基于染料Genefinder的熒光傳感體系檢測(cè)玉米赤霉烯酮

郭婷，陳金航，周鴻媛，張宇昊，馬良

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一種毒素[1]，廣泛存在于玉米、小麥、大米等谷物、飼料和動(dòng)物制品中。ZEN具有類(lèi)雌激素作用，進(jìn)而影響人體和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)[2-3]。此外，ZEN還具有免疫毒性、肝腎毒性及致癌性[4-5]。我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定小麥及玉米中ZEN含量不超過(guò)60 μg /kg，飼料中ZEN含量不超過(guò)500 μg/kg。目前，食品中ZEN的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6-10]、免疫法[11-14]、生物傳感器法[15-18]等。高效液相色譜法準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較高，但需要復(fù)雜的樣品前處理及昂貴的儀器設(shè)備，不能滿(mǎn)足食品安全快速檢測(cè)的要求。免疫分析法具有高效、快速的特點(diǎn)，但其會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題，并且抗體的制備周期較長(zhǎng)、穩(wěn)定性差，限制了該方法的應(yīng)用。

適配體是一種單鏈DNA或RNA，通過(guò)指數(shù)富集(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)系統(tǒng)篩選產(chǎn)生，能夠與靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合，穩(wěn)定且易制備，在4 ℃條件下能保存半年甚至更久，不會(huì)影響其結(jié)構(gòu)[19-21]，目前已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)及疾病診斷方面。HE等[22]利用適配體的特異性構(gòu)建基于內(nèi)濾效應(yīng)的熒光比率分析法檢測(cè)ZEN和伏馬毒素，該方法選擇性高，實(shí)際樣品加標(biāo)回收率在89.9%～106.6%。ZHANG等[23]通過(guò)SELEX法篩選出ZEN適配體，并建立基于納米金的無(wú)標(biāo)記可視化方法檢測(cè)ZEN。HE等[24]構(gòu)建基于納米材料和適配體的高靈敏的電化學(xué)傳感方法成功用于ZEN檢測(cè)，其中納米材料(CoSe2/AuNRs和DNA-PtNi@Co-MOF)的主要作用是放大檢測(cè)信號(hào)，該方法的檢出限為1.37 fg/mL。另有新型3D櫻花狀金屬有機(jī)框架材料也可用于電化學(xué)信號(hào)放大，該方法檢出限可達(dá)0.45 fg/mL[25]。本課題組也開(kāi)發(fā)了多種適配體熒光傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素、展青霉毒素等真菌毒素[26-28]。

Genefinder染料是一種新型花青素類(lèi)核酸染料，與雙鏈DNA作用后熒光會(huì)增強(qiáng)800～1 000倍，毒性低、靈敏度高[29-30]，可以有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境，常用于電泳中核酸染色[30-31]，在檢測(cè)方面的研究較少。因此，本研究利用核酸適配體的特異性，結(jié)合熒光染料Genefinder特殊的熒光特性構(gòu)建熒光傳感體系，用于簡(jiǎn)單、高靈敏、快速檢測(cè)ZEN。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外分光光度計(jì),日本島津公司；F-2500熒光分光光度計(jì),日本日立公司；臺(tái)式高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司。

ZEN適配體(5′-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3′)[32]，互補(bǔ)鏈(5′- TCAAATTAAAGATAATAATGTATTATAGAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；染料Genefinder，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；ZEN、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、單端孢霉烯(T-2)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；玉米粉購(gòu)于本地超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA濃度測(cè)定

DNA濃度以單鏈濃度表示，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA在260 nm處的吸光度，依據(jù)朗伯比爾定律(A=εbc)計(jì)算得DNA的濃度，于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光傳感器對(duì)ZEN的檢測(cè)

DNA備用溶液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫備用。將ZEN適配體與等體積等濃度互補(bǔ)鏈混合，再加入一定濃度ZEN孵育一段時(shí)間后，加入2 μL Genefinder100×，測(cè)定熒光光譜(激發(fā)波長(zhǎng)500 nm)。

1.2.3 實(shí)際樣品中ZEN的檢測(cè)

向玉米粉樣品中加入一定量ZEN，分別配成質(zhì)量濃度為5、20 μg/L的陽(yáng)性樣本。用90%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液超聲提取30 min，離心后取上清液，氮吹吹干后加入緩沖溶液，按照構(gòu)建的熒光傳感體系檢測(cè)ZEN。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

本研究利用Genefinder的特性構(gòu)建熒光傳感體系用于快速檢測(cè)ZEN。檢測(cè)原理圖如圖1-A，ZEN適配體與其互補(bǔ)鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，Genefinder染料與雙鏈結(jié)構(gòu)DNA作用后產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，當(dāng)加入毒素ZEN后，適配體優(yōu)先識(shí)別ZEN，雙鏈打開(kāi)，Genefinder染料熒光猝滅。首先研究方法的可行性，以500 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，觀察不同條件下體系熒光信號(hào)的變化情況。圖1-B顯示單鏈適配體(a)及互補(bǔ)鏈(b)與Genefinder作用后顯示出較微弱的熒光信號(hào)。ZEN適配體與其互補(bǔ)鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，Genefinder染料與雙鏈結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合后熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)(d)，加入毒素ZEN后，適配體與ZEN結(jié)合，雙鏈打開(kāi)，Genefinder染料熒光強(qiáng)度降低(e)。根據(jù)熒光強(qiáng)度的改變檢測(cè)目標(biāo)物ZEN的含量。

a-ZEN適配體+Genefinder;b-互補(bǔ)鏈+Genefinder;c-40 μg/L ZEN;d-ZEN適配體+互補(bǔ)鏈+Genefinder;e-ZEN適配體+互補(bǔ)鏈+40 μg/L ZEN+GenefinderA-傳感體系的檢測(cè)原理圖;B-不同條件下熒光光譜圖1 傳感體系原理圖及可行性分析Fig.1 Schematic of sensing system and feasibility

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 孵育時(shí)間

實(shí)驗(yàn)中適配體需要與目標(biāo)物孵育一段時(shí)間才能更好地識(shí)別目標(biāo)物。因此本試驗(yàn)研究孵育時(shí)間對(duì)熒光信號(hào)的影響。如圖2所示，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光猝滅量逐漸增強(qiáng)，當(dāng)孵育時(shí)間60 min時(shí)，熒光猝滅量達(dá)到最大，說(shuō)明體系中ZEN適配體與ZEN結(jié)合已達(dá)到飽和。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇60 min為最佳孵育時(shí)間。

圖2 孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of incubated time on the fluorescence注：F0和F分別表示沒(méi)有目標(biāo)物和添加目標(biāo)物時(shí)的熒光強(qiáng)度(下同)

2.2.2 適配體用量

適配體用量會(huì)影響熒光傳感體系的靈敏度。圖3顯示適配體濃度對(duì)熒光傳感體系的影響。結(jié)果表明，隨著ZEN適配體用量的增加，熒光猝滅程度迅速增加，當(dāng)適配體濃度達(dá)到100 nmol/L時(shí)，熒光猝滅量趨于穩(wěn)定。因此，適配體用量選擇100 nmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用量。

圖3 適配體用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of aptamer on the fluorescence

2.3 熒光傳感體系的構(gòu)建

在上述最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，以ZEN為目標(biāo)物構(gòu)建熒光傳感體系。結(jié)果如圖4-A所示，隨著ZEN濃度的增加，傳感體系熒光強(qiáng)度逐漸減弱，這是由于ZEN的加入破壞了雙鏈結(jié)構(gòu)，從而造成熒光減弱。然而當(dāng)ZEN濃度達(dá)到一定值時(shí)，熒光強(qiáng)度不再明顯降低，達(dá)到平衡。從圖4-B可以看出，1-F/F0與ZEN濃度的對(duì)數(shù)在0.1～200 μg/L呈線(xiàn)性關(guān)系，實(shí)際可檢測(cè)的檢出限為0.1 μg/L。結(jié)果表明該熒光傳感體系具有較高的靈敏度。

a-0 μg/L;b-0.1 μg/L;c-0.5 μg/L;d-1 μg/L;e-5 μg/L;f-10 μg/L;g-50 μg/L;h-100 μg/L;i-200 μg/L;j-500 μg/LA-不同濃度ZEN對(duì)所構(gòu)建傳感體系熒光響應(yīng)變化；B-1-F/F0與ZEN濃度對(duì)數(shù)的線(xiàn)性關(guān)系圖4 傳感體系對(duì)ZEN的熒光響應(yīng)Fig.4 Fluorescence resptnse of sensor with ZEN

2.4 熒光傳感體系選擇性

為了考察熒光傳感體系的選擇性，本研究以黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、赭曲霉毒素A(OTA)、單端孢霉烯毒素(T-2)為對(duì)照毒素研究該傳感體系的特異性，結(jié)果如圖5所示。加入40 μg/L ZEN時(shí)，熒光傳感體系的熒光強(qiáng)度猝滅量顯著增加，而加入同濃度的對(duì)照毒素并未造成熒光體系明顯的熒光猝滅，這是因?yàn)閭鞲畜w系中使用的適配體與ZEN可以特異性結(jié)合，而與其他毒素?zé)o明顯作用。結(jié)果表明該傳感體系對(duì)ZEN具有較好的選擇性。

圖5 方法選擇性Fig.5 Selectively of sensing system注：ZEN質(zhì)量濃度為40 μg/L，其他對(duì)照毒素質(zhì)量濃度均為40 μg/L

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

為了考察傳感體系實(shí)際測(cè)定效果，以玉米粉作為實(shí)際陰性樣品，研究加標(biāo)回收情況。結(jié)果如表1所示，利用傳感體系檢測(cè)的加標(biāo)回收率在100.4%～105.8%，這說(shuō)明該熒光傳感體系可用于真實(shí)復(fù)雜樣品中ZEN的測(cè)定。

表1 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種基于Genefinder和適配體的熒光傳感體系檢測(cè)ZEN，在最優(yōu)條件下，傳感體系的線(xiàn)性范圍為0.1～200 μg/L，實(shí)際檢出限為0.1 μg/L，并成功用于出玉米粉中ZEN的測(cè)定，加標(biāo)回收率在100.4%～105.8%。本方法為開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的生物傳感體系開(kāi)辟了新的途經(jīng)。