無毒干蟾對流感病毒H1N1感染小鼠炎癥反應的影響研究?

劉 暢 曹鴻云 劉國星 程 淼 徐紅日 李 猛秦欣欣 郭雨菲 周鴻威 李雅莉 于會勇△ 王成祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；3.陜西省中醫(yī)院，陜西 西安 710003）

流行性感冒（以下簡稱流感）是流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，起病急，部分患者出現(xiàn)肺炎甚至加重發(fā)展為重癥病例而死亡［1］。嚴重流感病毒感染所致的“細胞因子風暴”與組織損傷和不良預后直接相關［2］。我國已篩選出多種具有抗流感作用的單味中藥，包括黃芩、板藍根、金銀花等［3］。研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍及其制劑對乙肝病毒［4］、艾滋病病毒［5］、柯薩奇病毒、腺病毒［6］、流感病毒［7］等感染有著良好的療效，但由于毒性較大［8］，限制了其臨床應用。無毒干蟾是在傳統(tǒng)干蟾基礎上研發(fā)的新型專利中藥，在臨床中對多種病毒感染性疾病有良好的療效，且未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。本研究以流感病毒H1N1感染C57BL/6J小鼠為模型，觀察在感染急性期，無毒干蟾對小鼠血清和肺部細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）及趨化因子CCL2、CXCL10表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量14～15 g，共32只。購自北京維通利華實驗技術有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0006，批號110011201108435131，于中國疾病預防控制中心動物房［合格證號SYXK（京）2017-0021］飼養(yǎng)。所有實驗符合中國疾病預防控制中心動物實驗倫理學規(guī)定。

1.2 病毒株 流感病毒亞洲甲型鼠肺適應株A/PR/8/34（H1N1），由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所惠贈，傳染病所免疫室保存，MDCK細胞培養(yǎng)傳代后，血凝效價為1∶128，小鼠病毒半數(shù)致死量（LD50）為1×10-2.625，噬斑試驗濃度為4.5×106PFU/mL，-80 ℃保存?zhèn)溆?。正式實驗前用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋成1.8×104PFU/mL病毒液，置于冰浴中備用。

1.3 試藥與儀器 1）藥物。無毒干蟾（貨號x1802901，批號600282972）購自北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司。磷酸奧司他韋膠囊（75mg，國藥準字H20065415，批號0221901015，宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司分裝）購自北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院門診藥房。以上實驗用藥4℃避光保存?zhèn)溆谩?）試劑。QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN GmbH公司，貨號52904，批號163014099），甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（實時熒光PCR法）（江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司，貨號CN10-4C-100，批號19100801），TRIzol Reagen［t賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號15596018，批號94204］，PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）［寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，貨號RR037A，批號 AJ91586A］，TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）［寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，貨號RR820A，批號AJG1873A］，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。Mouse Magnetic Luminex Assay（10 Plex）（R&D Systems公司，貨號 LXSAMSM-10，批 號L136156）。3）主要儀器。生物安全柜（Ⅱ級B2型）（美國NUAIRE公司，型號NU-425-600E），電子天平（瑞士METTLER公司，型號PB153-S/FACT），高通量組織研磨儀（德國Qiagen公司，型號TissuelyserⅡ），小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5424R），正置白光拍照顯微鏡（中國尼康公司，型號Eclipse Ci-L），掃描儀［3DHISTECH（Hungary）公司，型號Pannoram?ic250］，分光光度計（美國Thermo Nanodrop公司，型號ND-1000），實時熒光定量PCR儀（新加坡Applied Bio?systems B.V公司，型號7500FAST），Luminex液相芯片分析系統(tǒng)（Luminex公司，型號X-200）。

1.4 分組與造模 實驗設空白組、模型組、奧司他韋組、無毒干蟾組，每組8只小鼠。實驗動物適應性飼養(yǎng)7 d后稱定體質(zhì)量。除空白組動物外，其余動物按照文獻中方法建立甲型流感病毒肺部感染模型［9］。腹腔注射10%水合氯醛（0.1 mL/10 g體質(zhì)量）輕度麻醉小鼠后，每只小鼠鼻孔內(nèi)均勻滴入流感病毒液0.02 mL，建立模型。空白組動物隔離飼養(yǎng)在同等條件下的房間，并按同樣方法鼻腔接種PBS溶液0.02 mL。

1.5 干預方法 參考文獻［10］按直接折算法計算小鼠與人的臨床等效劑量。磷酸奧司他韋的給藥劑量為19.19 mg/（kg·d），無毒干蟾的給藥劑量為感染后第1～3日予2.08 g/（kg·d），感染后第4～7日予1.04 g/（kg·d），模型組給予等量PBS。于感染后2 h開始灌胃給藥，每天1次，每次0.3 mL，連續(xù)給藥7 d。

1.6 標本采集 流感病毒感染后第7日，每組小鼠稱體質(zhì)量，輕度麻醉小鼠后取血，4℃12 000r/min離心10 min分離血清。稱取小鼠肺臟質(zhì)量，收集部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，剩余肺組織-80℃凍存。

1.7 檢測指標 1）小鼠一般情況比較：觀察各組小鼠體質(zhì)量、活動、皮毛、呼吸、飲食、大小便等情況。體質(zhì)量變化百分比（%）=第X天體質(zhì)量（g）/第0天體質(zhì)量（g）×100%。2）肺指數(shù)：稱小鼠體質(zhì)量后，取肺臟稱定質(zhì)量，計算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。3）肺組織中病毒載量：取出-80℃保存的肺組織，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取各組樣品的流感病毒RNA。PCR反應為20 μL體系，含RNA 2 μL，PCR 反應混合液17.2 μL，酶混合液 0.8 μL。反應條件：42 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，5個循環(huán)；94 ℃ 5 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。3）結(jié)腸長度：分離回結(jié)腸交界處至肛門的結(jié)直腸，測量結(jié)腸長度（cm）。4）肺組織病理變化：用4%的多聚甲醛固定肺和結(jié)腸組織、石蠟包埋、切片（4～5 μm）、蘇木素-伊紅（HE）染色后，在200倍光學顯微鏡下觀察組織病理變化。參照文獻中病理學評分標準［11］，每張載玻片隨機選取3個視野，利用雙盲法對肺組織進行病理學評分。0分：肺泡壁完好無增厚，無炎性浸潤，無充血；1分：肺泡壁輕微彌散性炎性細胞浸潤（中性粒細胞），肺泡壁無明顯增厚；2分：明顯和廣泛的炎性細胞浸潤（中性粒細胞和單核細胞），肺泡壁輕微增厚（1～2倍）；3分：嚴重的炎性細胞浸潤，個別區(qū)域肺泡壁增厚至3～5倍；4分：嚴重的炎性細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，25%～50%肺組織實質(zhì)化；5分：嚴重的炎性細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，>50%肺組織實質(zhì)化。5）RT-qPCR法檢測肺勻漿中細胞因子mRNA表達情況：取出-80℃保存的肺組織，用Trizol法提取各組樣品的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，按TB GreenTMPremix試劑說明，分別加入βactin、TNF-α、IL-1β、IL-6引物進行擴增，見表1。PCR反應為20 μL體系，含cDNA 2 μL，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，以RNase Free H2O補足至20 μL。反應條件：95 ℃ 30s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，60～95 ℃繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。6）液相芯片技術檢測血清和肺細胞因子表達：采用Luminex液相芯片技術檢測小鼠血清和肺細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ及趨化因子CCL2、CXCL10的表達，Luminex X-200儀器讀數(shù)，繪制標準曲線計算相應濃度。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，方差齊時，用LSD進行多重比較，方差不齊采用非參數(shù)因子Kruskal-Wallis秩和檢驗。兩組間比較，對于滿足正態(tài)性時，采用t檢驗，不滿足正態(tài)性時用Mann-Whitney秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及體質(zhì)量比較 見表2。空白組小鼠皮毛干爽光滑，精神狀態(tài)良好，活潑，體質(zhì)量漸增。奧司他韋組和無毒干蟾組小鼠感染初期出現(xiàn)不活潑、食欲不振、撓鼻、噴嚏、排便減少，體質(zhì)量在流感病毒滴鼻后呈先下降、后回升、再下降趨勢，但比模型組體質(zhì)量下降緩慢，并且活動量稍多，皮毛蓬松及弓背程度較輕，奧司他韋組比無毒干蟾組小鼠癥狀稍輕，體質(zhì)量下降更緩慢。

表2 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比比較（%，±s）

表2 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比比較（%，±s）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，?P<0.05，??P<0.01；與奧司他韋組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別空白組模型組奧司他韋組無毒干蟾組n 8 8 8 8第0天100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00第1天97.78±1.28 96.90±0.90 97.74±0.94 96.18±1.79#△第2天100.69±2.11 98.56±2.78#98.42±2.38 99.52±1.80第3天102.15±2.05 98.56±2.71##100.97±1.21 99.78±4.25第4天102.34±2.54 94.04±4.56##98.70±2.08*97.82±3.86#*第5天100.71±2.55 89.35±5.57##96.24±2.88##**95.00±5.96#*第6天100.82±2.87 85.12±5.91##94.50±2.98#**91.21±7.29##*第7天102.91±2.30 77.81±4.05##89.95±5.99##**82.49±5.87##*△△

2.2 各組小鼠肺指數(shù)比較 見表3。流感病毒感染后第7日，模型組的肺指數(shù)高于空白組（P<0.01）；奧司他韋組和無毒干蟾組的肺指數(shù)均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；無毒干蟾組的肺指數(shù)高于奧司他韋組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 各組小鼠肺組織病毒載量比較 見表3。模型組小鼠肺組病毒載量較正常組明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，奧司他韋組和無毒干蟾組小鼠肺組織病毒載量明顯降低（P<0.01），奧司他韋組和無毒干蟾組小鼠肺組織病毒載量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組小鼠肺指數(shù)、肺組織病毒載量比較（±s）

表3 各組小鼠肺指數(shù)、肺組織病毒載量比較（±s）

組別空白組模型組奧司他韋組無毒干蟾組n 8 8 8 8肺指數(shù)（%）0.59±0.04 1.87±0.28##1.11±0.31##**1.48±0.30##*△病毒載量（PFU）0.19±0.08 17 343.64±2328.67##3 807.44±2902.38#**6 274.80±2008.52##**

2.4 各組小鼠肺組織大體解剖觀察和病理損傷程度比較 流感病毒感染后第7日，大體解剖發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肺組織顏色粉嫩。模型組小鼠肺組織明顯變大，呈水腫樣腫脹，肺部一葉至多葉甚至整個肺部顏色暗紅。奧司他韋組和無毒干蟾組小鼠大體解剖發(fā)現(xiàn)，其肺組織水腫樣病變較模型組輕，顏色淺，奧司他韋組較無毒干蟾組病變稍輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺大體解剖觀察

流感病毒感染后第7日，觀察HE染色肺組織病理變化。正常組：肺組織未見異常，氣管和肺泡結(jié)構清晰，管腔內(nèi)無滲出物，血管無擴張充血，基本無明顯的炎性細胞浸潤。模型組：小鼠肺泡組織結(jié)構不清，部分肺泡融合擴張，部分肺泡萎陷不張，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有蛋白質(zhì)水腫液及大量炎癥細胞浸潤，肺微血管充血、出血。奧司他韋組：肺泡萎陷、融合明顯改善，肺間質(zhì)和肺泡水腫不明顯，肺泡間隔見少量纖維性滲出，肺間隔內(nèi)炎細胞滲出有一定好轉(zhuǎn)。無毒干蟾組：肺泡結(jié)構較模型組有改善，肺泡萎陷、融合，較模型組有一定好轉(zhuǎn)，炎癥細胞浸潤較少。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理損傷比較（HE染色，200倍）

2.5 各組小鼠肺組織病理學評分及結(jié)腸長度比較見表4。1）肺組織病理學評分：模型組、奧司他韋組和無毒干蟾組的病理評分較空白組不同程度升高（P<0.01）。經(jīng)藥物治療后，奧司他韋組和無毒干蟾組的病理評分較模型組不同程度下降（P<0.05或P<0.01），奧司他韋組與無毒干蟾組無顯著差異（P>0.05）。2）結(jié)腸長度：模型組、奧司他韋組和無毒干蟾組的結(jié)腸長度較空白組不同程度短縮。其中模型組與無毒干蟾組較空白組明顯縮短（P<0.05或P<0.01），而奧司他韋組的差異不明顯（P>0.05）。與模型組比較，奧司他韋組和無毒干蟾組的結(jié)腸長度較長，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。奧司他韋組和無毒干蟾組的結(jié)腸長度無明顯差異（P>0.05）。

表4 各組小鼠肺組織病理學評分及結(jié)腸長度比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織病理學評分及結(jié)腸長度比較（±s）

組別空白組模型組奧司他韋組無毒干蟾組n 8 8 8 8結(jié)腸長度（cm）6.74±0.18 5.30±0.49##6.38±0.23**6.05±0.53##**肺損傷病理評分（分）0.00±0.00 2.88±0.83##1.75±0.71##**1.88±0.64##*

2.6 各組小鼠肺組織細胞因子基因表達量比較 見表5。流感病毒感染后第7日，模型組小鼠肺組織的TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對表達量水平較正常對照組明顯升高（P<0.01）。經(jīng)過干預治療，無毒干蟾組的促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對表達量水平均出現(xiàn)不同程度地下降（P<0.01）。

表5 各組小鼠肺組織細胞因子mRNA相對表達量比較（±s）

表5 各組小鼠肺組織細胞因子mRNA相對表達量比較（±s）

組別空白組模型組奧司他韋組無毒干蟾組n 8 8 8 8 TNF-α mRNA 1.88±0.41 128.39±22.22##96.23±18.69##**75.85±12.37##**IL-1β mRNA 0.87±0.20 600.99±145.33##62.37±18.39##**18.00±5.57**IL-6 mRNA 5.39±2.00 52.70±11.50##26.88±5.23##**8.36±3.13**

2.7 各組小鼠血清和肺組織中細胞因子含量比較見表6。流感病毒感染后第7天，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、CCL2、CXCL10的水平較空白組明顯升高（P<0.01或P<0.05）。奧司他韋組和無毒干蟾組血清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和趨化因子CCL2、CXCL10的水平較模型組顯著降低（P<0.05或P<0.01），無毒干蟾組血清IFN-γ的含量與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組小鼠肺組織的TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、CXCL10的表達量較空白組明顯升高（P<0.01）。經(jīng)過干預治療，奧司他韋組和無毒干蟾組肺組織的促炎性細胞因子TNF-α、IL-6和趨化因子CCL2、CXCL10的濃度均顯著下降（P<0.05或P<0.01），無毒干蟾組細胞因子IL-10和IFN-γ的水平均較模型組顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表6 各組小鼠血清和肺組織細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表6 各組小鼠血清和肺組織細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組（n=8）模型組（n=8）奧司他韋組（n=8）無毒干蟾組（n=8）部位血清肺組織血清肺組織血清肺組織血清肺組織TNF-α 1.24±0.47 0.71±0.12 5.54±1.71##19.13±4.30##3.43±1.32##*13.60±2.41##*1.69±0.60**7.40±3.96#**IL-6 7.40±5.75 63.65±17.78 236.99±68.77##610.04±96.79##73.10±58.42**222.68±133.94#**25.47±16.82**426.23±30.16##*△IL-10 4.91±1.91 20.86±15.62 17.69±4.13##73.19±27.54##12.90±2.06##*62.48±13.33##11.29±0.93##*18.14±3.87**△IFN-γ 3.55±1.48 15.54±4.19 114.08±59.55#290.15±125.06##242.86±90.32##*441.28±171.49##77.44±59.31△△82.81±35.82*△△CCL2 117.39±21.25 150.69±10.10 223.12±39.31##8 572.67±2 084.47##162.82±46.12#**4 828.70±1 518.41##**130.50±15.64**3 103.33±362.69#**CXCL10 26.84±10.43 22.99±7.08 569.78±146.64##8 089.89±2 938.30##322.07±95.07##**5 127.50±4 437.46##*151.45±96.23**△2 201.67±402.21##**△

3 討 論

流感病毒肺炎屬于中醫(yī)學“溫病”范疇，中醫(yī)藥防治流感已有數(shù)千年歷史。蟾蜍是一種藥用價值很高的動物，蟾酥、干蟾皮、蟾衣等均是藥材。研究發(fā)現(xiàn)，蟾酥注射液對疑似甲型H1N1流感高熱患者具有良好的退熱效果，顯效率達90%［9］。蟾苷提取物能明顯降低流感病毒感染小鼠肺指數(shù)、抑制肺內(nèi)病毒繁殖［12］。蟾毒內(nèi)酯對流感病毒FM1具有直接滅活作用，對流感病毒感染小鼠肺組織具有修復和保護作用［13］。本課題組前期對含有蟾酥的六神丸進行了體外抗病毒實驗研究，發(fā)現(xiàn)六神丸可減輕病毒感染HEp-2細胞病變反應。

預實驗中，無毒干蟾組的給藥劑量為1.04 g/（kg·d），連續(xù)給藥7 d，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，無毒干蟾組小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)和結(jié)腸長度均有保護作用的趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學意義。根據(jù)本文通信作者王成祥教授的臨床經(jīng)驗，急性感染期，邪氣較劇時，應當加大給藥劑量才可阻斷進展，因此本研究將前3 d的給藥劑量增加一倍，即2.08 g/（kg·d），后4 d仍為1.04 g/（kg·d），觀察發(fā)現(xiàn)與模型組比較，無毒干蟾組的小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)和結(jié)腸長度均有明顯保護作用。

本實驗研究證實，流感病毒感染急性期，模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降，肺指數(shù)和肺病毒載量明顯升高，肺組織炎癥反應嚴重程度達到高峰，肺組織中出現(xiàn)黏膜水腫、充血、炎癥細胞浸潤明顯等。肺組織高表達促炎因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA和IL-6 mRNA升高，血清和肺組織高表達促炎性細胞因子TNF-α、IL-6及趨化因子CCL2、CXCL10升高，同時抗炎性細胞因子IL-10水平也升高，且肺部炎癥病變程度與TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α、IL-6、CCL2、CXCL10的水平相一致。TNF-α促進微靜脈的黏附分子表達，導致細胞外滲進入肺部，同時招募細胞到炎癥和正常組織，促進產(chǎn)生趨化因子，是反映肺部感染及病變程度的良好指標［14］。IL-1β是主要的快速反應促炎介質(zhì)，在肺部炎性疾病早期有重要的作用［15］。IL-6在急性炎癥反應中參與急性期反應蛋白的合成，是參與病毒感染過程的關鍵細胞因子。CCL2可趨化單核-巨噬細胞、記憶性T淋巴細胞和樹突狀細胞聚集，促進初始T細胞增殖和TNF-α產(chǎn)生［16］。CXCL10可趨化T淋巴細胞、自然殺傷細胞和單核細胞聚集，促進IFN-γ、IL-6、IL-8等多種細胞因子分泌［17］。CCL2和CXCL10與流感病毒感染引起的肺部損傷的嚴重程度密切相關。IFN-γ主要介導與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答。以上實驗結(jié)果表明，流感病毒感染后，小鼠體內(nèi)過度的因子釋放會引起劇烈的炎性反應，產(chǎn)生組織病理變化，因此藥物干預使免疫狀態(tài)達到平衡是非常重要的。

本實驗研究證實，無毒干蟾能夠降低流感病毒感染后血清和肺組織中促炎性細胞因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA，血清和肺組織中促炎性細胞因子TNF-α、IL-6和趨化因子CCL2、CXCL10的過度表達，減少肺組織充血、水腫和炎性細胞浸潤，減輕肺組織的病理變化，抵抗流感病毒感染導致的急性肺損傷。無毒干蟾下調(diào)了流感病毒感染后小鼠血清和肺組織中IL-10和IFN-γ的過表達，在一定程度上抑制機體過度的抗炎反應，有助于免疫細胞清除流感病毒的同時不使免疫系統(tǒng)受抑制，從而使機體的免疫狀態(tài)達到平衡，有利于流感病毒感染后靶器官病理損傷的修復［18］。

同時，實驗還發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后的小鼠排便減少、結(jié)腸變細、結(jié)腸長度縮短，磷酸奧司他韋和無毒干蟾干預后的小鼠較模型組排便增多、結(jié)腸變粗、結(jié)腸變長，提示流感病毒感染引起肺部損傷的同時，對于結(jié)腸的生理狀況也有一定的影響，而無毒干蟾可以改善結(jié)腸的不良狀況。中醫(yī)有頗多肺與大腸相表里的相關記載?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》言“肺合大腸”。“肺手太陰之脈，起于中焦，下絡大腸，還循胃口……大腸手陽明之脈……絡肺，下膈屬大腸”。肺“主氣，司呼吸”“主宣發(fā)肅降”“大腸者，傳導之官，變化出焉”。大腸的主要功能是傳導糟粕，排泄大便，肺的肅降功能促成了糟粕在大腸的傳導，一旦肺系疾病產(chǎn)生，肅降功能受到影響，大腸即傳導失司。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，無毒干蟾對于流感病毒H1N1感染后的急性肺損傷有一定的保護和修復作用，同時對結(jié)腸也有一定的保護作用。無毒干蟾的抗流感效果值得進一步研究。