duì)3種同位素和八種礦物元素進(jìn)行判別分析結(jié)果如下，4個(gè)縣中除了大通縣的交叉驗(yàn)證判別率較整體正確判別率有所下降，其余縣都未發(fā)生變化。其中，河南縣判別率最高；大通縣有兩個(gè)樣品被錯(cuò)判到河南縣；紅原縣和九龍縣整體正確判別率和交叉驗(yàn)證判別率都為80%，紅原縣樣品被錯(cuò)判到河南縣和九龍縣；九龍縣樣品被錯(cuò)判到青海省兩縣，但總的來(lái)說(shuō)整體判別效果較好，總的交叉驗(yàn)證判別率只略低于整體正確判別率的2.5%。

3 討論

由于環(huán)境因素影響最終會(huì)使動(dòng)物組織中穩(wěn)定性同位素含量有所不同，因此使用IRMS鑒定肉類(lèi)來(lái)源已得到認(rèn)可。穩(wěn)定性碳和氮同位素已成功對(duì)中國(guó)不同地區(qū)的牛肉進(jìn)行了分類(lèi)[20]。有研究表明，在巴塔哥尼亞南部廣闊草原地區(qū)生長(zhǎng)的草中礦物質(zhì)含量受環(huán)境和地域差異的影響[21]，肉中礦物元素組成受環(huán)境(水、食物)[8]及成土母質(zhì)的影響。因此，由于環(huán)境的影響不同地域來(lái)源的牦牛肉樣品中礦物元素含量也有所差異。本研究也表明，青藏高原四個(gè)地區(qū)的牦牛肉中穩(wěn)定性同位素、礦物質(zhì)元素含量因其地理起源而有所不同。

表4 牦牛肉產(chǎn)地的正確判別率

由于地理分布、土壤形成和氣候差異很大，因此可以在廣闊的地理區(qū)域(即不同的國(guó)家)中區(qū)分肉類(lèi)來(lái)源。先前已經(jīng)證明了使用穩(wěn)定性同位素或礦物元素溯源技術(shù)可以對(duì)不同來(lái)源的肉進(jìn)行分類(lèi)，例如可以用于牛肉[5]、羊肉[3,4,8]、家禽[7]和豬肉[22]，該技術(shù)可將肉追溯到不同省份或國(guó)家。本研究結(jié)果表明，使用穩(wěn)定性同位素和礦物元素組合技術(shù)可將牦牛肉的來(lái)源在較小范圍內(nèi)進(jìn)行區(qū)分，即在相同省內(nèi)不同區(qū)縣之間。不同地域牦牛肉樣品按其來(lái)源分類(lèi)的整體正確判別率為85%，交叉驗(yàn)證判別率較整體正確判別率僅低2.5%。盡管本研究的樣本量較小，但PCA和LDA能夠清楚識(shí)別來(lái)自不同來(lái)源的牦牛樣本，為使用穩(wěn)定性同位素與礦物元素組合鑒定牦牛肉來(lái)源提供了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)牦牛肉可以根據(jù)其地理來(lái)源使用穩(wěn)定性同位素及礦物元素組合技術(shù)進(jìn)行認(rèn)證。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析從3種穩(wěn)定性同位素及50多種礦物中篩選了δ13C、δ2H、Ti 3種元素，并建立了牦牛肉可追溯性的判別模型。多元統(tǒng)計(jì)分析得出的總體正確分類(lèi)率為85%，交叉驗(yàn)證率為82.5%，判別效果較理想。