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    核桃多糖研究進(jìn)展

    2021-06-07 02:05:46榮瑞芬王興國(guó)
    關(guān)鍵詞:質(zhì)量研究

    榮瑞芬,齊 琳,蘇 晨,劉 洋,王興國(guó)

    (1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院, 北京 100023;2.河北省(邢臺(tái))核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院, 河北 臨城 054300)

    核桃,為胡桃科植物果實(shí),與扁桃仁、腰果及榛子并稱“四大干果”[1]。核桃是我國(guó)重要的特色優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品,截至2018年底,我國(guó)核桃種植面積為816.57萬(wàn)ha,核桃年產(chǎn)量382萬(wàn)t,位居世界第一。核桃仁中脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物的含量分別約為65%、15%、14%,并含有多種維生素及礦物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)素全面且均衡。此外,核桃還富含多種功能成分,如胡桃醌、多酚、黃酮和多糖等,很早就被古人作為藥材入藥,可見(jiàn),核桃是具有極高營(yíng)養(yǎng)和保健作用的健康食材[2-5]。

    近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)許多植物多糖具有抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫功能、降血糖、降血脂、抗氧化等多種保健作用[6-8],多糖相關(guān)研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),大豆多糖[9]、枸杞多糖[10]、香菇多糖等[11-12]已開(kāi)發(fā)應(yīng)用。核桃果實(shí)不同組織都含有多糖,如核桃青皮、核桃分心木(隔膜)、核桃殼、核桃楸仁多糖均有研究報(bào)道[13-27]。目前,研究?jī)?nèi)容主要集中在多糖的提取和生物活性方面,對(duì)多糖組成和結(jié)構(gòu)研究還較少。核桃仁為核桃可食部分,其所含多糖不需提取即可被吸收利用,而當(dāng)前對(duì)核桃仁多糖的研究極少。研究核桃仁多糖含量、結(jié)構(gòu)組成及生物活性對(duì)深入了解核桃營(yíng)養(yǎng)健康作用具有更深刻的現(xiàn)實(shí)意義。核桃仁中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占14%,榨油之后的核桃粕,總糖可達(dá)40%,多糖濃度也隨之增加,以核桃粕為原料研究核桃仁多糖對(duì)核桃粕高值化利用也具有重要的實(shí)踐意義,因此核桃仁和核桃粕多糖的研究亟待開(kāi)展。

    本文對(duì)國(guó)內(nèi)外核桃多糖的提取、分離純化、含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)測(cè)定及生物活性的研究進(jìn)展進(jìn)行了全面的綜述,以期為開(kāi)展核桃多糖深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考和依據(jù)。

    1 核桃多糖分離提取方法研究

    目前,核桃多糖提取常用方法是熱水浸提法,為提高多糖提取得率,前人利用酶解法、超聲輔助法和微波法輔助法對(duì)多糖進(jìn)行了提取,核桃不同組織以及不同提取方法與工藝對(duì)核桃多糖提取得率影響不同,核桃多糖提取工藝與結(jié)果分析比較見(jiàn)表1。

    由表1可知,前人對(duì)核桃青皮多糖研究較多,熱水浸提結(jié)合其他不同輔助方法多糖提取得率不同。超聲輔助法提取多糖得率最高,平均為10.24%,其次是微波輔助提取得率為8.21%,單純熱水浸提提取得率為3.13%,酶法輔助提取得率為1.55%??梢?jiàn)超聲輔助和微波輔助提取多糖是非常有效的提取方法,同時(shí)還能大大減少提取時(shí)間,降低提取溫度,是一種高效的提取方法,其中超聲輔助又好于微波輔助提取,具有很好的應(yīng)用前景。

    表1 不同工藝提取核桃多糖的研究結(jié)果Tab.1 Research results of extracting walnut polysaccharides by different processes

    提取工藝條件中,純熱水浸提中提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率影響較大,提取溫度在85 ℃以上,同時(shí)提取時(shí)間在150 min以上時(shí),提取得率較高。料液比在1∶20 g·mL-1以上時(shí)提取效果較好。

    由表1數(shù)據(jù)計(jì)算各組織部位多糖提取得率,青皮在3.13%~10.24%,核桃殼在2.2%~3.1%,核桃分心木多糖提取率最高,為17.42%。核桃楸仁是山核桃,核桃楸仁和青皮多糖提取得率分別在6%和12%以上,較普通核桃相應(yīng)組織部位的多糖含量高。核桃青皮、核桃殼、核桃分心木含油脂、蛋白質(zhì)極少,多糖提取影時(shí)響因素較少,但表1顯示,核桃青皮多糖得率相差較大,核桃多糖提取工藝對(duì)多糖得率影響較大,多糖提取工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化。

    2 核桃多糖分離純化方法研究

    2.1 去除蛋白質(zhì)

    多糖提取液中?;煊械鞍踪|(zhì),使用Sevag法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法、蛋白酶酶解法可以使蛋白質(zhì)沉淀從而去除蛋白質(zhì),不同處理方法脫除核桃多糖中蛋白質(zhì)的研究結(jié)果見(jiàn)表2。

    從表2可知,體積分?jǐn)?shù)為5%~10%的三氯乙酸脫蛋白的效率較Sevag法高,但多糖的損失率也較高,使用的強(qiáng)酸試劑可能會(huì)降解多糖,影響多糖結(jié)構(gòu)以及活性。Sevag法需多次脫除操作,也能脫除80%以上的蛋白質(zhì),多糖損失率低,因使用有機(jī)溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),反應(yīng)條件溫和,不會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成影響,因此,采用Sevag法脫蛋白更好,脫除次數(shù)在5~7次較為適宜。酶法脫除蛋白質(zhì)具有溫和、無(wú)毒、蛋白質(zhì)殘留少等特點(diǎn),但在核桃中的研究應(yīng)用相對(duì)不多。

    表2 Sevag法及TCA法去蛋白質(zhì)純化多糖Tab.2 Polysaccharide purification via removing protein by Sevag method and TCA method

    2.2 透析法去除小分子物質(zhì)

    透析法是將多糖溶液放入透析袋中,在自來(lái)水、蒸餾水中透析,從而將小分子物質(zhì)如小分子低聚糖、鹽離子除去而使大分子物質(zhì)截留在溶液中的分離方法??偨Y(jié)的核桃多糖在分離純化時(shí)應(yīng)用透析的研究數(shù)據(jù)見(jiàn)表3,透析袋分別選用了8 000、14 000 u和8 000~14 000 u的截留范圍,去除小分子雜物,這種透析有可能導(dǎo)致分子質(zhì)量小于8 000 u的多糖丟失。因此,透析袋型號(hào)的選用應(yīng)考慮所提粗糖中多糖分子質(zhì)量的分布,可分別選用不同截留分子質(zhì)量透析袋透析,以減少型號(hào)選用不當(dāng)造成多糖的損失[28]。

    表3 透析法分離純化核桃多糖Tab.3 Separation and purification of walnut polysaccharides by dialysis

    2.3 沉淀法分離純化

    沉淀分離是根據(jù)多糖分子質(zhì)量大小的不同及溶解能力的不同在有機(jī)溶劑中沉淀而得到多糖的分離方法,包括有機(jī)溶劑沉淀法如乙醇、丙酮,鹽沉淀法如多糖與銅鹽、季銨鹽,形成不溶物而獲得多糖,研究中常選擇乙醇對(duì)核桃多糖進(jìn)行沉淀。不同分子質(zhì)量的多糖在不同濃度乙醇中的溶解能力存在差異,因此,可選用不同濃度乙醇分步沉淀分離不同性質(zhì)的多糖,王文澤[18]利用體積分?jǐn)?shù)為10%~100%(10%為梯度)的乙醇對(duì)核桃楸青衣多糖進(jìn)行了分級(jí)沉淀和分步沉淀的研究,綜合考慮最終確定沉淀方法為無(wú)水乙醇一次沉淀法。多糖醇沉所用乙醇濃度也不盡相同,一般選用70%~90%[14,20,28]。

    2.4 柱層析法分離純化

    核桃多糖分離純化時(shí)常使用的柱層析方法有纖維素柱層析法、離子交換柱層析法、凝膠柱層析法,進(jìn)行不同分子質(zhì)量多糖的分離和去雜,不同柱層析法對(duì)不同核桃組織多糖分離純化的效果見(jiàn)表4。

    表4 柱層析法分離純化核桃多糖Tab.4 Separation and purification of walnut polysaccharides by column chromatography

    前人采用了DEAE-纖維素25-52、SephadexG75-100以及大孔樹(shù)脂柱層析法分離核桃分心木、核桃青皮和核桃楸青皮多糖,其中核桃分心木分離得到分子質(zhì)量為0.701 5×104、1.305 7×104u的兩種多糖,核桃楸青皮分離出4種分子質(zhì)量分布在1.27×104~22.79×104u的多糖,核桃青皮僅做了Sephadex柱層析分離提高純度達(dá)90%左右,未進(jìn)行分子質(zhì)量大小研究,而青皮中多糖含量相對(duì)較高,應(yīng)對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行研究。由表4可知核桃楸青皮多糖組分多、分子質(zhì)量較大。

    經(jīng)初步提取后的多糖中通常有脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)存在[33],常采用Sevag法或TCA法去除蛋白質(zhì),透析或超濾去除小分子物質(zhì),用多種柱層析純化方法對(duì)多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化。離子交換柱色譜法是純化蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的有效方法。核桃多糖有多種,分子質(zhì)量大小不同,現(xiàn)有研究還不夠深入,采用柱層析分離時(shí),要認(rèn)真分析、設(shè)計(jì)科學(xué)適宜的柱層析分離方法,才能減少分離純化時(shí)多糖的損失。

    3 核桃多糖含量及檢測(cè)方法

    植物多糖提取時(shí)常選用苯酚- 硫酸法和蒽酮- 硫酸法對(duì)多糖含量進(jìn)行檢測(cè),苯酚硫酸法的穩(wěn)定性和重復(fù)性要優(yōu)于蒽酮硫酸法。表5為兩種不同方法檢測(cè)核桃不同組織多糖含量的結(jié)果對(duì)比。

    由表5可知,核桃中多糖含量因品種、組織部位的不同具有一定的差異,核桃殼中含量最高,為22.22%,青皮7.48%以上,分心木約5.15%,核桃仁5.33%。兩種測(cè)定方法中苯酚- 硫酸法測(cè)定值較蒽酮- 硫酸法所測(cè)值高出約5個(gè)數(shù)值,相差較大[36],但也有文獻(xiàn)報(bào)道蒽酮- 硫酸法測(cè)定值較苯酚- 硫酸法高[14];核桃青皮干制法影響多糖含量,自然曬干的高于烘箱烘干的含量,高出6個(gè)數(shù)值,表明多糖對(duì)高溫不穩(wěn)定。表5中核桃不同組織材料多糖含量與表1中相應(yīng)的組織材料多糖得率也不一致,分析原因,其一可能與多糖提取純度有關(guān),水溶醇沉方法提取可能使多種水溶的成分殘留在粗多糖中,如蛋白質(zhì)、多酚類成分,而這兩種成分在核桃仁中含量都很豐富,導(dǎo)致提取多糖純度不高;其二與粗多糖本身是一個(gè)多種糖分組成的混合物有關(guān),不同提取方法、不同組織部位材料其成分組成會(huì)有差異,導(dǎo)致測(cè)定值不同;從前人研究結(jié)果中可知多糖提取包含多個(gè)處理,對(duì)多糖含量與穩(wěn)定性的影響較大,是影響多糖純度和含量準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此,在多糖研究中一定要對(duì)提取環(huán)節(jié)進(jìn)行精心設(shè)計(jì)和不同提取方法比較優(yōu)化,以保證多糖研究數(shù)據(jù)的可靠性。

    表5 苯酚- 硫酸法與蒽酮- 硫酸法測(cè)定核桃多糖含量Tab.5 Determination of walnut polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method

    4 核桃多糖結(jié)構(gòu)研究

    目前,關(guān)于核桃多糖結(jié)構(gòu)的研究多集中在一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究,常用紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜、氣相色譜等方法進(jìn)行分析研究,結(jié)構(gòu)的分析有助于生物活性的研究。

    4.1 多糖官能團(tuán)特征的分析

    核桃多糖紅外光譜的掃描范圍為400~4 000 cm-1,通過(guò)對(duì)多糖官能團(tuán)的測(cè)定,可以分析不同組織部位的核桃多糖的基團(tuán)和構(gòu)型,有助于多糖結(jié)構(gòu)分析,官能團(tuán)特征信息見(jiàn)表6。

    不同組織部位核桃多糖400~4 000 cm-1紅外光譜掃描顯示了多糖的基本官能團(tuán)結(jié)構(gòu)特征,都有糖醛酸官能團(tuán),表明核桃多糖為酸性多糖。核桃青皮和核桃內(nèi)種皮多糖中有β構(gòu)型,分心木多糖中有α-異頭構(gòu)型,其他團(tuán)能團(tuán)特征信息還需要進(jìn)一步深入研究。

    表6 紅外光譜法分析多糖官能團(tuán)特征Tab.6 Polysaccharide functional group characteristics analyzed by infrared spectroscopy

    4.2 多糖分子質(zhì)量的分析

    前人通過(guò)凝膠滲透色譜分離山核桃、核桃青皮和分心木多糖分子質(zhì)量信息見(jiàn)表7。多糖分子質(zhì)量的大小影響著它的生物活性,如水溶性葡聚糖的分子質(zhì)量需要大于9×104u才可能形成3股螺旋結(jié)構(gòu),從而可能具有一定的免疫活性,當(dāng)分子質(zhì)量為10×104~20×104u時(shí)其活性最強(qiáng)[14]。從表7數(shù)據(jù)可知,山核桃青衣多糖的分子質(zhì)量為13.302 1×104u,可能存在一定的活性。

    4.3 單糖組成的分析

    核桃多糖的單糖組成見(jiàn)表8。

    不同組織部位的核桃多糖的單糖組成差異較小,基本都含有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖,單糖組成在7個(gè)以上,各單糖組分占

    表7 高效凝膠滲透色譜法及凝膠滲透色譜法分析多糖分子質(zhì)量Tab.7 Analysis of polysaccharide molecular weight by high performance gel permeation chromatography and gel permeation chromatography

    表8 不同組織部位核桃多糖的單糖組成及比例Tab.8 Monosaccharide composition and ratio of walnut polysaccharide in different tissue parts

    比不同。核桃分心木中以鼠李糖、葡萄糖較多,核桃青皮多糖中以葡萄糖和半乳糖的比例較高,核桃殼多糖中以D-阿拉伯糖最多,其次是葡萄糖和半乳糖的比例較高。綜合表6和表8可推測(cè)核桃多糖為酸性雜多糖,不同組織部位多糖單糖組成很接近。

    由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,已有研究?jī)H進(jìn)行了核桃多糖結(jié)構(gòu)單糖組成、糖苷鍵型、分子質(zhì)量的初步研究,對(duì)多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)還未涉及。

    5 核桃多糖生物活性研究

    眾多學(xué)者對(duì)核桃不同組織部位的水提多糖進(jìn)行了生物活性研究,核桃青皮、核桃殼、核桃分心木和核桃內(nèi)種皮多糖均具有多種生物活性。

    5.1 抗腫瘤

    分離純化的核桃分心木多糖具有抗腫瘤功效[45]。研究表明:核桃楸果水提物及分離出分子質(zhì)量為2.279×105u的均一多糖對(duì)S180、H22、LWS造模小鼠腫瘤有抑制和抗癌活性[30,46]。

    5.2 降血糖

    核桃分心木水提液對(duì)糖尿病小鼠血糖和胰腺結(jié)構(gòu)影響的研究表明核桃多糖可以降低患有糖尿病動(dòng)物的血糖值[47]。核桃青皮多糖能夠降低高果糖飲食小鼠的血糖濃度,對(duì)胰島素抵抗具有調(diào)節(jié)作用[48]。分離純化的核桃分心木多糖具有一定的降血糖作用[49]。

    5.3 抗氧化

    采用水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定核桃青皮多糖清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力,發(fā)現(xiàn)核桃青皮多糖的清除能力弱于維生素C[23];核桃青皮多糖具有總抗氧化能力,其清除羥基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的能力弱于維生素C[26]。經(jīng)過(guò)蒸汽熱燙方法處理后的光核桃,其多糖含量及抗氧化活力得到了明顯的提高[50];核桃分心木多糖具有清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基和還原Fe3+的能力[51];核桃青皮果膠具有清除DPPH自由基的能力[52]。

    5.4 抑菌

    分離純化的核桃仁種皮多糖對(duì)金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌有抑制效果[39];分離純化的核桃仁種皮多糖抑制酸奶霉菌的效果隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),抑制霉菌的最佳質(zhì)量濃度為500 mg/L[53];分離純化的核桃分心木多糖具有顯著的抗菌活性[54]。

    5.5 預(yù)防阿爾茨海默病

    分別用水、乙醇和丙酮等3種溶劑對(duì)核桃仁進(jìn)行提取,研究3種提取物對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠 IL-1、IL-6 含量的影響,結(jié)果表明3種提取物均具有預(yù)防模型大鼠患阿爾茨海默病的作用[55]。

    6 總結(jié)與展望

    目前,對(duì)核桃青皮、核桃殼、核桃分心木、核桃內(nèi)種皮及核桃楸多糖提取工藝已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究,對(duì)核桃多糖結(jié)構(gòu)組成及生物活性方面進(jìn)行了初步研究,為核桃多糖進(jìn)一步深入研究及核桃仁多糖研究奠定了一定的基礎(chǔ),但研究中還存在一些問(wèn)題需進(jìn)一步改善提高。

    6.1 核桃多糖研究的思考與建議

    1)提取方法的改進(jìn)與優(yōu)化。核桃青皮、殼、分心木及核桃內(nèi)種皮和核桃仁中都含有豐富的多酚和黃酮類成分,提取過(guò)程中極易氧化褐變,影響多糖提取物色澤和含量準(zhǔn)確性的測(cè)定,可考慮先進(jìn)行乙醇脫酚處理,再提取多糖,降低提取中的雜物,提高多糖純度。

    2)多糖的分離純化。核桃多糖種類較多,分子質(zhì)量主要集中在7 015~13 057 u,可據(jù)此選擇或設(shè)計(jì)適宜的分離純化工藝,盡可能多的保留提取的多糖。

    3)多糖含量的測(cè)定方法。目前,提取多糖的測(cè)定均是采用苯酚- 硫酸法或蒽酮- 硫酸法,但兩種方法所測(cè)多糖值相差較大,這種差異是兩種方法的系統(tǒng)誤差所致,因此,需對(duì)兩種方法進(jìn)行評(píng)價(jià),并進(jìn)行相關(guān)性分析。

    4)多糖結(jié)構(gòu)與生物活性研究。鑒于多糖結(jié)構(gòu)研究的復(fù)雜性和煩瑣性,及前人用多糖提取物研究其生物活性也獲得相應(yīng)的結(jié)果,建議采用較高純度的多糖先進(jìn)行多糖活性研究,在活性研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展結(jié)構(gòu)特性研究。

    6.2 核桃仁多糖研究展望

    核桃多糖研究中的研究材料多是不可食用的副產(chǎn)物,而對(duì)可食用的桃核桃仁多糖研究極少。核桃仁中的多糖不需要提取,直接食入體內(nèi)而發(fā)揮作用,因此,開(kāi)展核桃仁多糖研究對(duì)提升核桃營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。核桃油是核桃仁之精華,其加工副產(chǎn)物核桃粕目前尚未得到很好的利用,核桃粕因核桃油的分出,其所含其他成分得到濃縮,碳水化合物含量約占40%,多糖濃度也相應(yīng)提高,這有利于開(kāi)展多糖研究。因此開(kāi)展核桃粕多糖提取、結(jié)構(gòu)組成和生物活性研究對(duì)充分利用核桃資源和更好的發(fā)揮核桃的營(yíng)養(yǎng)保健作用有著重要的理論和實(shí)踐意義。核桃粕主要成分是蛋白質(zhì),其次是碳水化合物和殘留少量的核桃油,再其次是核桃酚類化合物,極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,目前利用核桃粕提取蛋白制備核桃多肽研究較多,如能在提取蛋白的基礎(chǔ)上,在前人核桃多糖研究基礎(chǔ)上高效開(kāi)展核桃多糖研究,不僅闡明核桃仁多糖含量、組成結(jié)構(gòu)、生物活性,而且能夠充分實(shí)現(xiàn)核桃粕高值化利用,促進(jìn)核桃精深加工,延長(zhǎng)核桃深加工產(chǎn)業(yè)鏈,提高產(chǎn)業(yè)鏈效益,對(duì)實(shí)現(xiàn)核桃產(chǎn)業(yè)鏈的提質(zhì)增效具有重要的實(shí)踐意義。

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