羊肚菌蛋白水解物及其硒化衍生物的細(xì)胞保護作用和安全性研究

張強，王夢錦，馬玉涵，孫玉軍，王松華

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽，233100)

硒(Se)是人類和動物必需的微量元素。它是硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、碘甲狀腺原氨酸脫碘酶、甲酸脫氫酶和硒代磷酸合成酶等許多含硒蛋白酶的關(guān)鍵活性成分，這些酶在DNA合成、甲狀腺激素代謝、生殖以及細(xì)胞保護等方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-3]。硒具有抗氧化、抗炎、免疫刺激、抗病毒、預(yù)防心血管和神經(jīng)退行性疾病等多種生理功能[3-4]。人體內(nèi)的硒有助于預(yù)防和治療克山病、大骨節(jié)病、心血管疾病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、糖尿病以及癌癥等多種人體疾病[5-6]。然而，硒缺乏現(xiàn)象在大多數(shù)國家普遍存在[3,7]。在中國，大約51%的土壤中硒缺乏，39%～61%的人口每天硒攝入量偏低[8]。因此，補硒成為近年來營養(yǎng)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點問題之一。

硒補充劑分為無機硒(如亞硒酸鈉)和有機硒(如硒多糖、硒蛋白等)2種。與無機硒相比，有機硒具有毒性低、生物利用率高、生物活性強等優(yōu)點，受到了營養(yǎng)和食品學(xué)家的普遍關(guān)注[9]。有機硒既可以通過富硒培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，也可以通過分子修飾法進(jìn)行人工合成。生物轉(zhuǎn)化法制備的有機硒含硒量偏低，生產(chǎn)周期也比較長。因此，有機硒的人工合成引起了人們的極大興趣[3]。多糖[10]、蛋白質(zhì)[6]、肽聚糖[11]和維生素[5]等多種生物活性物質(zhì)的硒化修飾已被廣泛報道。它已成為制備有機硒和改進(jìn)活性物質(zhì)功能特性的一種非常有前途的方法。但相關(guān)研究主要集中在修飾工藝的優(yōu)化、硒化產(chǎn)物的表征以及體外生物活性的評估等方面。迄今為止，通過硒化修飾制備的有機硒的細(xì)胞保護作用和安全性的研究尚未見報道。

羊肚菌(Morchellaesculenta)是世界上最有價值的藥食兩用真菌之一。羊肚菌蛋白是開發(fā)功能性食品的優(yōu)良原料，但目前還沒有得到充分利用。先前的研究表明，與原羊肚菌蛋白水解物(morchella protein hydrolysate，MPH)相比，在微波輔助下合成的硒化羊肚菌蛋白水解物(Se-MPH；硒含量59.0 mg/g)，其抗氧化、降血糖和酪氨酸酶抑制活性均顯著增強[12]。本文擬在前期研究的基礎(chǔ)上，探討MPH和Se-MPH對H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護作用及其機制；借助細(xì)胞毒性試驗、紅細(xì)胞溶血實驗、細(xì)菌回復(fù)突變(bacterial reverse mutation, Ames )試驗和雞胚絨毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)試驗評估了MPH和Se-MPH的安全性。本研究將為開發(fā)利用MPH和Se-MPH新型功能性成分提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Caco-2細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)試劑，美國Gibco公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量檢測、基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 (terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)的細(xì)胞凋亡檢測、總蛋白質(zhì)提取和定量的試劑盒以及增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescent system, ECL)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；抗體(一抗和二抗)，Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 MPH和Se-MPH的制備

MPH的制備參照先前報道的方法[13-14]。將羊肚菌菌絲體在25 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)72 h。然后，采用堿提(pH 12.0)酸沉(pH 4.1)法提取羊肚菌蛋白。用木瓜蛋白酶，在pH 6.0、[E]/[S]為2%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間3 h的條件下水解羊肚菌蛋白，即得MPH。

Se-MPH的制備采用微波輔助法[12]。按Na2SeO3與MPH(質(zhì)量比4∶1)向質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的MPH中加入Na2SeO3，調(diào)節(jié)pH至5.0。將50 mL上述溶液置于密閉容器中，在250 W功率水平下微波加熱20 min(工作模式：4 min on，5 min off)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，轉(zhuǎn)入截留分子質(zhì)量300 Da的透析袋中，用蒸餾水透析48 h。將袋中溶液于4 000×g離心15 min，上清液凍干，得Se-MPH。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

Caco-2細(xì)胞解凍后接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的達(dá)爾伯克氏改良伊戈爾培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為探討MPH和Se-MPH對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護作用及其機制，細(xì)胞分組如下：(1)對照組(control)：正常Caco-2細(xì)胞；(2)模型組(model)：用完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用300 μmol/L H2O2處理細(xì)胞6 h；(3)MPH組：用250 μg/mL MPH預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用300 μmol/L H2O2處理細(xì)胞6 h；(4)Se-MPH：用250 μg/mL Se-MPH預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用300 μmol/L H2O2處理細(xì)胞6 h；(5)陽性對照組(VC)：用250 μg/mL VC預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用300 μmol/L H2O2處理細(xì)胞6 h。

1.4 細(xì)胞ROS水平和MDA含量的測定

細(xì)胞經(jīng)分組處理后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌1次，收集細(xì)胞，加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10 μmol/L的2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2飽和濕度)內(nèi)孵育20 min。以無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，用流式細(xì)胞儀(Ex=488 nm;Em=530 nm)檢測細(xì)胞ROS水平。至于MDA含量的測定，將處理后的細(xì)胞用冷的PBS洗滌1次，在1 000 μL PBS溶液中超聲處理2 min，離心(4 ℃、13 000×g)10 min。收集上清液，采用MDA檢測試劑盒，根據(jù)說明書的指導(dǎo)，檢測MDA含量。

1.5 細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測

采用TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。簡言之，先對處理結(jié)束后的各組細(xì)胞進(jìn)行爬片處理，然后用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次。將細(xì)胞用1%Triton X-100在室溫下透化處理15 min，PBS洗滌3次。加入100 μL TUNEL反應(yīng)混合液，于37 ℃溫育60 min，用PBS洗滌3次。用100 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)工作液于暗處在37 ℃條件下將細(xì)胞核染色5 min，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)分析

根據(jù)使用說明書，用總蛋白質(zhì)提取試劑盒提取各組Caco-2細(xì)胞的總蛋白，用二辛可寧酸 (bicinchoninicacid, BCA)蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%)分離蛋白，在300 mA恒流90 min條件下，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用Tris-鹽酸洗膜緩沖液(Tris-buffered saline-Tween 20，TBST)洗膜(10 min×3次)，并用50 g/L的脫脂乳封閉液封閉處理1.5 h，再次用TBST洗膜(10 min × 3次)。將膜轉(zhuǎn)入孵育盒中，加入一抗，于4 ℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗，TBST洗膜(10 min×3次)，加入二抗，室溫孵育1.5 h。TBST洗膜(10 min×3次)，使用ECL試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，通過Gel-Pro32軟件，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參定量各蛋白的表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞毒性檢測

細(xì)胞毒性的測定參照HONG等[15]的方法并稍作修改。將Caco-2細(xì)胞(1 × 105個/mL)接種在96孔板(每孔100 μL)，并置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)液，用不同濃度的樣品進(jìn)行處理。處理結(jié)束后，每孔加入20 μL 噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT](5 mg/mL)，繼續(xù)孵育3 h。棄上清，細(xì)胞用PBS洗滌后向每孔加入150 μL 二甲基亞砜，在搖床中振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值。

1.8 紅細(xì)胞溶血實驗

溶血活性測定參照HOU等[16]的方法并稍作修改。用抗凝管從小鼠眼球取新鮮血液，4 ℃、3 000 r/min離心5 min。小心吸棄上層清液，加入約下層紅細(xì)胞5倍體積的PBS溶液，并按上述方法重新離心清洗3次。將所得紅細(xì)胞用PBS配成體積分?jǐn)?shù)4%的細(xì)胞懸液，向10 mL離心管中依次加入2 mL細(xì)胞懸液，2 mL不同濃度的樣品溶液，然后置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，小心吸出上層溶液，測定其在540 nm的吸光度值，以PBS代替樣品作為陰性對照，0.1%的Triton X-100代替樣品作為陽性對照。樣品管的吸光度為A，陰性對照管的吸光度為A0，陽性對照管的吸光度為AT,溶血率計算如公式(1)所示：

(1)

1.9 Ames試驗

按照GB 15193.4—2003的方法進(jìn)行試驗。選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102共4個標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用標(biāo)準(zhǔn)平皿摻入法進(jìn)行測試。受試藥物設(shè)置5 000、2 500、500和100 μg/皿4個劑量組，另設(shè)陽性對照組[敵克松(Dixon)：50 μg/皿；NaN3：3 μg/皿；2-氨基芴(2-aminofluorene，2-AF)：20 μg/皿]和陰性對照組(生理鹽水)，在加和不加S9的條件下進(jìn)行試驗，每個濃度設(shè)3個平行皿，試驗重復(fù)2次。其具體為：向2 mL融化并保溫在45 ℃的上層培養(yǎng)基中依次加入細(xì)菌培養(yǎng)液0.1 mL，受試物溶液0.1 mL，S9混合液或磷酸鹽貯備液0.5 mL，立即混勻，迅速倒于底層培養(yǎng)基表面，使之均勻分布，水平放置，凝固后于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，記錄回復(fù)突變菌落數(shù)。

1.10 CAM試驗

CAM試驗參照LAI等[17]的方法并稍作修改。將受精蛋在(37±0.5) ℃、相對濕度65%的條件下孵化6 d。然后，在無菌操作下，用牙科鉆在氣室處打一個直徑約1 cm的小孔，并去除蛋殼膜以露出CAM。將直徑約5 mm的無菌濾紙放置在CAM上，用滅菌透明膠封口，繼續(xù)孵育24 h。用微量注射器將0.1 mL樣品加到濾紙上，連續(xù)加樣3 d。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%和4%的SDS為陽性對照，0.9%生理鹽水為陰性對照。在第10天，用固定液[V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1)]對雞胚絨毛尿囊膜進(jìn)行固定，制成尿囊膜標(biāo)本，用相機拍照記錄實驗結(jié)果。

1.11 數(shù)據(jù)分析

無特殊說明，實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用

當(dāng)前，蛋白水解物抗氧化活性的研究大多數(shù)局限于體外化學(xué)實驗?zāi)Ｐ?，對其在生物系統(tǒng)中的抗氧化作用知之甚少。因此，本研究利用Caco-2細(xì)胞探討了MPH和Se-MPH對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用。

ROS(超氧陰離子自由基、羥基自由基和過氧化氫等)生成是氧化應(yīng)激的一個重要指標(biāo)[18]。在氧化應(yīng)激條件下，ROS生成與細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御之間的平衡被破壞。ROS的過量產(chǎn)生會誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，破壞膜脂、蛋白質(zhì)和核酸，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[19]。因此，我們首先研究了MPH和Se-MPH對H2O2處理的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。由圖1-A、圖1-B可知，模型組的ROS生成量明顯高于對照組(P<0.05)，表明H2O2引發(fā)了Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激；與模型組比較，MPH、Se-MPH或VC處理組顯著降低了H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞ROS生成(P<0.05)，提示MPH和Se-MPH可減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

脂質(zhì)過氧化作為ROS在生物體內(nèi)引發(fā)的主要現(xiàn)象之一，會加劇細(xì)胞的氧化損傷。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化的主要副產(chǎn)物和細(xì)胞膜氧化的生物標(biāo)志物，會進(jìn)一步擴大ROS的作用，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，破壞核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，并導(dǎo)致各種人體疾病[20-21]。MPH和Se-MPH對模型細(xì)胞MDA水平的影響如圖1-C所示。由圖1-C可以看出，伴隨ROS的生成，模型組的MDA水平明顯高于對照組(P<0.05)。用MPH、Se-MPH或VC預(yù)處理模型細(xì)胞顯著降低了H2O2誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(P<0.05)。這表明，MPH和Se-MPH可以抑制模型細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而保護細(xì)胞免受氧化損傷。

上述實驗結(jié)果表明，MPH和Se-MPH可以阻止ROS產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化，從而減輕了細(xì)胞的氧化應(yīng)激及由此造成的細(xì)胞損傷。MPH和Se-MPH對Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用可能與其所具有的還原性和自由基清除活性有關(guān)，這些活性在之前的研究中已經(jīng)得到證實[12]。

Nrf2信號通路可以幫助細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激，維持氧化還原平衡，并在與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種人類疾病中發(fā)揮重要作用[22-23]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化劑、親電試劑、某些疾病以及外源性天然小分子物質(zhì)的刺激時，Nrf2信號通路被激活，誘導(dǎo)II相解毒酶和抗氧化酶[如血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶1(NQO1)]的表達(dá)，從而引發(fā)細(xì)胞的抗氧化響應(yīng)，保護機體免受氧化損傷[24]。一些研究表明，多酚[25]、酚苷[24]和姜黃素[26]等各種天然抗氧化劑可通過激活Nrf2信號通路來保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。為進(jìn)一步闡明MPH和Se-MPH對細(xì)胞氧化應(yīng)激保護作用的分子機制，采用Western blot方法研究了MPH和Se-MPH對Nrf2信號通路的影響(圖2)。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)，表明H2O2在誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的同時也會促進(jìn)Nrf2細(xì)胞信號通路的激活；與模型組相比，MPH、Se-MPH或VC處理組細(xì)胞中Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步顯著增加(P<0.05)，提示Nrf2細(xì)胞信號通路的激活可能是MPH和Se-MPH發(fā)揮對Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激保護作用的一個重要機制。

A-ROS水平的流式結(jié)果；B-ROS相對水平；C-MDA相對水平圖1 MPH和Se-MPH對H2O2處理的Caco-2細(xì)胞ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化的影響Fig.1 Effects of MPH and Se-MPH on ROS production and lipid peroxidation in H2O2-treated Caco-2 cells注:*為與對照組相比差異顯著(P < 0.05)，#為與模型組相比差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護作用

細(xì)胞凋亡在機體生長、發(fā)育的調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持等許多生理過程中發(fā)揮著重要作用。癌癥、自身免疫疾病以及神經(jīng)退行性疾病等諸多疾病的發(fā)生與細(xì)胞增殖和凋亡間的不平衡密切相關(guān)[27]。許多研究已經(jīng)證實，天然抗氧化劑可通過抑制細(xì)胞凋亡來保護細(xì)胞免受氧化損傷[24-25,28]。因此，本研究探討了MPH和Se-MPH對H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞凋亡的影響。TUNEL染色(圖3-A)顯示，與對照組相比，模型組TUNEL陽性細(xì)胞(綠色)顯著增加；與模型組相比，MPH、Se-MPH或VC處理組的TUNEL陽性細(xì)胞顯著下降。這表明，MPH和Se-MPH可通過抑制細(xì)胞凋亡而保護細(xì)胞免受氧化損傷。

細(xì)胞凋亡受上游B細(xì)胞淋巴瘤白血病2 (B celllymphoma leukemia 2, Bcl-2)家族[促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和抗凋亡蛋白Bcl-2]和下游caspase家族[細(xì)胞凋亡執(zhí)行者半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (cysteine-aspartic acid protease-3, caspase-3)]蛋白的調(diào)節(jié)[29]。因此，為探索MPH和Se-MPH潛在的抗凋亡機制，本研究以GAPDH為內(nèi)參，用Western blot檢測了這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(圖3-B)。由圖3-B可知，與對照組相比，模型組Bax和caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；然而，與模型組相比，用MPH、Se-MPH或VC預(yù)處理細(xì)胞顯著逆轉(zhuǎn)了Bax，Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)，提示MPH和Se-MPH能通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，這與CHANG等[24]在酚苷以及JIANG等[30]在多糖上的研究結(jié)果一致。

A-Western blot檢測Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)；B-Nrf2相對含量；C-NQO1相對含量；D-HO-1相對含量圖2 MPH和Se-MPH對Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of MPH and Se-MPH on protein expressions of Nrf2, NQO1, and HO-1 under oxidative stress

A-TUNEL法檢測的細(xì)胞凋亡(×200)；B-細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot分析和各蛋白表達(dá)水平的定量圖3 MPH和Se-MPH對細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of MPH and Se-MPH on cell apoptosis and apoptosis-related protein expression

2.3 MPH和Se-MPH的安全性

2.3.1 細(xì)胞毒性

細(xì)胞活力或細(xì)胞毒性試驗是評估活性化合物或藥物體外毒性的最常用的檢測方法之一，因為這些物質(zhì)可能導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷[31]。不同濃度的MPH和Se-MPH與Caco-2細(xì)胞孵育后的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，與對照相比，在測試濃度條件下，用MPH或Se-MPH處理的細(xì)胞活力未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，表明MPH和Se-MPH沒有細(xì)胞毒性。類似地，GOMEZ等[28]研究發(fā)現(xiàn)，濃度低于0.2 mg/mL的紅羅非魚內(nèi)臟水解物對Caco-2細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用；XU等[32]研究證實，富硒大米蛋白水解物在濃度高達(dá)160 μg/mL時不會對PC12和RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

圖4 MPH和Se-MPH對Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性Fig.4 Cytotoxic activity of MPH and Se-MPH towards Caco-2 cells

2.3.2 溶血活性

紅細(xì)胞溶血實驗是體外檢測受試物安全性的可靠方法之一，常用于體內(nèi)毒理學(xué)評價之前的細(xì)胞刺激性評估[33]。一般認(rèn)為受試物的溶血率在20%以下即為無刺激性；溶血率低于5%，即適用于血液環(huán)境[17,34]。本研究對MPH和Se-MPH作用于小鼠紅細(xì)胞的溶血活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，MPH和Se-MPH的溶血率均低于5%，表明MPH和Se-MPH對紅細(xì)胞沒有造成損傷，即MPH和Se-MPH具有良好的血液相容性。

圖5 MPH和Se-MPH對小鼠紅細(xì)胞的溶血活性Fig.5 Hemolytic activity of MPH and Se-MPH toward mouse erythrocytes

2.3.3 體外致突變活性

Ames試驗是一種快速靈敏的檢測受試物致突變或致癌作用的體外實驗技術(shù)，常用于評估受試物的遺傳毒性效應(yīng)[35]。一般認(rèn)為受試物的回復(fù)突變菌落數(shù)與陰性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)的比值即回復(fù)突變率≥2時，試驗結(jié)果為陽性[36]。MPH和Se-MPH的Ames試驗結(jié)果見表1。在4種試驗濃度下，無論是否加S9， 4株試驗菌(TA97、TA98、TA100和TA102)的回復(fù)突變率均小于2，且均未發(fā)現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，而各陽性對照組均顯示出強烈的誘變作用(回復(fù)突變率遠(yuǎn)大于2)，與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。這些結(jié)果表明，在本研究條件下，MPH和Se-MPH均無致突變活性。

表1 Ames實驗結(jié)果Table 1 The results of Ames test

2.3.4 CAM試驗結(jié)果

CAM試驗已被廣泛用于評估藥物、殺蟲劑和許多其他化學(xué)物質(zhì)的急性毒性、炎癥反應(yīng)以及促新血管生成潛力[37]。由于CAM試驗操作相對簡單、快速，低成本，且不涉及動物倫理學(xué)問題，已逐漸取代殘酷的Draize眼刺激性試驗，常用于化妝品和眼用制劑的安全性研究[37-38]。MPH和Se-MPH的CAM試驗結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，陰性對照組的雞胚血管網(wǎng)絡(luò)明顯，形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)清晰，無出血和滲血現(xiàn)象出現(xiàn)；陽性對照組中低劑量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)SDS處理的雞胚血管網(wǎng)絡(luò)不清晰，形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)模糊，末端血管有明顯的出血現(xiàn)象，高劑量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%)SDS處理的雞胚血管網(wǎng)絡(luò)消失，蛋白質(zhì)變性，雞胚明顯死亡；而用MPH和Se-MPH處理的雞胚，無論低劑量還是高劑量，在血管的形態(tài)學(xué)方面均未發(fā)現(xiàn)明顯的變化，也未觀察到明顯的出血和滲血現(xiàn)象。上述結(jié)果表明,MPH和Se-MPH對雞CAM的組織細(xì)胞無毒性和刺激性。

圖6 CAM模型血管形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Photographs from CAM assay taken during morphological observation of chick embryo blood vessels

3 結(jié)論

MPH和Se-MPH可通過減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激和抑制凋亡來保護Caco-2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。這種保護作用可能主要歸因于Nrf2信號通路的激活和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。安全性評估結(jié)果表明，MPH和Se-MPH無細(xì)胞毒性、溶血活性和致突變活性，在CAM試驗中不會引起雞胚血管形態(tài)改變和出血，即MPH和Se-MPH對雞胚血管沒有毒性和刺激性，具有良好的安全性。因此，MPH和Se-MPH有望作為潛在的營養(yǎng)/功能性成分或醫(yī)藥成分在醫(yī)療保健領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。