鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌高鹽脅迫抗性的影響

王定康，張 良，鄒江鵬，車(chē)經(jīng)緯，李 丹，金 垚，周榮清，吳重德,*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 成都 610065；2.瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司， 四川 瀘州 646000)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)因具有產(chǎn)醇、產(chǎn)香、增鮮等重要功能，被廣泛應(yīng)用于豆瓣、醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)過(guò)程中[1-2]。由于這些發(fā)酵食品常常在高滲透壓環(huán)境下生產(chǎn)，魯氏酵母菌不可避免的會(huì)經(jīng)受鹽脅迫、酸脅迫和氧脅迫等[3]。近年來(lái)，魯氏酵母菌抵抗脅迫的能力已得到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，但對(duì)進(jìn)一步提高魯氏酵母菌的脅迫抗性的策略及其機(jī)理還缺乏完整的認(rèn)識(shí)。

預(yù)適應(yīng)處理作為一種提高微生物脅迫抗性的策略[4]，通過(guò)使細(xì)胞預(yù)先暴露于亞致死的脅迫條件下，隨后細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)相同或不同應(yīng)激因子更高的抵抗力[5]。酸適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制(acid tolerance responses, ATR)是常見(jiàn)的預(yù)適應(yīng)保護(hù)機(jī)制。何桂強(qiáng)等[6]考察了嗜鹽四聯(lián)球菌經(jīng)過(guò)pH值為4.5的酸預(yù)適應(yīng)處理60 min后，再經(jīng)過(guò)pH值為2.5的酸致死脅迫60 min，其存活率比未經(jīng)預(yù)適應(yīng)處理的細(xì)胞顯著提高。Hartke等[7]研究表明，乳酸乳球菌乳亞種細(xì)胞在pH值為5.5的酸預(yù)適應(yīng)處理30 min后，可顯著提高酸致死脅迫(pH值為3.9)的存活率。除了酸預(yù)適應(yīng)處理外，有關(guān)熱預(yù)適應(yīng)處理和冷預(yù)適應(yīng)處理也有報(bào)道。Broadbent等[8]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌NCFM、干酪乳桿菌LC301和瑞士乳桿菌LH212分別在50、42、52 ℃預(yù)適應(yīng)處理20 min后，再分別經(jīng)受63、54、63 ℃致死脅迫時(shí)，與未經(jīng)預(yù)適應(yīng)處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞存活率分別提高到處理前的27、5、11倍。Cheng等[9]研究表明，生防酵母菌經(jīng)過(guò)40 ℃預(yù)適應(yīng)處理30 min，可以提高其對(duì)鹽脅迫(175.5 g/L NaCl)耐受性。Mitchell等[10]揭示了釀酒酵母菌經(jīng)過(guò)輕度的熱脅迫或酒精脅迫處理后，可提高其抵御強(qiáng)氧化應(yīng)激的能力。酸、熱、冷等預(yù)適應(yīng)處理的方法已有部分研究報(bào)道，但有關(guān)鹽預(yù)適應(yīng)處理提高細(xì)胞抗逆性能的策略及機(jī)制方面的研究鮮有報(bào)道。

本研究以魯氏酵母菌為研究對(duì)象，擬用鹽預(yù)適應(yīng)處理的策略提高魯氏酵母菌高鹽脅迫抗性，并對(duì)預(yù)適應(yīng)后細(xì)胞生理特性進(jìn)行解析，希望為篩選高活性的魯氏酵母菌及其在傳統(tǒng)食品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母菌(ZygosaccharomycesrouxiiCGMCC 3791)，本實(shí)驗(yàn)室從百年老字號(hào)釀造企業(yè)(四川省郫縣豆瓣股份有限公司)的豆瓣醬本醅中分離獲得，并經(jīng)過(guò)26S rDNA和ITS區(qū)域序列測(cè)序、鑒定、命名，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。超微量Na+/K+- ATPase試劑盒，南京建成生物公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸- 醋酸鉀(HEPES- KAc)細(xì)胞裂解緩沖液，北京雷根生物公司；2′,7′-二(羧乙基)- 4或5-羧基熒光素、二乙酰甲酯(BCECF AM)熒光探針，北京百奧萊博科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW- CJ- 2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TU- 1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；GL- 20G- Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠；92- IIN型超聲波破碎粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ500型分析天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；Trace GC Ultra- DSQII型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；A300型氨基酸分析儀，德國(guó)默曼博爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

分別取20 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的魯氏酵母菌細(xì)胞，離心(10 000g、4 ℃、5 min)，洗滌后重懸于不同質(zhì)量濃度(0、60、120、180、350 g/L)NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min，收集菌體并洗滌兩次，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2鹽預(yù)適應(yīng)處理和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

選取合適的鹽預(yù)適應(yīng)濃度范圍和細(xì)胞致死鹽濃度，進(jìn)行后續(xù)鹽預(yù)適應(yīng)和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分別在不同質(zhì)量濃度(0、60、120、180 g/L)NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min；再重懸于350 g/L NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min。收集菌體并洗滌兩次，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選取較佳的鹽預(yù)適應(yīng)濃度條件，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3鹽預(yù)適應(yīng)處理對(duì)細(xì)胞生理影響的指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 胞內(nèi)pH值的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法：取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體，用50 mmol/L HEPES- KAc (pH值8.0)緩沖液洗滌2次，重懸于等體積的相同緩沖液中；加入1 μL BCECF AM熒光探針，30 ℃溫水浴20 min；用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH值7.0)洗滌3次，重懸于等體積的該緩沖液中。根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]所述方法，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液熒光強(qiáng)度(Itotal)和上清液熒光強(qiáng)度(Ifiltrate)，其中激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm，狹縫寬度均為5 nm。熒光強(qiáng)度的計(jì)算方法見(jiàn)式(1)。

I=[(I490)total-(I490)flitrate]/[(I440)total-(I440)flitrate]，

(1)

再根據(jù)lgI的值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算胞內(nèi)pH值。

1.3.3.2 Na+/K+- ATPase活力的測(cè)定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體。將菌體重懸于1 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)中，冰浴超聲(工作3 s，間歇2 s，全程25 min，功率400 W，保持溫度4 ℃)。用超微量Na+/K+- ATPase活力測(cè)定試劑盒檢測(cè)Na+/K+- ATPase活力。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行計(jì)算。Na+/K+- ATPase活力以單位標(biāo)準(zhǔn)蛋白中含有的Na+/K+- ATPase酶活力表示，U/mg。

1.3.3.3 細(xì)胞膜脂肪酸的提取和測(cè)定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體。參照Wu等[14]的方法提取細(xì)胞膜脂肪酸和制備脂肪酸甲酯，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件參照Z(yǔ)heng等[15]的方法進(jìn)行，由峰面積計(jì)算脂肪酸的相對(duì)含量。脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長(zhǎng)度的計(jì)算方法見(jiàn)式(2)和式(3)。

(2)

(3)

式(2)中，UFAP為不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例，%；SFAP為飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例，%。式(3)中，F(xiàn)AP為單個(gè)脂肪酸占總脂肪酸的比例，%；C為脂肪酸碳原子數(shù)。

1.3.3.4 胞內(nèi)氨基酸含量的測(cè)定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g, 4 ℃, 5 min)，收集菌體。將菌體重懸于1 mL 50 mmol/L的PBS (pH值7.0) 緩沖液中，置于沸水中15 min，離心(8 000g、4 ℃、5 min)，取上清液。添加100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磺基水楊酸沉淀蛋白，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，隨后參照Cui等[16]的方法，用氨基酸分析儀測(cè)定游離氨基酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以 One-way ANOVA 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用ORIGIN 8.5對(duì)數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫處理對(duì)魯氏酵母菌存活率的影響

本研究團(tuán)隊(duì)前期已對(duì)魯氏酵母菌在不同NaCl濃度下生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行了測(cè)定，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加NaCl時(shí)，與添加了NaCl的溶液相比，Z.rouxii的生物量更高[17-18]。本研究為篩選合適的鹽預(yù)適應(yīng)條件，考察了魯氏酵母菌在不同NaCl濃度下處理90 min的存活率變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，以未添加NaCl處理90 min，細(xì)胞存活率為100%計(jì)算，細(xì)胞在60、120、180 g/L的NaCl和飽和NaCl質(zhì)量濃度(350 g/L)下處理90 min，存活率分別為96.37%、80.49%、43.67%和19.04%；因此，選取60～180 g/L NaCl質(zhì)量濃度為鹽預(yù)適應(yīng)濃度范圍，350 g/L NaCl質(zhì)量濃度為高鹽脅迫條件，進(jìn)行后續(xù)鹽預(yù)適應(yīng)處理對(duì)高鹽脅迫耐受性能的考察。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同濃度NaCl脅迫處理對(duì)Z. rouxii 存活率的影響Fig.1 Effects of stress treatment with different NaCl contents on survival rate of Z. rouxii

2.2 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌高鹽脅迫耐受性的影響

考察了不同濃度NaCl預(yù)適應(yīng)處理對(duì)魯氏酵母菌高鹽脅迫下存活倍數(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，以未經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)直接進(jìn)行高鹽脅迫(350 g/L，90 min)的細(xì)胞存活倍數(shù)為1計(jì)算，經(jīng)過(guò)60、120、180 g/L的NaCl預(yù)適應(yīng)前處理90 min，細(xì)胞存活倍數(shù)分別提高到處理前的2.06、2.53、1.92倍，可見(jiàn)鹽預(yù)適應(yīng)處理可提高細(xì)胞的高鹽脅迫耐受性；質(zhì)量濃度為120 g/L的NaCl預(yù)適應(yīng)處理效果最為明顯，選取該條件作為最佳預(yù)適應(yīng)處理?xiàng)l件。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 不同濃度NaCl預(yù)適應(yīng)處理對(duì)魯氏酵母菌高鹽 脅迫下存活倍數(shù)的影響Fig.2 Effects of NaCl preadaptation on survival fold of Z. rouxii stressed with high salinity stress

2.3 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌生理特性的影響

2.3.1鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)胞內(nèi)pH值的影響

本研究為探究鹽預(yù)適應(yīng)處理提高魯氏酵母菌細(xì)胞耐鹽性的機(jī)制，對(duì)鹽預(yù)適應(yīng)處理前后細(xì)胞生理特性變化進(jìn)行了分析。首先考察了魯氏酵母菌在鹽預(yù)適應(yīng)前后，以及鹽脅迫過(guò)程中胞內(nèi)pH值的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，預(yù)適應(yīng)前的細(xì)胞(before preadaptation, BP)胞內(nèi)pH值為6.11，細(xì)胞直接經(jīng)過(guò)鹽脅迫(salt stress, SS)后，胞內(nèi)pH值急劇下降至4.83；當(dāng)經(jīng)過(guò)質(zhì)量濃度為120 g/L的NaCl預(yù)適應(yīng)90 min后(salt preadaptation, SP)，細(xì)胞的胞內(nèi)pH值為5.31，并且經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)處理的細(xì)胞，再進(jìn)行鹽脅迫處理(salt preadaptation to salt stress, SP- SS)，胞內(nèi)pH值為5.10。因此，鹽脅迫導(dǎo)致了胞內(nèi)pH水平顯著降低，而經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)處理后的細(xì)胞再經(jīng)鹽脅迫，比未經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)直接進(jìn)行鹽脅迫的細(xì)胞保持了更高的胞內(nèi)pH值。有研究表明，細(xì)胞的胞內(nèi)pH值與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞內(nèi)吞有關(guān)，胞內(nèi)pH值的降低伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)活性的減弱[19]，可見(jiàn)鹽預(yù)適應(yīng)處理可以幫助細(xì)胞維持胞內(nèi)pH值的相對(duì)穩(wěn)定，從而提高細(xì)胞對(duì)鹽脅迫的耐受性。

BP—預(yù)適應(yīng)前；SP—鹽預(yù)適應(yīng)處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)pH值的影響Fig.3 Effects of salt preadaptation on intracellular pH value of Z. rouxii

2.3.2鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)Na+/K+-ATPase活力的影響

Na+/K+- ATPase是公認(rèn)的評(píng)價(jià)細(xì)胞鹽適應(yīng)能力的生物標(biāo)志物，在許多生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，包括轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓、調(diào)節(jié)細(xì)胞體積等[20-21]。本研究測(cè)定了鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)Na+/K+- ATPase活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，細(xì)胞經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)(SP)后，Na+/K+- ATPase活力由預(yù)適應(yīng)前(BP)的0.708 U/mg上升到1.081 U/mg，并且經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)前處理的細(xì)胞，在鹽脅迫過(guò)程中(SP- SS)的Na+/K+- ATPase活力(1.087 U/mg)顯著高于未經(jīng)預(yù)適應(yīng)直接進(jìn)入鹽脅迫(SS)的細(xì)胞(0.651 U/mg)。由細(xì)胞膜上的離子梯度產(chǎn)生的膜電位是多種細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的基礎(chǔ)，而Na+/K+- ATPase可維持細(xì)胞內(nèi)最佳的Na+和K+梯度[22]。Petrezs等[23]證實(shí)了釀酒酵母菌可上調(diào)表達(dá)Na+/K+- ATPase的活力來(lái)抵御高鹽脅迫。本研究結(jié)果表明，鹽預(yù)適應(yīng)處理有助于提高胞內(nèi)Na+/K+- ATPase活力，從而增強(qiáng)了細(xì)胞鹽脅迫耐受性。

BP—預(yù)適應(yīng)前；SP—鹽預(yù)適應(yīng)處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)Na+/K+- ATPase 活力的影響Fig.4 Effects of salt preadaptation on intracellular Na+/K+- ATPase activity of Z. rouxii

2.3.3鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

研究了預(yù)適應(yīng)對(duì)鹽脅迫條件下細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，與未經(jīng)預(yù)處理(BP)的細(xì)胞相比，鹽預(yù)適應(yīng)(SP)處理導(dǎo)致細(xì)胞膜飽和脂肪酸(棕櫚酸C16:0，硬脂酸C18:0)的相對(duì)含量分別減少至處理前的93%和79%，不飽和脂肪酸(棕櫚油酸C16:1，油酸C18:1和亞油酸C18:2)的相對(duì)含量分別增加到處理前的1.93和1.61倍。值得注意的是，鹽脅迫后，與未經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)直接鹽脅迫(SS)的細(xì)胞相比，先經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)(SP- SS)的細(xì)胞，其棕櫚酸C16:0和硬脂酸C18:0的相對(duì)含量分別減少至93%和60%，而棕櫚油酸C16:1、油酸C18:1和亞油酸C18:2的相對(duì)含量分別增加到處理前的2.55、1.78、1.39倍。在釀酒酵母菌中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，Guo等[24]研究表明，釀酒酵母菌在酸脅迫后，其棕櫚酸C16:0的相對(duì)含量降低，油酸C18:1的相對(duì)含量升高，并且過(guò)量表達(dá)編碼去飽和酶的基因OLE1，會(huì)提高油酸C18:1的相對(duì)含量，脂肪酸不飽和指數(shù)也會(huì)增加，導(dǎo)致釀酒酵母菌耐酸性能顯著提高。

BP—預(yù)適應(yīng)前；SP—鹽預(yù)適應(yīng)處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響Fig.5 Effects of salt preadaptation on changes of membrane fatty acids proportion of Z. rouxii

分析了細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度和平均碳鏈長(zhǎng)度的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)(SP)的細(xì)胞與預(yù)適應(yīng)前相比(BP)，其不飽和度增加到處理前的1.93倍，并且先經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)前處理的細(xì)胞(SP- SS)，在鹽脅迫條件下，其不飽和度是未經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)直接鹽脅迫(SS)細(xì)胞的2.28倍。細(xì)胞膜脂肪酸平均碳鏈長(zhǎng)度分析表明，鹽脅迫后(SS)的細(xì)胞比鹽脅迫前(BP)的細(xì)胞平均鏈長(zhǎng)略有增加，但SP- SS細(xì)胞與SS細(xì)胞無(wú)顯著差異。研究表明，在不利的釀造環(huán)境中，脂肪酸對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞膜和細(xì)胞整體代謝活力起著重要的維持作用[25]，脂肪酸不飽和指數(shù)的增加，會(huì)有助于細(xì)胞抵抗鹽脅迫[26-27]。這種現(xiàn)象的原因是含有較高比例不飽和脂肪酸的膜結(jié)構(gòu)松散，流動(dòng)性更強(qiáng)，有利于抵御滲透脅迫[28]。由此可見(jiàn)，預(yù)適應(yīng)處理能夠幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)膜脂肪酸的組成，提高不飽和脂肪酸的比例，從而增強(qiáng)細(xì)胞耐受高鹽濃度的能力。

BP—預(yù)適應(yīng)前；SP—鹽預(yù)適應(yīng)處理后；SS—直接高鹽脅迫，平均碳鍵長(zhǎng)度以碳原子數(shù)表示。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌鹽脅迫條件下細(xì)胞膜 脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長(zhǎng)度的影響Fig.6 Effects of salt preadaptation on changes of unsaturation degree and mean chain length of Z. rouxii during salt stress

BP—預(yù)適應(yīng)前；SP—鹽預(yù)適應(yīng)處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌鹽脅迫條件下胞內(nèi) 氨基酸含量的影響Fig.7 Effects of salt preadaptation on changes of intracellular amino acids contents of Z. rouxii during salt stress

2.3.4鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)胞內(nèi)氨基酸含量的影響

氨基酸作為細(xì)胞內(nèi)重要的相容性溶質(zhì)，可平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，增強(qiáng)細(xì)胞抵抗外界的脅迫能力[29-30]。本研究測(cè)定了在預(yù)適應(yīng)和鹽脅迫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)氨基酸含量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)(SP)后，有3種氨基酸[脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)]的含量比預(yù)適應(yīng)前(BP)增加，4種氨基酸[纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)和賴(lài)氨酸(Lys)]的含量降低；當(dāng)比較經(jīng)過(guò)鹽預(yù)適應(yīng)前處理的細(xì)胞(SP- SS)和無(wú)預(yù)適應(yīng)直接鹽脅迫的細(xì)胞(SS)胞內(nèi)氨基酸含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸和賴(lài)氨酸的含量更高。研究表明，魯氏酵母菌可通過(guò)提高編碼半胱氨酸裂合酶和蘇氨酸合成酶基因的表達(dá)水平，使胞內(nèi)積累一定量的半胱氨酸和蘇氨酸來(lái)抵御鹽脅迫[17]。由此可見(jiàn)，鹽預(yù)適應(yīng)處理可幫助細(xì)胞在高鹽脅迫條件下保持胞內(nèi)氨基酸的水平，從而更有利于細(xì)胞的存活。

3 結(jié) 論

研究了鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌高鹽脅迫抗性的影響。先后考察了鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌存活率的影響，以及鹽預(yù)適應(yīng)對(duì)魯氏酵母菌耐受高鹽脅迫抗性的影響，并從胞內(nèi)微環(huán)境(胞內(nèi)pH水平、Na+/K+- ATPase活力、胞內(nèi)氨基酸含量)和細(xì)胞膜脂肪酸組成的角度解析了細(xì)胞在鹽預(yù)適應(yīng)過(guò)程以及鹽脅迫條件下的生理特性變化。結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)120 g/L NaCl處理90 min，細(xì)胞的耐鹽性最為明顯；當(dāng)比較先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫細(xì)胞與直接高鹽脅迫的細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)pH值和Na+/K+- ATPase活力更高，并且先經(jīng)鹽預(yù)適應(yīng)再高鹽脅迫細(xì)胞具有相對(duì)含量更低的飽和脂肪酸(棕櫚酸C16:0，細(xì)胞內(nèi)硬脂酸C18:0)和更高的不飽和脂肪酸(棕櫚油酸C16:1，油酸C18:1，亞油酸C18:2)，從而具有更高細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度；而胞內(nèi)氨基酸絲氨酸、蘇氨酸和賴(lài)氨酸的含量也更高。希望本研究結(jié)果可以為進(jìn)一步理解預(yù)適應(yīng)保護(hù)魯氏酵母菌抗逆的生理機(jī)制，為高活性魯氏酵母菌的制備和工業(yè)應(yīng)用提供理論參考。