遠(yuǎn)紅外對黃曲霉孢子的殺滅效果及其機(jī)理研究

季萌萌，蔣婧，范柳萍,2*，李靜

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷，223800) 3(百事美特食品宿遷有限公司，江蘇 宿遷，223800)

大米是我國主要糧食作物之一，每年全世界的糧食因霉變而造成的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過總產(chǎn)量的3%；其中黃曲霉及黃曲霉毒素污染危害最大，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的主要代謝產(chǎn)物[1]，毒性極強(qiáng)，具有致癌、致畸和致突變作用，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)認(rèn)定為 Ⅰ 類致癌物質(zhì)，其污染水平受到各國嚴(yán)格控制[2]，嚴(yán)重威脅糧食安全和人類健康。

遠(yuǎn)紅外輻照(far infrared irradiation，F(xiàn)IR)是一項(xiàng)熱技術(shù)，由于FIR范圍(3～1 000 μm)內(nèi)的大多數(shù)入射輻射能量都在食品表面吸收，F(xiàn)IR適用于食品的表面加熱，且作為一種安全、非化學(xué)且快速的表面殺菌方法，被認(rèn)為是常規(guī)化學(xué)消毒品如甲基溴的潛在替代品[3]。已有報(bào)道紅外輻照技術(shù)對谷物表面蠟狀芽孢桿菌[4]、中溫細(xì)菌[5]、嗜溫需氧菌[6]等細(xì)菌的殺滅作用，以及對谷物表面霉菌的滅活效果，劉其聳等[7]報(bào)道松花粉在遠(yuǎn)紅外100 ℃加熱15 min或110 ℃加熱10 min 后，霉菌酵母數(shù)分別降低99.71%和99.73%；WILSON等[8]發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)紅外處理在降低玉米水分含量的同時(shí)還能顯著減少表面霉菌總數(shù)；王蓓[9]報(bào)道新收獲的初始水分含量高于21.1% 的稻谷經(jīng)遠(yuǎn)紅外輻射至60 ℃,保溫120 min后水分去除率最高為5.3%，且黃曲霉孢子對數(shù)值可降低達(dá)8.3 lg CFU/g。

紅外線位于電磁波譜中的紫外線和微波之間，其殺菌機(jī)制類似于紫外線(DNA損傷)和微波加熱(感應(yīng)加熱)，主要依靠熱效應(yīng)及特征吸收[10]。目前認(rèn)為遠(yuǎn)紅外的熱效應(yīng)會破壞微生物細(xì)胞中的DNA、RNA、核糖體、細(xì)胞包膜和蛋白質(zhì)，但作用機(jī)理尚不清楚，且關(guān)于遠(yuǎn)紅外對黃曲霉產(chǎn)AFB1能力的影響鮮有報(bào)道。本文以接種黃曲霉孢子的大米為原料，在紅外發(fā)射波長5～15 μm，以及前期確定遠(yuǎn)紅外輻照最適條件115 ℃ 加熱5 min的條件下[11]，研究遠(yuǎn)紅外輻照對大米表面黃曲霉孢子的殺滅效果以及對黃曲霉菌產(chǎn)AFB1能力的影響，同時(shí)測定其對黃曲霉孢子活力抑制率，觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)、膜通透性及胞內(nèi)蛋白的變化，旨在為遠(yuǎn)紅外殺菌機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

黃曲霉菌AspergillusflavusCGMCC 3.4408，中國微生物菌種保藏管理中心；孟加拉紅培養(yǎng)基，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 試驗(yàn)材料

粳米(二級，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.31%)，上海祥森米業(yè)有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，以色列Fementek公司；碘化丙啶(propidium iodide, PI)、噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)，BD公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

遠(yuǎn)紅外層式烘箱，上海熱麗科技集團(tuán)有限公司研制；Waters e2695型高效液相色譜儀(配有熒光檢測器)，美國Waters公司；1510型全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；DMi8型倒置生物熒光顯微鏡，德國Leica公司；XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡，荷蘭Philips公司；MOS-450型圓二色譜儀，法國Biologic公司；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；LHS-150HC-1型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MQD-S2R型振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；UltraScan Pro1166型高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大米樣品前處理

將已接種黃曲霉菌孢子的PDA培養(yǎng)基斜面試管置于28 ℃、濕度為70%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)7 d，用無菌生理鹽水沖洗斜面并收集孢子，過濾菌絲得到孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子懸液濃度為106CFU/mL。

稱取適量大米，通過加入不同體積的孢子懸液配制不同含水率(moisture content，MC)的樣品，充分混勻，4 ℃放置24 h，使水分平衡，選取含水率為(30.05±0.33)% 和(20.11±0.16)% 的樣品作為試驗(yàn)對象。

1.2.2 遠(yuǎn)紅外輻照與黃曲霉孢子殺菌效率測定

設(shè)置2個(gè)對照組：含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、30%但未經(jīng)遠(yuǎn)紅外輻照處理的大米樣品，表示為20%-對照、30%-對照；2個(gè)處理組：含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、30%且經(jīng)遠(yuǎn)紅外輻照的大米樣品，表示為20%+FIR、30%+FIR；取水分平衡后樣品單層鋪設(shè)于托盤，置于遠(yuǎn)紅外烘箱中，以115 ℃輻照處理5 min后蓋上蓋子并立即取出，放置冷卻室溫，分別收集對照組與處理組的大米樣品于不同無菌均質(zhì)袋中，加入一定體積無菌生理鹽水，利用拍打式均質(zhì)器均質(zhì)2 min，洗脫大米表面黃曲霉孢子于均質(zhì)液中，分別作為對照組和處理組均質(zhì)液，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次平行；

殺菌效率測定參考文獻(xiàn)[11]，用微生物對數(shù)降低值(lgS)表示。

1.2.3 遠(yuǎn)紅外輻照黃曲霉孢子培養(yǎng)及AFB1提取

取1.2.2中對照組與處理組均質(zhì)液等量分別于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，濾紙過濾收集發(fā)酵液和菌絲體，菌絲體以蒸餾水洗滌3次，55 ℃烘干至恒重，稱重得菌絲體干重；發(fā)酵液中AFB1提取參照文獻(xiàn)方法[11]，采用高效液相色譜-柱前衍生法測定；

單位菌體產(chǎn)毒量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

產(chǎn)AFB1抑制率與單位菌體產(chǎn)毒抑制率計(jì)算如公式(2)、公式(3)所示：

(2)

單位菌體產(chǎn)毒抑制率/%

(3)

1.2.4 遠(yuǎn)紅外輻照黃曲霉孢子PI染色

處理組與對照組均質(zhì)液于6 000 r/min離心10 min，除去上清液，沉淀物用PBS洗滌2次后重懸，調(diào)整濃度為106CFU/mL，與PI溶液以1∶10的體積比混勻，室溫靜置10 min，倒置生物熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為488 nm。

1.2.5 遠(yuǎn)紅外輻照黃曲霉孢子掃描電鏡結(jié)果觀察

均質(zhì)液6 000 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀物用PBS溶液洗滌2次后懸浮于10 mL PBS溶液中，加入預(yù)冷無菌的2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液10 mL，4 ℃預(yù)固定0.5 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液。參照蔡雪薛[12]的方法制備樣品，在15 kV發(fā)射場環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察孢子并拍照。

1.2.6 遠(yuǎn)紅外輻照黃曲霉孢子活力測定

測定前配制MTT溶液：37 ℃溫浴溶解于0.01 mol/L、pH 7.4的PBS溶液中，質(zhì)量濃度5 mg/mL，過濾除菌，置棕色小瓶中，4 ℃冰箱保存將均質(zhì)液離心(6 000 r/min,10 min)棄上清液， PBS溶液洗滌2次后重新懸浮于PBS溶液中，調(diào)整孢子濃度為2×107CFU/mL。將100 μL孢子懸液加入96孔板中，加入25 μL MTT，28 ℃避光靜置孵育4 h 后加入150 μL 二甲基亞砜，以蒸餾水設(shè)置為空白組對照，酶標(biāo)儀測定吸收波長在565 nm下的吸光度值。黃曲霉孢子線粒體膜上結(jié)合的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，甲瓚在565 nm下的吸光值與細(xì)胞活性成正比[13]，利用吸光值變化計(jì)算抑制率，計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

1.2.7 遠(yuǎn)紅外輻照黃曲霉孢子胞內(nèi)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)測定

均質(zhì)液6 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入無菌水洗滌離心2次重懸于0.6 mL無菌水中，參照陶曉赟[14]的方法提取胞內(nèi)蛋白。為研究紅外結(jié)合保溫過程對胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，遠(yuǎn)紅外115 ℃輻照含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的樣品5 min后，在70 ℃下保溫15 min，并表示為20%+FIR+保溫。圓二色譜儀測定以蒸餾水為空白，掃描波長范圍為250～190 nm，掃描速度30 nm/min，掃描溫度25 ℃，重復(fù)3次，記錄圓二色譜(circular dichroism，CD)。采用SELCON3分析法分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0和 Origin 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉孢子生長與產(chǎn)毒能力的影響

由前期研究可知[11]，遠(yuǎn)紅外115 ℃處理5 min后，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%和20%的大米表面黃曲霉孢子對數(shù)降低值分別為(2.96±0.28)lgS、(2.04±0.17)lgS。由表1可知，30%和20%含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)大米遠(yuǎn)紅外處理后，發(fā)酵液中AFB1總量分別下降63.34%和56.61%，單位菌體產(chǎn)毒量分別下降38.94%和27.64%。遠(yuǎn)紅外輻照后，大米中黃曲霉孢子再培養(yǎng)時(shí)生長受到明顯限制，產(chǎn)毒能力受到顯著抑制(P<0.05)，且水分含量較高的大米在紅外處理后孢子損傷效果更為明顯。這是因?yàn)樗趾颗c水分活度呈正相關(guān)，有報(bào)道紅外加熱滅活細(xì)菌芽孢效果與IR加熱器的輻射光譜和初始Aw值有關(guān)[4, 15]；且報(bào)道谷物初始含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.98%～27%，熱效應(yīng)滅活黃曲霉孢子的對數(shù)值隨水分含量的增加而升高[16-19]。

表1 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉菌生長與產(chǎn)毒能力的作用Table 1 Effect of FIR on growth and toxin production ability of Aspergillus flavus

2.2 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉孢子細(xì)胞膜的影響

PI是一種核酸結(jié)合的熒光探針，僅能穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，致使胞核染色[20]。由圖1-a、圖1-b可知，遠(yuǎn)紅外輻照前，黃曲霉孢子為活細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，PI染料無法著色，而圖1-c、圖1-d中，處理后出現(xiàn)明顯紅色熒光，說明細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞核被染色。圖1-d中的熒光強(qiáng)度較圖1-c的熒光強(qiáng)度高，說明遠(yuǎn)紅外處理水分含量較高的大米后，著色細(xì)胞數(shù)目增加。PI染色結(jié)果證明大米中水分含量越高，遠(yuǎn)紅外處理后黃曲霉孢子的損傷越嚴(yán)重。這可能是由于高水分活度下微生物細(xì)胞膜對熱敏感性增強(qiáng)[21]，且報(bào)道指出磷酸緩沖液中大腸桿菌RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁對紅外加熱的耐受性較傳導(dǎo)加熱的熱效應(yīng)更差[22]。

a、b-對照組，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、30%；c、d-FIR處理組，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、30%圖1 黃曲霉孢子PI染色結(jié)果Fig.1 The results of PI staining of A.flavus spores

2.3 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉孢子顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖2顯示的是遠(yuǎn)紅外輻照前后黃曲霉孢子的掃描電鏡圖。未處理前孢子呈球形，表面粗糙，形狀飽滿，輪廓分明；遠(yuǎn)紅外處理后，孢子皺縮凹陷、部分嚴(yán)重破碎，胞內(nèi)物泄露，這可能是因?yàn)檫h(yuǎn)紅外輻射引起的熱效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞或破損。紫外輻照和近紅外加熱相結(jié)合處理后鼠傷寒沙門氏菌與大腸桿菌的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，2種病原體的細(xì)胞包膜被顯著破壞[23]。MEENU等[24]發(fā)現(xiàn)利用紅外處理綠豆表面的黑曲霉與黃曲霉孢子后，其形態(tài)變得更光滑，完全破裂，細(xì)胞內(nèi)含物泄漏到表面。

a-未經(jīng)FIR處理；b-20%+FIR；c-30%+FIR圖2 黃曲霉孢子掃描電鏡顯微圖Fig.2 Scanning electron microscope pictures of A.flavus spores

2.4 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉孢子活力影響

MTT測定結(jié)果如表2所示，遠(yuǎn)紅外115 ℃處理5 min后OD565下降，大米含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%和30%時(shí)，遠(yuǎn)紅外對黃曲霉孢子的抑制率分別達(dá)到38.27% 和57.36%，結(jié)果表明孢子活力受抑制程度隨水分含量增加而增大。蛋白質(zhì)的紅外吸收范圍在3～4 μm和6～9 μm[25]，在本研究波長范圍內(nèi)對遠(yuǎn)紅外有特定吸收，可引起其線粒體上琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)的變性，細(xì)胞呼吸受阻，活力降低甚至死亡[26]。國外相關(guān)研究報(bào)道近紅外輻射(850 nm)對大鼠中琥珀酸脫氫酶活性具有顯著調(diào)節(jié)作用[27]；遠(yuǎn)紅外對小鼠黑素癌細(xì)胞的細(xì)胞活力有明顯毒性作用并致使其下降[28]。

表2 遠(yuǎn)紅外輻照后OD565值與黃曲霉孢子活力抑制率Table 2 OD565 and inhibition rate of A.flavus spores′ viability after FIR treatment

2.5 遠(yuǎn)紅外輻照對黃曲霉孢子胞內(nèi)蛋白二級結(jié)構(gòu)影響

黃曲霉孢子胞內(nèi)蛋白各二級結(jié)構(gòu)的相對含量變化曲線如圖3所示，圓色譜紫外區(qū)段(190～240 nm)的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)胞內(nèi)蛋白在208、222 nm處呈強(qiáng)負(fù)吸收峰，反映了典型α-螺旋構(gòu)象；β-折疊在217～218 nm處呈負(fù)峰，無規(guī)則卷曲在198 nm附近有1個(gè)負(fù)峰，在220 nm附近有正峰。

圖3 黃曲霉孢子胞內(nèi)蛋白的CD圖Fig.3 Circular dichroism spectra of intracellular protein in A.flavus spores

各二級結(jié)構(gòu)相對含量見表3，結(jié)果顯示含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%大米表面的黃曲霉孢子在FIR處理后，其胞內(nèi)蛋白α-螺旋相對含量下降，β-折疊含量上升，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相對穩(wěn)定，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，且此過程不可逆，這與袁麗等[29]研究90 ℃ 加熱處理30 min后鰱肌球蛋白CD譜表示的二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律相似。對含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的大米，進(jìn)一步研究FIR結(jié)合保溫處理對孢子胞內(nèi)蛋白的作用，結(jié)果表明處理后α-螺旋構(gòu)象相對含量低，變化幅度不大，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量下降，柔性大的無規(guī)則卷曲含量上升；史曉霞等[30]同樣報(bào)道卵類黏蛋白隨熱處理溫度與時(shí)間增加，其有序結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變增加。根據(jù)前面研究[11]，F(xiàn)IR處理后樣品表面溫度為(59.0±3.0)℃，F(xiàn)IR聯(lián)合保溫70 ℃ 處理15 min后表面溫度上升為(65.5±1.5)℃，這可能解釋了保溫階段由溫度導(dǎo)致的胞內(nèi)蛋白肽鏈中的氫鍵斷裂及重組加劇而使胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性加速的現(xiàn)象。

表3 黃曲霉孢子胞內(nèi)蛋白各二級結(jié)構(gòu)相對含量 單位：%

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明采用遠(yuǎn)紅外輻照115 ℃ 處理5 min，黃曲霉孢子生長能力受限制，產(chǎn)毒能力下降明顯；且大米初始含水率越高，黃曲霉孢子熱損傷越嚴(yán)重。遠(yuǎn)紅外輻照后孢子細(xì)胞膜、細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)蛋白等發(fā)生變化，表現(xiàn)為通透性下降，出現(xiàn)破損、坍塌凹陷和胞內(nèi)物質(zhì)泄露等現(xiàn)象；當(dāng)結(jié)合保溫處理時(shí)，胞內(nèi)酶等蛋白變性加速。本文初步探討了遠(yuǎn)紅外作用下黃曲霉孢子熱損傷的機(jī)理，但未深入探討非熱效應(yīng)對胞內(nèi)細(xì)胞器與酶的作用。本文有望為遠(yuǎn)紅外輻照殺滅大米中黃曲霉孢子與抑制其產(chǎn)毒能力的研究提供參考。