超順磁性Fe3O4磁共振對比劑的合成及其T2-加權(quán)成像性能研究*

杜慶波 方迎春 謝小雪 劉龍剛 尹輝

(皖北衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 宿州安徽 234000)

超順磁性氧化鐵(Fe3O4)納米粒子(SPIONs)由于具有強磁性和高磁化率，已在磁共振成像，磁性引導(dǎo)的藥物輸送，熱療和細(xì)胞分離中顯示出巨大的應(yīng)用前景[1-4]。由此備受研究人員的關(guān)注[5-8]。多種方法被用于合成磁性Fe3O4納米顆粒，如化學(xué)共沉淀法、溶劑熱法和超聲化學(xué)法等[9-13]。Zhang等[14]以乙醇為溶劑，采用一種簡單方便、經(jīng)濟環(huán)保的溶劑熱法制備了不同形貌的磁鐵礦(Fe3O4)納米結(jié)構(gòu)，包括由磁鐵礦納米粒子組成的規(guī)則磁鐵礦亞微米球，空心的磁鐵礦團聚體和單分散磁鐵礦納米粒子。制備的磁鐵礦納米粒子具有明顯的超順磁性行為，在生物技術(shù)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力。研究了制備的磁鐵礦納米粒子的體外和體內(nèi)磁共振成像能力。Dutta等[15]開發(fā)了表面功能化的Fe3O4磁性納米粒子(MNPs)系統(tǒng)，可用于腫瘤靶向多模式治療和MR成像。該方法將生物相容性的非必需氨基酸(谷氨酸)引入Fe3O4mnps表面，為化療藥物的結(jié)合提供功能位點。這些谷氨酸包覆的Fe3O4mnps(GAMNPs)具有良好的水分散性、磁響應(yīng)性和pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)特性。采用XRD、TEM、DLS、FTIR、PPMS、紫外可見光譜、zeta電位分析儀等對GAMNPs的磁芯和有機殼層進(jìn)行了表征。將廣譜抗癌藥物鹽酸阿霉素(DOX)和甲氨蝶呤(MTX)分別與GAMNPs表面靜電偶聯(lián)和共價偶聯(lián)，用于聯(lián)合化療。這些雙載藥系統(tǒng)(DOX-MTX-GAMNPs)顯示了兩種藥物的pH依賴性釋放行為，并且與單獨治療相比，對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的毒性增強。流式細(xì)胞術(shù)分析證實MCF-7株細(xì)胞攝取成功。另外，MTX是葉酸的類似物，它與DOX的共傳遞將有助于這兩種藥物內(nèi)化到MCF-7細(xì)胞中。這些GAMNPs在交流磁場下也顯示出良好的加熱效率(在Fe濃度分別為0.5、1和2mg/ml時，ILP分別為0.95、0.73和0.48nHm2/Kg)和橫向弛豫性(r2=152mM-1s-1)，表明它們具有熱療和磁共振跟蹤的潛在能力。此外，還觀察到化療藥物和熱療聯(lián)合使用可增強MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

雖然報道的方法在制備具有可調(diào)尺寸和表面性質(zhì)的Fe3O4納米粒子方面取得了巨大成就，但合成工藝一般不環(huán)保、經(jīng)濟。例如，在熱分解過程中通常采用的Fe(CO)5是高度毒性的，并且在熱分解過程中必須使用一些昂貴的試劑，如油胺和1-十八碳烯[16]。因此，開發(fā)一種簡便、經(jīng)濟的合成策略，制備Fe3O4納米顆粒，不需要昂貴和有毒的試劑來滿足不同的大規(guī)模應(yīng)用要求已成為當(dāng)務(wù)之急。在此，筆者報道了一種簡單方便，低成本和環(huán)境友好的合成方法，通過簡單的溶劑熱過程以乙二醇為溶劑，制備超順磁性、單分散的Fe3O4納米顆粒。采用多種現(xiàn)代技術(shù)手段對制備的Fe3O4納米顆粒進(jìn)行表征，綜合樣品的結(jié)晶性、形貌和磁性能，選取在180oC加熱8h制備的Fe3O4(F3)納米顆粒為研究對象，采用MesoMR23-060H-I低場核磁共振成像與分析系統(tǒng)對制備的Fe3O4(F3)納米顆粒的體外成像性能進(jìn)行研究。實驗結(jié)果表明：所獲得的Fe3O4(F3)納米顆粒具有超順磁性和優(yōu)異的體外磁共振成像(MRI)性能。

1試驗部分

1.1試驗儀器

實驗用儀器詳見表1。

表1 試驗儀器

1.2試驗試劑

實驗試劑主要有分析純硝酸鐵(≥99.0%)、水合肼(≥85.0%)、乙二醇(≥99.0%)、聚乙二醇(≥99.0%)來自國藥集團化學(xué)試劑，分析純無水乙醇(≥99.0%)來自安徽安特食品股份有限公司。

1.3 Fe3O4磁共振對比劑的制備

取聚乙二醇4000(PEG)0.6g，硝酸鐵(Fe(NO3)3·9H2O)1mmol，放入50mL潔凈干燥的燒杯中，加25mL乙二醇，磁力攪拌使溶解，然后用移液管逐滴加入2mL水合肼，磁力攪拌10min，將所得褐色漿液轉(zhuǎn)移至50mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，旋緊，將反應(yīng)釜放入烘箱中180oC反應(yīng)8h，取出反應(yīng)釜，自然冷卻至室溫。收集所得樣品，用無水乙醇洗滌5次，60oC真空干燥12h，備用。合成路線如圖1所示，不同實驗條件下所制備的樣品(F1-F5)列于表2。

圖1 溶劑熱法合成超順磁性Fe3O4 納米顆粒的示意圖

表2 不同F(xiàn)e3O4 樣品的實驗條件

1.4超順磁性Fe3O4納米顆粒的體外成像實驗

采用MesoMR23-060H-I低場核磁共振成像與分析系統(tǒng)(磁體強度0.5T，線圈直徑為60mm，磁體溫度為32℃)，對超順磁性Fe3O4納米顆粒的體外成像效果進(jìn)行研究。配制6個濃度梯度溶液。將配置好的造影劑溶液超聲3min后立即放入樣品槽中測試。

實驗參數(shù)：

(1)T1弛豫時間測試(IR)：SFO1=21.768MHz，P1=11us，P2=22us，SW=100KHz，TW=28000ms，RFD=0.08ms，RG1=20db，DRG1=3，NS=2，NTI=25.

(2)T2弛豫時間測試(CPMG)：SFO1=21.768MHz，P1=11us，P2=22us，SW=100KHz，TW=8000ms，RFD=0.08ms，RG1=20db，DRG1=3，NS=2，TE=0.8，NECH=10000.

(3)T2加權(quán)像測試參數(shù)：FOVRead=80mm，F(xiàn)OVPhase=80mm，Slice=1，SliceWidth=5mm，K空間大小256×192，TR(ms)=1400ms，TE(ms)=100ms，Average=6.

而入門的小學(xué)生和初中低年級學(xué)生，處境就比較尷尬。從國外引進(jìn)的童書繪本中，以外研出版社引進(jìn)的偏文字英語故事書為主，對英語入門級學(xué)生而言難度偏高；其他出版社，更多為直接出中文譯作。而承載著認(rèn)知啟蒙、培養(yǎng)語言興趣使命的入門級英語原版繪本，市面上實在是少之又少（漆秋香，2015），視聽資源更是缺乏。偶爾出現(xiàn)，價格還偏高。正版資源少，盜版也是無源之水。

2結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4的物相與形貌分析

采用X射線粉末衍射儀對制備的Fe3O4樣品的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)晶性能和相純度進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2(a)所示。

圖2 樣品F3的XRD圖(a)和EDS圖(b)

圖2(a)中，衍射峰出現(xiàn)在2θ值為30.1，35.4，43.1，53.2，57.0，62.7和74.0處有7個衍射峰，分別對應(yīng)于尖晶石結(jié)構(gòu)Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)和(533)晶面。衍射峰位置和相對強度與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)峰值一致 JCPDS：19-0629)[7、17-18]。沒有觀察到其他雜質(zhì)峰，表明制備的Fe3O4納米顆粒具有立方結(jié)構(gòu)。圖2(b)為制備的Fe3O4納米顆粒的EDS圖譜，圖中顯示樣品僅由鐵和氧兩種元素組成，且鐵和氧兩種元素之比(Fe/O=1：1.15)接近Fe3O4的化學(xué)計量比，說明樣品為Fe3O4。

圖3(a)證實成功合成了大量球形Fe3O4NP，從圖中可以看出樣品為大量納米粒子的聚集體。由于樣品的磁性能和表面能較高，顆粒之間團聚較嚴(yán)重。圖3(b)表示樣品的TEM圖像，從中可以看出，樣品顯示出具有均勻形狀和窄尺寸分布，納米顆粒的直徑約為20nm。圖3(c)HRTEM圖像表明，所獲得的Fe3O4本質(zhì)上是高度結(jié)晶的，晶面間距為0.296nm，與Fe3O4220)晶面匹配[7]。圖3(d)顯示了合成的Fe3O4納米粒子的SAED圖像，圖中顯示樣品是令人滿意的立方尖晶石晶體結(jié)構(gòu)的多晶體。

圖3 樣品F3的掃描電鏡圖像(a)；透射電鏡圖(b) 像；高分辨透射電鏡圖像(c)；選區(qū)電子衍射 圖像(d)

采用XPS在0-1200eV的范圍內(nèi)分析Fe3O4樣品的表面元素組成和氧化態(tài)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 樣品F3的XPS全譜(a)；高分辨Fe2p(b)； 高分辨O1sF3(c)

圖4(a)為Fe3O4樣品的XPS全譜，它表明樣品含有Fe、O和C三種元素，其中C元素來源于樣品表面殘留的高分子有機物；圖4(b)顯示了Fe2p區(qū)域的高分辨率XPS光譜，對于Fe2p，典型的Fe2p為710.9和724.3 eV的寬峰，分別對應(yīng)于Fe3O4的Fe2p3/2和Fe2p1/2自旋軌道峰，這意味著形成 Fe (II)和Fe(III)的混合氧化物，結(jié)果與文獻(xiàn)報道的Fe3O4值一致[19-21]；圖4(c)為O1s區(qū)域的高分辨率XPS光譜，530.2eV處的峰值是與Fe3O4相對應(yīng)的Fe-O物種的典型狀態(tài)[22]。

2.2 Fe3O4的磁性和表面成分分析

使用SQUID磁力計在室溫下對合成的Fe3O4納米顆粒的磁性能進(jìn)行研究，如圖5(a)所示。圖5(a)顯示合成 的Fe3O4納米顆粒磁化曲線呈典型的“S”型，表現(xiàn)出超順磁性，而幾乎沒有磁滯，其飽和磁化值和矯頑力分別為66.9和27.9emu/g。圖5(a)右下角的插圖為樣品在磁場范圍-1000～1000 Oe的磁滯回線，從圖上可以清楚的觀察到樣品很小的剩余磁化強度和矯頑力。這種低的剩磁可能歸因于Fe3O4納米顆粒的小的磁各向異性[23-24]。

圖5(b)顯示純PEG和PEG/Fe3O4納米復(fù)合材料的FTIR光譜。分別在2860cm-1和1420～1450cm-1處觀察到的寬帶歸因于吸附水，這歸因于O-H和H-O-H組的振動[23]，在PEG/Fe3O4和空白PEG中均觀察到了這些譜帶，但是獲得了不同的強度。560cm-1附近的譜帶對應(yīng)于拉伸振動，這是由于氧與占據(jù)PEG/Fe3O4納米復(fù)合材料四面體位點的陽離子之間的相互作用而產(chǎn)生的[25]。純PEG樣品在3400～3450cm-1和1000～1030cm-1處給出清晰的譜帶，表明存在-OH和C-O組振動模式。1200～600cm-1和2880～1600cm-1之間的頻帶分別對應(yīng)于C-H組彎曲和拉伸振動的平面變形。1470cm-1處的譜帶是由于PEG的C-C拉伸振動[26]。

圖5 樣品F3的室溫磁滯回線(a)和FTIR光譜(b) (右下角插圖是局部放大圖)

2.3試驗條件對Fe3O4物相，形貌及磁性能的影響分析

圖6為不同反應(yīng)時間和溫度條件下所得Fe3O4樣品的XRD圖譜。圖中顯示在不同的實驗條件下所得樣品均為Fe3O4。圖中2θ=30.41，35.71，43.41，57.21和62.91處的衍射峰分別歸屬于立方相Fe3O4(JCPDS：19-0629)的(220)、(311)、(400)、(511)和(440)晶面。從圖6可以發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時間的延長，樣品的XRD衍射峰增強，說明樣品的結(jié)晶性增加。

圖6 不同樣品的XRD圖譜(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4和F5)

為了研究反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度與樣品的形貌、尺寸之間的關(guān)系，采用SEM對不同實驗條件下所得的樣品進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同樣品的掃描電鏡圖像 (a)F1；(b)F2；(c)F3；(d)F4；(e)F5

圖7證實合成的Fe3O4納米材料均為球形顆粒，且平均直徑為10～20nm。由于磁性納米顆粒之間偶極-偶極相互作用和大的表面能，納米顆粒之間存在不同程度的團聚。

使用磁學(xué)測量系統(tǒng)(SQUID)在室溫下對各種實驗條件下合成的Fe3O4納米顆粒的磁性能進(jìn)行研究，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同樣品的室溫磁滯回線(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5)

磁化曲線幾乎沒有矯頑力和剩余磁化強度，在外磁場下磁化強度基本達(dá)到飽和，表明合成的Fe3O4納米顆粒在室溫下具有典型的超順磁性[27]。磁性納米顆粒在室溫下的這種超順磁性使得Fe3O4納米顆粒具有廣泛的應(yīng)用的潛力，例如藥物遞送、生物分離和磁共振成像[28-32]。這一結(jié)果與Fe3O4納米粒子的臨界尺寸有關(guān)，粒徑小于25nm時可以觀察到超順磁性[33]。

在各種實驗條件下制備的Fe3O4納米顆粒的飽和磁化強度、剩余磁化強度和矯頑力列于表3中。

表3 不同F(xiàn)e3O4納米顆粒的磁性能

從表3可以看出，飽和磁化強度值隨著反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高而增加；剩余磁化強度和矯頑力隨著反應(yīng)時間的延長和反應(yīng)溫度的升高而減小。實驗數(shù)據(jù)說明反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對樣品的磁性能有重要影響。

2.4 Fe3O4的磁共振成像性能

近年來，MRI已成為診斷癌癥最有效的工具之一。在這項技術(shù)中，注射鐵磁流體的活體內(nèi)的不同軟組織，將通過這些組織內(nèi)磁矩的不同弛豫時間T2來區(qū)分。如果使用的鐵磁流體可以在T2值之間提供明顯的組織間差異，則將以高對比度獲得高分辨率的MR圖像。在這里，將對180oC反應(yīng)8h條件下制備的超順磁性Fe3O4納米顆粒(F3)的體外成像效果進(jìn)行研究。圖9(a)和(b)為1/T1和1/T2弛豫時間隨Fe3O4的濃度變化關(guān)系，縱向弛豫率(r1)和橫向弛豫率(r2)分別為0.111 ug·mL-1s-1和2.186 ug·mL-1s-1，r2/r1=19.7，具有更強的橫向?qū)Ρ榷仍鰪?，說明制備的超順磁性氧化鐵納米顆粒更適合作為T2磁共振對比劑[32， 34]。從圖9 (c)中可以清楚地看出，在灰度圖中隨著樣品濃度的增大，MR圖像的信號強度呈現(xiàn)負(fù)增強；在彩色圖中，很明顯隨著Fe3O4納米顆粒的濃度增加，圖像顏色紅色變?yōu)樗{(lán)色，表明MRI信號強度逐漸增加，這種現(xiàn)象與基于灰度圖強度的觀察結(jié)果一致。表明制備的Fe3O4納米顆粒(F3)是潛在的T2造影劑。

圖9 樣品F3的T1(a)；T2弛豫效率(b)； T2加權(quán)成像(c)

3結(jié)論

文章采用溶劑熱法成功合成了Fe3O4@PEG納米顆粒，使用多種方法表征了樣品的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、磁化性質(zhì)和MRI成像性能。合成的Fe3O4納米顆粒表現(xiàn)出超順磁行為和高飽和磁化強度。研究了反應(yīng)時間和溫度對樣品形貌、尺寸、結(jié)晶性和磁學(xué)性能的影響。綜合考慮實驗數(shù)據(jù)，選取在180oC反應(yīng)8h條件下制備的超順磁性Fe3O4納米顆粒(F3)為研究對象，采用MesoMR23-060H-I低場核磁共振成像與分析系統(tǒng)對其體外成像效果進(jìn)行成像分析研究。研究結(jié)果表明，合成的超順磁性Fe3O4@PEG納米粒子(F3)可能是一種很有應(yīng)用前景的T2造影劑。