芪蛭膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷相關(guān)因子p-Akt、Cathepsin表達(dá)的影響?

莊曉彤 段芳芳 鞠麗麗 孫曉偉 陸雪健 蔣希成△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

缺血性腦卒中是一種由于大動脈或其分支血管阻塞導(dǎo)致血流不能流入大腦而引起腦組織急性損傷的腦血管類疾病［1］，是臨床較為常見的、多發(fā)的重大疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點(diǎn)。目前，臨床治療主要通過藥物溶栓或介入等手段快速恢復(fù)大腦缺血缺氧狀態(tài)。腦組織缺血后重獲血流灌注或氧供應(yīng)后，對腦組織產(chǎn)生的損傷作用是雙向的，它既可挽救瀕臨死亡的細(xì)胞，又可加重細(xì)胞的損傷甚至死亡［2］，對此臨床上缺乏有效的診療手段。近年來，中醫(yī)藥對腦缺血再灌注損傷（CIRI）的診療突顯了越來越重要的優(yōu)勢，且隨著細(xì)胞凋亡、自噬的發(fā)現(xiàn)，其在腦缺血再灌注損傷過程中的作用得到醫(yī)療科研工作者的高度重視。本實驗通過對PI3K-Akt-mTOR信號通路相關(guān)因子p-Akt、Cathepsin B、Cathepsin D表達(dá)研究，進(jìn)一步觀察芪蛭膠囊對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。大鼠在實驗室飼養(yǎng)適應(yīng)1周，溫度為（22±1）℃，濕度45%～55%，自由進(jìn)食進(jìn)水，12 h晝夜節(jié)律。動物實驗操作參考《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥物

芪蛭膠囊中藥復(fù)方（院內(nèi)制劑）：黃芪（批號170301）、丹參（批號180601）、燙水蛭（批號151003）、地龍（批號160101）、石菖蒲（批號180501）、郁金（批號180802）、川芎（批號180601）、當(dāng)歸（批號180102）、炙甘草（批號171001），生產(chǎn)廠家為黑龍江德順長中藥飲片有限公司。將藥物煎煮后以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，根據(jù)人和大鼠體表面積折算藥物使用量，煎煮濃縮為相當(dāng)于生藥1.27 g/mL的藥液，4℃冰箱密封、保存。

1.3 試劑與儀器

自噬抑制劑3-MA（阿拉丁，批號M129496），LY294002（MedChemExpress（MCE，批號 HY-10108），PBS（雙螺旋，批號P10033），TritonX-100（Beyotime，批號ST795），山羊血清（Solarbio，批號SL038），DAPI（Sig?ma，批號C1002），抗熒光淬滅劑（Solarbio，批號C0296-3），Western blotting及IP細(xì)胞裂解液（Beyotime，批號P0013），PMSF（Beyotime，批號ST506），細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（Beyotime，批號P0033），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，批號P0011），30%Acr-Bis（29∶1）（Beyotime，批號 ST003），SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（Beyotime，批號P0015），ECL發(fā)光液（Be?yotime，批號P0018），預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Fermentas，批號 26616），PVDF膜（Millipore，批號 IPVH00010），BSA（Biosharp，批號BS043），脫脂奶粉（伊利，批號：Q/NYLB 0039S），p-AKT（CST，批號 4060），Cathepsin B（Proteintech，批號12216-1-AP），Cathepsin D（Protein?tech，批號21327-1-AP），山羊抗兔IgG（beyotime，批號A0208），內(nèi)參抗體β-actin（Santa cruz，批號sc-47778）。腦立體定位儀（上海奧爾科特生物科技有限公司），臺式牙鉆機(jī)（上海齒科醫(yī)械廠），微量注射器（鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司），酶標(biāo)儀（美國BIOTEK），轉(zhuǎn)移槽（北京六一生物科技有限公司），雙垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司），超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.4 分組與給藥

給予常規(guī)飼料、雙蒸水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后觀察各組大鼠的狀態(tài)，剔除狀態(tài)不佳的大鼠，并及時補(bǔ)充新鼠。按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、3-MA組、LY組、中藥組，每組12只。中藥組每日給予芪蛭膠囊2.5 mL藥液灌胃，其余各組給予等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。3-MA組于造模前24 h側(cè)腦室注射3-MA溶液10 μL（3 μg/μL），LY組造模前30 min腹腔注射LY294002溶液10 mg/kg，取材前2.5 h再注射1次。

1.5 模型制備

各組大鼠灌胃7 d，第8日參照改良Zea Longa法［3］，制備大鼠大腦中動脈阻塞模型（MCAO）。術(shù)前大鼠禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。用鑷子撐開大鼠的嘴，夾出舌頭，開放氣道。備皮消毒后于大鼠頸部正中線偏右處做一2.0～2.5 cm的縱向切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），分離時應(yīng)注意保護(hù)沿血管的神經(jīng)。在近心端結(jié)扎CCA、ECA，用動脈夾暫時夾閉CCA遠(yuǎn)心端，然后在CCA近心端距分叉部4 mm處用眼科剪剪一小口，將帶有石蠟頭的線栓插入到CCA，系牢線栓，用鑷子輕推栓線至分叉處，松開動脈夾，使線栓從血管分叉處進(jìn)入ICA，至線栓中部標(biāo)記點(diǎn)到達(dá)分叉位置附近，插入長度約為（18±2）mm，于CCA遠(yuǎn)心端用細(xì)線結(jié)扎。剪斷結(jié)扎在CCA、ECA的多余線頭，消毒后縫合切開皮膚。術(shù)后2 h進(jìn)行再灌注，將栓線拔出約1 cm左右，以防出血。術(shù)后大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室24 h，自由進(jìn)食飲水。假手術(shù)組僅將CCA、ECA、ICA游離，不插入線栓，其余步驟同其他組。在手術(shù)期間及術(shù)后，采用保溫措施將大鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。

1.6 神經(jīng)功能評分

各組大鼠CIRI 24 h后，采用神經(jīng)功能評分（NSS）量表評估功能神經(jīng)受損程度，以確定大鼠MCAO后的運(yùn)動、感覺、平衡和反射障礙等［4］。NSS評分共18分，分值越高，神經(jīng)功能缺損程度越重。神經(jīng)損傷評分分級如下：嚴(yán)重?fù)p傷（13～18分），中度損傷（7～12分），輕度損傷（1～6分），無損傷（評分為0）。

1.7 標(biāo)本采集與檢測

1.7.1 腦組織含水量測定 各組大鼠完成神經(jīng)功能評分后，每組取5只大鼠，快速斷頭取腦，去除小腦和腦干。用電子天平稱取標(biāo)本的濕重，然后將腦組織置入電熱恒溫培養(yǎng)箱（100±2）℃中烘24 h至恒重，稱取干重。采用干、濕比重法計算腦組織含水量，腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7.2 Western blotting法檢測大腦組織中p-Akt、Ca?thepsin B、Cathepsin D表達(dá)水平 各組取7只大鼠再灌注24 h，斷頭取腦，缺血區(qū)腦組織冷凍后研磨，加適當(dāng)量的裂解液，冰上靜置30 min，4℃低溫冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心5 min，取上層清液（大腦組織總蛋白樣品）。應(yīng)用BCA法蛋白定量，酶標(biāo)儀讀數(shù)并記錄。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量配制15%分離膠，濃縮膠濃度為5%，上樣，SDS-PAGE電泳，5%TBST中室溫，一抗（兔抗AKT抗體1∶500）4℃孵育過夜，二抗［山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000］，搖床搖動5 min。轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)脫脂奶液封閉、TBST洗膜后，加入Akt二抗（1∶1000）。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白表達(dá)水平，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。以β-actin為內(nèi)對照標(biāo)準(zhǔn)化后，比較其表達(dá)量的變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠NSS評分比較

見表1。假手術(shù)組大鼠沒有表現(xiàn)出神經(jīng)功能受損。其余各組在CIRI 24 h均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比較均有顯著差異（P<0.05），中藥組與模型組比較神經(jīng)功能評分降低（P<0.05）。提示芪蛭膠囊可減輕CIRI大鼠的神經(jīng)損傷。

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較

見表1。假手術(shù)組大鼠無腦水腫表現(xiàn)。CIRI 24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高（P<0.05）；與模型組、3-MA組、LY組比較，中藥組腦組織含水量明顯降低（P<0.05）。提示芪蛭膠囊可降低CIRI大鼠的腦組織含水量。

表1 各組大鼠NSS評分及腦組織含水量比較（±s）

表1 各組大鼠NSS評分及腦組織含水量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，?P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P<0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組3-MA組LY組中藥組n 12 12 12 12 12 NSS評分（分）0.00±0.00 11.83±0.68*#14.15±0.32*#△12.26±0.17*#△9.92±0.08*#n55555腦含水量（%）78.18±0.10 82.81±1.05*△83.55±1.17*△83.18±0.86*△81.53±2.01*#

2.3 各組大鼠腦組織相關(guān)因子p-Akt、Cathepsin蛋白表達(dá)比較

CIRI 24 h，與假手術(shù)組相比，其他各組p-Akt蛋白表達(dá)均減少（P<0.05），與模型組相比，3-MA組、LY組、中藥組中p-Akt蛋白表達(dá)減少（P<0.05），但與3-MA組、LY組相比，中藥組中p-Akt蛋白表達(dá)有所增加（P<0.05）。CIRI 24 h，與假手術(shù)組相比，其他各組Ca?thepsin B蛋白表達(dá)均增加（P<0.05），與模型組相比，中藥組中Cathepsin B蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。CIRI 24 h，與假手術(shù)組相比，其他各組Cathepsin D蛋白表達(dá)均增加（P<0.05），與模型組相比，中藥組Ca?thepsin D蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。結(jié)果見圖1～圖3，表2。提示芪蛭膠囊可降低p-Akt蛋白的表達(dá)，增加Cathepsin B、Cathepsin D蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步激活自噬。

圖1 各組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠腦組織Cathepsin B蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠腦組織Cathepsin D蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠腦組織p-Akt、Cathepsin蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織p-Akt、Cathepsin蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組3-MA組LY組中藥組n 7 7 7 7 7 p-Akt 1.00±0.00 0.48±0.02*0.30±0.01*#△0.20±0.04*#△0.44±0.01*#Cathepsin B 1.00±0.00 2.90±0.01*2.65±0.03*#△4.10±0.02*#△4.16±0.05*#Cathepsin D 1.00±0.00 3.27±0.02*2.01±0.04*#△4.21±0.03*#△4.29±0.06*#

3 討 論

張仲景于《金匱要略》首載中風(fēng)之名，其曰“脈微而數(shù)，中風(fēng)使然”，認(rèn)為正虛邪中為中風(fēng)病因；清代醫(yī)家王清任提出“氣虛致瘀”之論點(diǎn)，并創(chuàng)立益氣活血的經(jīng)典名方——補(bǔ)陽還五湯；張錫純亦言“氣血虛者，其經(jīng)絡(luò)多瘀滯……以化其瘀滯，則偏枯痿廢者，自愈也”。古今醫(yī)家對于中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識已基本趨于一致，認(rèn)為是本虛標(biāo)實，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，瘀血既成，又影響氣的生血及行血，使腦絡(luò)瘀阻加重，易發(fā)為中風(fēng)，治療多以益氣活血為治療大法。筆者課題組在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，又依據(jù)現(xiàn)代人高脂肪、高熱量飲食的生活習(xí)慣，易致脾虛而生痰，認(rèn)為缺血性腦中風(fēng)的主要病機(jī)為氣虛血瘀夾痰，氣虛為本，血瘀痰濁為標(biāo)；氣虛無力運(yùn)血則發(fā)為血瘀，而瘀血阻礙氣機(jī)，水液代謝失常，氣滯濕阻，聚濕為痰；痰瘀既為病理產(chǎn)物又為致病因素，痰瘀互結(jié)阻滯人體氣血運(yùn)行，壅塞腦竅，發(fā)為中風(fēng)?；诖颂岢鲆鏆饣钛㈧铕鐾ńj(luò)化痰的治療大法，擬定芪蛭膠囊中藥復(fù)方治療缺血性中風(fēng)，并在臨床應(yīng)用中取得了顯著療效。方中重用黃芪為君，大補(bǔ)元?dú)?，氣足則血生，氣旺促血行；臣以蟲類水蛭、地龍之品，破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，石菖蒲、郁金化痰祛瘀，開竅醒神；佐以丹參、當(dāng)歸、川芎共奏補(bǔ)血、活血之功，使以炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪之功。本課題組在前期實驗研究發(fā)現(xiàn)［5-7］，芪蛭膠囊對大鼠局灶性腦缺血具有保護(hù)作用，能保護(hù)腦組織神經(jīng)元內(nèi)線粒體功能，抑制PKC-MARCKS信號通路的激活及小膠質(zhì)細(xì)胞的生成，進(jìn)而減輕CIRI損傷。

近年來，自噬作為新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式［8］，在腦缺血再灌注中的參與作用逐漸得到重視。有研究表明，CIRI的整個過程中均有自噬的參與，且腦缺血再灌注后自噬激活就像一把雙刃劍［9］，適度激活可對細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，過度的自噬可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡。CIRI后，多種信號通路參與了調(diào)控自噬過程，其中PI3K-Akt-mTOR信號通路在自噬的調(diào)控中扮演了核心角色［10］。自噬的整個過程是由自噬相關(guān)基因家族調(diào)控，組織蛋白酶（cathepsins）、Akt蛋白等扮演著重要角色。絲蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是PI3K的下游效應(yīng)物，能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，I型PI3K催化生成PIP3，進(jìn)而通過誘導(dǎo)AKT活化而抑制自噬［11］。本實驗結(jié)果表明，中藥組神經(jīng)功能評分明顯降低（P<0.05），腦組織含水量降低（P<0.05）；Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠p-Akt表達(dá)較假手術(shù)組降低，自噬激活，中藥組p-Akt表達(dá)進(jìn)一步降低，表明自噬被進(jìn)一步激活，證實了中藥芪蛭膠囊通過激活自噬而減輕了缺血缺氧的腦組織損傷。

Cathepsin是一種廣泛存在的嗜酸性溶酶體蛋白水解酶，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以酶原的形式貯存在溶酶體中。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬體內(nèi)膜及其包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解［12］。Cathepsin作為溶酶體的標(biāo)志物，通過選擇性水解靶蛋白肽鍵而參與自噬進(jìn)程［13］。在大鼠缺血性卒中后6 h即可檢測到Cathepsin的表達(dá)，同時伴隨LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)，可以顯著減少大鼠腦梗死面積［14］。Cathepsin D是是溶酶體最主要的蛋白水解酶之一，可降解自噬溶酶體以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)［15］。Cathepsin D可激活Cathepsin B、H、L的酶原形式［16］。Felbor等［17］報道Cathepsin B和Cathepsin L在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能方面起重要作用。薛杭［18］研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧后24 h，新生大鼠左側(cè)海馬區(qū)溶酶體蛋白酶Cathepsin B表達(dá)增高。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠Cathepsin D、Cathepsin B表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，提示自噬小體促進(jìn)了溶酶體活化，完成自噬溶酶體降解的過程，中藥組Cathepsin D、Cathepsin B表達(dá)量較模型組進(jìn)一步增加，結(jié)合p-Akt蛋白中藥組表達(dá)結(jié)果，認(rèn)為自噬小體增加使蛋白水解酶表達(dá)增加，自噬進(jìn)一步活化，從而有效保護(hù)缺血缺氧的腦組織細(xì)胞。

綜上所述，本實驗通過對大鼠腦缺血再灌注損傷相關(guān)因子p-Akt、Cathepsin D、Cathepsin B表達(dá)研究，闡明了芪蛭膠囊可進(jìn)一步激活自噬而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制，對大鼠腦缺血再灌注損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用。