定量核磁共振氫譜測定發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量

梁光焰，姜陽明，周美，夏宇，李春燕，胡恩明，顏秋曉，王道平*

1(貴州醫(yī)科大學，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽,550014) 2(貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽,550014)

乙醇、乙酸作為常見的化合物，廣泛存在于食品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域。在食用植物酵素生產(chǎn)中，乙醇、乙酸常伴隨著發(fā)酵而產(chǎn)生，其含量直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)、口感、香氣等評價指標[1-2]。在果汁發(fā)酵生產(chǎn)中，乙醇的含量可能會直接影響發(fā)酵菌株的活性、營養(yǎng)成分的溶出、產(chǎn)品的穩(wěn)定性及產(chǎn)品分類；乙酸與產(chǎn)品口感、香味等因素息息相關(guān)，控制乙醇、乙酸的含量無論是在生產(chǎn)過程中，還是在產(chǎn)品品質(zhì)評價上都非常重要[3-4]。有報道采用高效液相色譜法對發(fā)酵飲料中乙酸的含量進行測定[5]，但乙酸極性較大且屬于末端吸收，對色譜柱、流動相都有特殊的要求；乙醇多使用氣相色譜內(nèi)標法進行測定[6]，其易揮發(fā)、極性較大，對毛細管色譜柱有特殊要求，若測試樣品中存在類乙醇和類乙酸的化合物時測試難度會增大。對乙醇、乙酸的含量檢測也有采用重鉻酸鉀氧化、酸堿滴定、pH電位法等[7-10]，這些檢測方法樣品前處理復雜，測試耗時長，對二者同時進行含量測定少有研究，因此，有必要探析一種更為方便、快捷、檢測結(jié)果準確可靠的檢測技術(shù)，同時測定發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量。

在定量核磁試驗中，定量峰面積與對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)成正相關(guān)，其測定具有不破壞樣品、不依賴標準物質(zhì)、樣品制備簡單與測試結(jié)果高效準確等優(yōu)勢[11-14]。早期，低靈敏度是定量核磁共振氫譜(quantitative proton nuclear magnetic resonance,q1H-NMR)技術(shù)面臨的主要問題，但隨著高磁場、超低溫探頭技術(shù)的問世，這個問題已被逐步解決。1H-NMR可以提供不同化合物、不同化學環(huán)境下質(zhì)子的信號峰，這些核磁信號峰與質(zhì)子所處的空間化學環(huán)境相關(guān)，這為同時測定多種化合物提供了可能。目前，q1H-NMR技術(shù)被多國藥典收錄，常用于多成分的含量測定，蜂蜜、咖啡等鑒別測試、代謝組學等方面的研究[15-19]，但用于發(fā)酵飲料含量測定方面的研究還少有報道。本文采用q1H-NMR技術(shù)，同時測定5種發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量，對重復性、穩(wěn)定性、準確度、線性范圍等進行方法學考察，使用GC法對q1H-NMR測試結(jié)果進行驗證。建立并優(yōu)化5種發(fā)酵飲料中乙醇和乙酸含量的測定方法，該方法可用于準確快速地檢測發(fā)酵飲料的中間產(chǎn)品，為最終保證成品質(zhì)量的穩(wěn)定性、均一性提供數(shù)據(jù)支持，也為食用植物酵素中醇、酸類物質(zhì)的含量測定提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙醇(99.80%)、乙酸(99.50%)標準品，中國計量科學研究院；3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉[sodium 3-(trimethylsilyl) propionate-2,2,3,3-d4,TMSP](98%)，美國劍橋；5種發(fā)酵飲料，互聯(lián)網(wǎng)方式購入，命名為F1～F5，分別為刺梨、李子、木瓜、刺梨木瓜與刺梨山楂飲料。

Bruker Avance NEO 600 MHz型核磁共振波譜儀，Bruker公司；明澈TM-D24UVB純水-超純水一體機，德國默克集團；AG285分析天平，梅特勒-托利多集團；Agilent 7820氣相色譜儀，Agilent公司;氘代二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6)，美國劍橋同位素實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 核磁共振供試品溶液制備

精密稱取適量樣品至內(nèi)徑為5 mm核磁管中，精確稱取內(nèi)標TMSP 1.00 mg，加入溶劑[V(DMSO-d6)：V(H2O) = 4∶1]500 μL，混勻后測試。分別取適量乙醇、乙酸標準品溶液配制6個標準樣品(乙醇64.05～0.32 mg/mL，乙酸19.51～0.20 mg/mL)，按上述樣品配制方法，配制、混勻后測試，并繪制標準曲線。

1.2.2 核磁測試參數(shù)設(shè)置

q1H-NMR測試采用90° 脈沖，脈沖程序為zg，譜寬設(shè)置為 SW∶10.96 ppm、O1∶5.06 ppm，采樣次數(shù)(NS)為16次，測試溫度298 K，采樣時間(AQ)為4.50 s，弛豫延遲時間(D1)為20 s，采樣點數(shù)為64 K。1H-1H COSY脈沖程序為cosygpppqf，F(xiàn)1譜寬SW∶10.96 ppm，O1∶4.37 ppm，F(xiàn)2譜寬SW∶10.96 ppm，O1∶4.37 ppm，D1為2 s，NS為4次，空掃(DS) 為16。1H-13C HSQC脈沖程序為hsqcedetgpsp.3，F(xiàn)2維(H)譜寬SW∶10.96 ppm，O1∶4.37 ppm，F(xiàn)1(C)譜寬SW∶200 ppm，O1∶95 ppm，NS 為8次，DS 為32。

1.2.3 核磁數(shù)據(jù)處理計算

將采集得到的數(shù)據(jù)使用Topspin 4.0.3軟件進行傅里葉變換，定標、相位校正和五階基線校正處理，選定內(nèi)標和樣品定量特征峰，放大后進行積分，取5次積分的平均值進行計算，如公式(1)所示：

(1)

式中：Wr，內(nèi)標物的質(zhì)量；As，供試品特征峰值；Ar，內(nèi)標峰的振幅值；Es，供試品的質(zhì)子當量質(zhì)量；Er， 內(nèi)標物的質(zhì)子當量質(zhì)量(以分子質(zhì)量除以特征峰的質(zhì)子數(shù)計算得到)；根據(jù)Ws和稱樣量，計算組分在樣品中的含量。

1.2.4 氣相色譜供試品溶液制備

分別取適量的乙醇、乙酸超純水稀釋配制得標準樣品各6份(乙醇0.68～3.41 mg/mL，乙酸2.16～12.40 mg/mL)，進樣檢測后繪制標準曲線。取適量乙醇、乙酸超純水稀釋為不同濃度的供試驗證樣品。

1.2.5 氣相色譜參數(shù)設(shè)置

毛細管色譜柱為HP-INNOWAX (30 m×320 μm, 0.25 μm)，進樣口溫度220 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度 220 ℃；采用程序升溫：起始溫度為30 ℃，保持 8 min，以10 ℃/min的速率升溫至70 ℃，再以25 ℃/min的速率升溫至220 ℃，維持3 min。進樣量1 μL，分流進樣，分流比為20∶1，載氣為氮氣，柱流量為1.00 mL/min。測試結(jié)果使用SPSS 19.0軟件對比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 q1H-NMR測試方法的優(yōu)化

2.1.1 內(nèi)標物與溶劑的選擇

采用q1H-NMR技術(shù)進行含量測定時，內(nèi)標物應(yīng)選純度高、易稱量、與待測物不發(fā)生反應(yīng)的化合物，在1H-NMR圖譜中可以完全分離、互不干擾。在本試驗中，試樣中的水與乙醇、乙酸發(fā)生質(zhì)子交換，活潑氫不出峰；故乙酸只出現(xiàn)甲基的質(zhì)子信號(CH3—)，化學位移為1.80 ppm (s, CH3—)，可作為定量峰；乙醇出現(xiàn)2個信號峰，化學位移分別為1.10 ppm (t, CH3—)、3.49 ppm (q,—CH2—)，為計算方便、提高測定結(jié)果的準確度本試驗選擇化學位移1.10 ppm (t)作為乙醇定量峰；TMSP化學位移為0.00 ppm (s)；三者不重疊、分離度良好且不受樣品中其他雜質(zhì)信號影響(圖1)，故TMSP可作為本測試的內(nèi)標。由于本實驗測定樣品的特殊性，選用醇類氘代溶劑和極性較小的氘代溶劑可能會對測試準確度有一定的影響，本試驗選用DMSO-d6與超純水混合溶劑能充分溶解樣品和內(nèi)標，溶劑信號峰在1H-NMR譜圖中與TMSP、乙醇、乙酸的信號峰完全分離，不影響其檢測結(jié)果。

圖1 發(fā)酵飲料1H-NMR重疊圖Fig.1 Overlaid 1H-NMR spectra of the fermented drinks

2.1.2 q1H-NMR測試參數(shù)的優(yōu)化

影響定量核磁共振測定結(jié)果準確度與重復性的參數(shù)主要有D1、NS及信噪比(S/N)等。D1的設(shè)定依據(jù)是由待測物與內(nèi)標物中待定量質(zhì)子的縱向弛豫時間T1決定，只有待測質(zhì)子完全弛豫后，相應(yīng)的峰面積比值才會保持相對恒定，從而確保測試結(jié)果的準確度，研究報道當D1≥ 5T1時測定結(jié)果的準確度得到保障[20]。在本試驗中，分別取適量乙醇、乙酸和TMSP溶于核磁管中，采用反轉(zhuǎn)恢復法[21](設(shè)置Vdlist參數(shù)為0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、15.00、30.00 s)測得乙醇、乙酸和TMSP化合物的T1分別為4.04、2.16、2.51 s；故本實驗D1設(shè)置為20 s，加上樣品采集時間AQ=4.50 s，滿足AQ+D1>5T1。在q1H-NMR測試中，S/N與NS成正相關(guān)，通常情況下增加掃描次數(shù)，能夠獲得足夠高的信噪比；但隨著掃描次數(shù)增加測試實驗時間也會延長，降低檢測效率。本試驗設(shè)置NS為8、16、32進行考察，對測試結(jié)果進行對比分析，無明顯的差異變化，為保障測試結(jié)果的穩(wěn)定性，本試驗掃描16次能完全滿足測試要求。

2.2 核磁定量方法學考察

2.2.1 線性范圍試驗

按照1.2.1核磁供試品配制6個不同濃度的待測樣品，采集數(shù)據(jù)處理后，分別計算乙醇、乙酸與內(nèi)標峰面積的比值，將比值設(shè)為縱坐標；分別計算乙醇、乙酸與內(nèi)標的質(zhì)量比，將質(zhì)量比設(shè)為橫坐標進行線性回歸，得到乙醇回歸方程y=1.083 5x-0.006,R2=0.999 9(線性范圍64.05～0.32 mg/mL)，乙酸回歸方程y=8.365 5x-0.008 4，R2=0.999 8(線性范圍19.51～0.20 mg/mL),測試結(jié)果表明，TMSP為內(nèi)標測定乙醇、乙酸含量時，其線性關(guān)系良好。測試中S/N≥250時，測定結(jié)果的準確度可以得到保障，本試驗乙醇、乙酸的線性下限分別為0.32、0.20 mg/mL，在優(yōu)化條件下測試乙醇、乙酸的S/N均>250。

2.2.2 準確度試驗

按照1.2.1核磁供試品配制3個濃度的試驗樣品分別測定，計算乙醇、乙酸的含量，將實際值與理論值比較，計算回收率，乙醇回收率99.68%～100.65%，相對標準差(relative standard deviation,RSD)0.19%～0.37%；乙酸回收率98.38%～99.24%，RSD 0.59%～1.11%；平均回收率均在98.00%～102.00%，RSD< 2.00%。顯示該測試方法準確度良好。

2.2.3 重復性試驗

在優(yōu)化條件下對供試樣品(n=6)重復測定6次，采集的數(shù)據(jù)處理后計算乙醇、乙酸的含量，以乙醇、乙酸的含量計算其RSD值，分別為0.11%、0.99%，顯示該測試方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取5種發(fā)酵飲料供試品按2.1核磁供試品配制后存放在4 ℃冰箱于0、6、12、24、48 h測試，分別測得發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量，計算RSD值,乙醇為0.15%～1.32%，乙酸為0.24%～1.86%，結(jié)果顯示供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 專屬性試驗

取5種發(fā)酵飲料供試品按2.1核磁供試品配制后，采用二維核磁技術(shù)1H-13C HSQC、1H-1H COSY標準試驗對方法的專屬性進行考察[22]。1H-1H COSY結(jié)果顯示乙醇δ1.10 (t, CH3—)與δ3.49 (q, —CH2—)相關(guān)，且無其他雜質(zhì)信號干擾；乙酸δ1.80 (s, CH3—)在譜圖除自相關(guān)外無其他雜質(zhì)干擾。1H-13C HSQC結(jié)果顯示乙醇δ1.10與δ20.19、δ3.48與δ57.92相關(guān)無其他雜質(zhì)信號干擾；乙酸δ1.80 與δ25.06直接相關(guān)無其他雜質(zhì)信號干擾，測試圖譜見圖2，結(jié)果表明，本試驗方法專屬性強，可用于發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量測定。

a-1H-13C HSQC；b-1H-1H COSY圖2 樣品1H-13C HSQC、1H-1H COSY譜圖Fig.2 1H-13C HSQC and 1H-1H COSY spectrum of sample

2.2.6 氣相色譜法驗證試驗

本實驗采用目前醇、酸類物質(zhì)常用的檢測手段GC法對定量核磁共振測試結(jié)果進行驗證。試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飲料中可能存在與類乙醇的物質(zhì)難以實現(xiàn)分離，無法進行定量測定。故此，本實驗直接使用乙醇、乙酸標準品配制3個不同濃度的驗證樣品，使用上述優(yōu)化后的檢測方法，分別使用GC與q1H-NMR技術(shù)其進行含量測定，測試譜圖見圖3，測得結(jié)果見表1，結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。

A-乙醇；B-乙酸；C-乙醇和乙酸圖3 氣相色譜圖Fig.3 GC spectrum

表1 驗證試驗結(jié)果(n=3)單位：mg/mL

2.3 發(fā)酵飲品的測定結(jié)果

按照1.2.1核磁供試品配制，每個樣品平行3份，分別測得發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量，測試結(jié)果如表2所示。

表2 五種飲料中乙醇和乙酸的含量(n=3) 單位：mg/mL

3 結(jié)論

乙醇、乙酸常伴隨著果蔬的發(fā)酵產(chǎn)生，是衡量發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標，在發(fā)酵飲料生產(chǎn)、食用酒的釀造等領(lǐng)域都需要對其含量進行控制[23-24]。由于乙醇、乙酸物理化學性質(zhì)差異大、測試樣品成分復雜，采用GC、HPLC等技術(shù)難以同時對其進行測定。為此，本文通過q1H-NMR技術(shù)同時測定發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量，并對其進行了方法學考察，結(jié)果均顯示良好；發(fā)酵飲料成分繁雜，可能存在與二者沸點相近的化合物，使用GC法進行驗證試驗時，不論是樣品稀釋后檢測，還是將樣品蒸餾、稀釋后檢測，二者都不能同時測得；故使用標準物質(zhì)配制不同濃度的驗證樣品對q1H-NMR技術(shù)進行方法驗證，驗證結(jié)果無顯著差異。

在q1H-NMR試驗中，對核磁共振測試參數(shù)進行優(yōu)化，AQ為4.50 s，D1為20 s，NS為16次，以TMSP為內(nèi)標，測試溶劑選用DMSO-d6與H2O的混合溶劑，既節(jié)約成本又能更好溶解樣品，定量質(zhì)子信號峰不受溶劑信號干擾，保證了測試方法的穩(wěn)定性和檢測結(jié)果的準確性，每個試樣測試時間約為10 min，對比其他檢測方法在時間上具有競爭優(yōu)勢。試驗前測定發(fā)酵樣品的1H-NMR、1H-13C HSQC和1H-1H COSY譜圖，結(jié)果顯示乙酸信號1.80 ppm(s, CH3—)與乙醇信號1.10 ppm(t,CH3—)不受試樣中其他化合物的干擾，可作為二者的專屬測定峰。定量1H-NMR測定不需要分離過程、效率高、樣品前處理簡單，有效的減少樣品處理對測定結(jié)果的影響，在發(fā)酵生產(chǎn)中實時監(jiān)測乙醇、乙酸含量的變化具有較大優(yōu)勢，能有效的提高生產(chǎn)效率。本文通過q1H-NMR技術(shù)對5種發(fā)酵飲料中乙醇、乙酸的含量進行檢測，進一步提高q1H-NMR技術(shù)在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用，拓寬了醇、酸類物質(zhì)檢測手段，為今后發(fā)酵工藝的優(yōu)化、食用植物酵素產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供新的檢測手段。