牡蠣肽對(duì)TM3細(xì)胞性功能的影響

方 磊，張瑞雪，陳 亮，張海欣，賈福懷，晏永球，谷瑞增，魏 穎*

（1 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015 2 寧波御坊堂生物科技有限公司 浙江寧波315012）

隨著生活水平的提高，男性生殖健康的問題也越來越引起人們的關(guān)注[1]。牡蠣屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科，是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣不僅含有豐富的糖原、蛋白質(zhì)、人體必需的8 種氨基酸以及維生素，還富含鋅、硒、鐵、銅、碘等微量元素，尤其是含有豐富的?；撬醄2-3]?！侗静菥V目》記載：牡蠣肉“多食之，能細(xì)括皮膚，補(bǔ)腎壯陽，并能治虛，解丹毒”。牡蠣中含有非常豐富的鋅元素和精氨酸，鋅元素能夠維持男性生殖健康，而且還能有效改善前列腺肥大等男性疾?。痪彼崾蔷雍铣傻谋匦璩煞?，常吃富含精氨酸的食品有助于補(bǔ)腎益精。食源性低聚肽是目前研究的熱點(diǎn)方向，而牡蠣肽就是其中最為重要的一種。牡蠣肽的生產(chǎn)技術(shù)成熟，且其分子質(zhì)量、氨基酸等成分明確。目前關(guān)于牡蠣促進(jìn)男性性功能方面的研究?jī)?nèi)容較少。本文以牡蠣全粉、牡蠣肽為研究對(duì)象，體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3），研究其對(duì)TM3 細(xì)胞合成和分泌睪酮、二氫睪酮、NO、SOD 酶活及cGMP 等影響，為開發(fā)利用牡蠣奠定基礎(chǔ)，也為其應(yīng)用于相應(yīng)保健食品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3 細(xì)胞），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO 公司；胎牛血清，杭州四季青公司；NO 測(cè)定試劑盒、SOD 測(cè)定試劑盒、睪酮測(cè)定試劑盒、二氫睪酮測(cè)定試劑盒、cGMP 測(cè)定試劑盒，美國(guó)Enzo 公司；西地那非，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53 型倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；SpectraMaxR iD5 型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；Accuri C6 型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 生物科學(xué)儀器及軟件公司；L-8900日立全自動(dòng)氨基酸分析儀，天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；3K-15 型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣全粉、牡蠣肽的制備

1）牡蠣全粉的制備 牡蠣全粉按以下工藝流程制備：牡蠣肉-勻漿-酶解-陶瓷膜過濾-濃縮-活性炭過濾-噴霧干燥-牡蠣全粉。

2）牡蠣肽的制備 牡蠣肽按以下工藝流程制備：牡蠣肉-勻漿-水洗-酶解-陶瓷膜過濾-濃縮-活性炭過濾-噴霧干燥-牡蠣肽。

1.3.2 氨基酸組成分析 依據(jù)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[4]方法，采用L-8900日立全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)牡蠣全粉、牡蠣肽中的氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 分子質(zhì)量分布測(cè)定 將樣品用流動(dòng)相溶解后并經(jīng)孔徑0.2 μm 聚四氟乙烯過濾膜過濾，然后通過高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.4 TM3 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有5% HS、2.5%FBS 的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2及充分飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TM3 細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的實(shí)際情況，2～3 d 換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)至培養(yǎng)皿的80%左右時(shí)，棄掉培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞2～3 次，加入適量室溫復(fù)溫的0.05%胰酶消化液，按照1∶3 傳代培養(yǎng)。3 次傳代后取處于對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3.5 試驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組、牡蠣全粉試驗(yàn)組及牡蠣肽試驗(yàn)組，其中試驗(yàn)組作用質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，8，10 mg/mL。在保證牡蠣肽總量一定的情況下，為考察不同加樣時(shí)間對(duì)TM3 細(xì)胞的影響，又將0.4 mg 牡蠣全粉或牡蠣肽分2 次加樣（每12 h 加1 次）即每次添加0.2 mg。

1.3.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率按1.3.4 節(jié)方法消化后將細(xì)胞密度稀釋為1×105 個(gè)/mL，將細(xì)胞加入96 孔板中（100 μL/孔）。24 h 觀察到細(xì)胞均勻貼壁后，棄掉上清液，加入PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞2～3 次，分別用含有不同質(zhì)量濃度牡蠣肽或牡蠣全粉的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，不加樣品的孔設(shè)為正常對(duì)照組，同一塊96 孔板，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)置4 復(fù)孔，24 h 后棄細(xì)胞上清液，再用PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞2～3 次，然后每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL），37℃繼續(xù)孵育4 h，小心去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入100 μL DMSO 溶液，震蕩10 min 使結(jié)晶物溶解。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光值。細(xì)胞存活率（%）=OD 試驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100。

1.3.7 檢測(cè)指標(biāo)與方法 取細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本，NO、睪酮、二氫睪酮、cGMP 含量參照美國(guó)Enzo 公司提供的試劑盒說明書對(duì)其進(jìn)行定量；SOD活性參照美國(guó)Enzo 公司提供的試劑盒說明書對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)，P＜0.05，證明數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽的氨基酸組成

牡蠣全粉、牡蠣肽的氨基酸組成和含量見表1和2。牡蠣全粉、牡蠣肽的氨基酸總量分別為42.669%和54.977%，其中牡蠣全粉、牡蠣肽中均含有人體必需的7 種氨基酸（不含色氨酸）和2 種半必需氨基酸（組氨酸和精氨酸），牡蠣肽的氨基酸含量要高于牡蠣全粉，其精氨酸含量是牡蠣全粉的6.64 倍，精氨酸是精子形成的重要因素，常吃富含精氨酸的食品有助于補(bǔ)腎益精。牡蠣肽含有多種氨基酸且含量豐富，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人體補(bǔ)充必需氨基酸的重要來源。

表1 牡蠣全粉的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of oyster whole powder

表2 牡蠣肽的氨基酸含量Table 2 The amino acid content of oyster peptide

2.2 牡蠣全粉、牡蠣肽的分子質(zhì)量分布

牡蠣全粉、牡蠣肽的分子質(zhì)量分布通過高效液相凝膠色譜測(cè)定，得到分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖和分子質(zhì)量分布情況，見圖1和表3。牡蠣全粉和牡蠣肽的分子質(zhì)量主要集中在1 000 u 以下，其含量分別高達(dá)86.6146%和92.1264%，而牡蠣肽小于1 000 u 的占比要高于牡蠣全粉的占比，說明牡蠣肽中含有更多的小分子肽混合物。研究表明肽的吸收速率與其相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 u 的大多數(shù)是二肽、三肽等[5]，因二肽、三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收存在獨(dú)立的系統(tǒng)以及相應(yīng)的載體，所以肽比蛋白質(zhì)和游離氨基酸的吸收效率快，消耗能量低，可以推斷出牡蠣肽具有良好的吸收效率。

圖1 牡蠣全粉和牡蠣肽凝膠色譜圖Fig.1 Gel chromatogram of oyster powder and oyster peptide

表3 牡蠣全粉和牡蠣肽分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular distribution of oyster whole powder and oyster peptide

2.3 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞存活率的影響

為檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的牡蠣全粉及牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響，設(shè)置系列質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，8，10 mg/mL 的樣品作用于TM3 細(xì)胞，并通過MTT 法確定樣品的最適作用質(zhì)量濃度。由圖2可知，與未加入樣品的對(duì)照組相比，當(dāng)牡蠣全粉質(zhì)量濃度在0.1～1 mg/mL 范圍時(shí)對(duì)TM3 細(xì)胞的存活率無顯著影響（P＞0.05）；當(dāng)牡蠣全粉質(zhì)濃度在2～10 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)對(duì)細(xì)胞的活性具有抑制作用，且具有濃度依賴性。牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響與牡蠣全粉呈相同趨勢(shì)，為了保證后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，樣品的加樣質(zhì)量濃度應(yīng)在無毒性質(zhì)量濃度以下。因此，選取牡蠣全粉、牡蠣肽的加樣質(zhì)量濃度為0.1，0.4，1 mg/mL。

圖2 牡蠣全粉和牡蠣肽對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on cell survival rate

2.4 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞睪酮分泌的影響

用不同質(zhì)量濃度的牡蠣全粉、牡蠣肽處理TM3 細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞的上清培養(yǎng)基用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞分泌的睪酮含量。與對(duì)照組相比，牡蠣全粉、牡蠣肽處理顯著增加TM3 細(xì)胞的睪酮分泌量（P＜0.05），具有濃度依賴性，而且牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞睪酮分泌的促進(jìn)作用要高于牡蠣全粉，可能是因?yàn)槟迪犽暮懈嗟男》肿踊旌想?，利于?xì)胞的吸收利用，使得細(xì)胞睪酮分泌量更高。此外，當(dāng)牡蠣肽質(zhì)濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)TM3細(xì)胞分泌睪酮的促進(jìn)作用要高于陽性對(duì)照西地那非（0.2 mg/mL），表明牡蠣肽確實(shí)具有促進(jìn)TM3 細(xì)胞分泌睪酮的作用。

2.5 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 胞分泌二氫睪酮的影響

如圖4所示，對(duì)照組TM3 細(xì)胞的二氫睪酮含量明顯低于經(jīng)牡蠣全粉、牡蠣肽處理的TM3 細(xì)胞二氫睪酮含量（P＜0.05），且相同質(zhì)量濃度的牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞分泌二氫睪酮的促進(jìn)作用要高于牡蠣全粉。與對(duì)照組相比，牡蠣肽終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，TM3 細(xì)胞中睪酮的含量升高了近5 倍，與陽性對(duì)照西地那非（0.2 mg/mL）對(duì)TM3 細(xì)胞的促進(jìn)作用相近，表明牡蠣肽能夠促進(jìn)和改善睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌二氫睪酮。二氫睪酮是由睪酮與體內(nèi)的5α還原酶發(fā)生反應(yīng)后生成的一種雄性激素，2.4 節(jié)已經(jīng)表明牡蠣肽能夠顯著增強(qiáng)TM3 細(xì)胞中睪酮的含量，該結(jié)果與上述結(jié)果趨勢(shì)相一致。

2.6 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞NO 含量的影響

NO 是一種脂溶性小分子，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，體內(nèi)在一氧化氮合酶的催化反應(yīng)下產(chǎn)生，在體內(nèi)可以引起血管的擴(kuò)張[6]。由圖5可知，與對(duì)照組TM3 細(xì)胞比較，陽性西地那非組、牡蠣全粉、牡蠣肽組TM3 細(xì)胞NO 含量均顯著地增加（P＜0.05），且牡蠣肽的促進(jìn)作用要高于牡蠣全粉。

2.7 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞cGMP 含量的影響

TM3 細(xì)胞cGMP 含量通過直接ELISA 法測(cè)定，并以西地那非作為陽性對(duì)照。從圖6可知，與空白對(duì)照相比，牡蠣全粉、牡蠣肽能顯著提高TM3細(xì)胞cGMP 的含量，并且隨質(zhì)量濃度的增加其作用效果越強(qiáng)，尤其是牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞的促進(jìn)作用最為明顯。

2.8 牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞SOD 酶活力的影響

為評(píng)價(jià)TM3 細(xì)胞氧化環(huán)境，牡蠣全粉、牡蠣肽作用TM3 細(xì)胞24 h 后，對(duì)TM3 細(xì)胞SOD 酶活力進(jìn)行了測(cè)定。由圖7可知，樣品組細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力與對(duì)照組相比顯著提高（P＜0.05），高劑量組（1 mg/mL）效果要明顯優(yōu)于低劑量組（0.1 mg/mL），呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，而且牡蠣肽增強(qiáng)酶活的效果要好于牡蠣全粉。牡蠣肽處理TM3細(xì)胞后，可以顯著增強(qiáng)SOD 的酶活力，使細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境有助于睪酮、二氫睪酮等雄性激素的生成。

圖3 牡蠣全粉和牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞睪酮分泌量的影響Fig.3 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on testosterone secretion in TM3 cells

圖4 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞二氫睪酮分泌量的影響Fig.4 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on the secretion of dihydrotestosterone in TM3 cells

圖5 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞NO 含量的影響Fig.5 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on NO content in TM3 cells

圖6 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞cGMP 含量的影響Fig.6 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on cGMP content in TM3 cells

2.9 不同加樣時(shí)間對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響

綜上可知，牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞的促進(jìn)作用要高于牡蠣全粉。在保證加樣總量相等的情況下，進(jìn)一步考察不同的加樣時(shí)間對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響，牡蠣肽質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)在24 h 加樣1 次與濃度為0.2 mg/mL 時(shí)在24 h 內(nèi)加樣2 次均能顯著提高TM3 細(xì)胞內(nèi)的睪酮、二氫睪酮、NO、cGMP 含量，顯著增強(qiáng)TM3 細(xì)胞SOD 酶活力，然而等量的牡蠣肽，24 h 內(nèi)加樣2 次對(duì)TM3細(xì)胞活性的影響要比加樣1 次更加顯著，可能是因?yàn)? 次加樣更有利于TM3 細(xì)胞吸收利用牡蠣肽，所以TM3 細(xì)胞分泌的雄性激素較多，SOD 酶活力更高。

圖7 牡蠣全粉、牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞SOD 酶活力的影響Fig.7 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on SOD activity of TM3 cells

圖8 牡蠣肽對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響Fig.8 Effects of oyster peptide on the activity of TM3 cells

牡蠣肽是經(jīng)酶解后得到的二肽或三肽混合物，其分子質(zhì)量一般在1 000 u 以下。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后形成的二肽和三肽在體內(nèi)可以不經(jīng)消化[7]，直接被人體吸收，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能[8]。牡蠣肽的酶解過程溫和，條件易于控制，其氨基酸組成豐富尤其是精氨酸含量較高，食用安全性很高，沒有任何副作用，可作為食品保健品的原料。NO 作為體內(nèi)重要的神經(jīng)介質(zhì)，可進(jìn)一步激活鳥苷酸環(huán)化酶，提高cGMP 水平，降低Ca2+含量，最后導(dǎo)致平滑肌松弛誘導(dǎo)陰莖勃起。研究中發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可以顯著地提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NO含量，這對(duì)改善性功能缺陷有很重要的意義[9]。已有研究表明，瑪咖能夠改善大鼠睪丸細(xì)胞的NOcGMP 通路，提高大鼠性功能[10]。試驗(yàn)表明牡蠣肽與陽性對(duì)照西地那非對(duì)TM3 細(xì)胞提高cGMP 含量的效果相近，牡蠣肽也能通過改善NO-cGMP通路，提高TM3 細(xì)胞cGMP 的含量。

正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境對(duì)睪丸細(xì)胞分泌雄激素（睪酮）至關(guān)重要。SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除氧自由基，減輕組織細(xì)胞的過氧化損傷，對(duì)于維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化平衡非常重要。據(jù)研究報(bào)道，大多數(shù)氨基酸都具有抗氧化活性，如賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸等，其肽的抗氧化特性與其氨基酸的組成和含量有直接的關(guān)系[11]。牡蠣全粉和牡蠣肽中的賴氨酸、亮氨酸、精氨酸含量較高，因此具有抗氧化特性，能夠顯著增強(qiáng)TM3 細(xì)胞的SOD 酶活性，提供良好的氧化環(huán)境，利于雄激素睪酮和二氫睪酮的分泌。

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)牡蠣全粉和牡蠣肽的氨基酸組成及分子質(zhì)量分布進(jìn)行了分析，并對(duì)兩者對(duì)雄激素合成的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：牡蠣肽較牡蠣全粉含有更豐富的精氨酸，而精氨酸是男性精子合成的必需成分。牡蠣肽較牡蠣全粉含有更多相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 u 的小分子肽；牡蠣肽比牡蠣全粉更顯著地促進(jìn)TM3 細(xì)胞分泌睪酮、二氫睪酮、cGMP，增加TM3 細(xì)胞NO 含量和SOD 酶活力。此外，等量的牡蠣肽在24 h 加樣2 次要比加樣1 次時(shí)對(duì)TM3 細(xì)胞活性的影響更大。本研究為牡蠣肽開發(fā)功能性食品提供了一定的理論支持。