免疫功能正常者新生隱球菌感染1例報道

王東江， 郭 建

（上海市東方醫(yī)院南院檢驗科，上海 200120）

可引起感染的隱球菌主要包括新生隱球菌和格特隱球菌，常見的感染部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺部和皮膚。隱球菌主要引起免疫抑制患者的感染，其發(fā)病率約為6～10%，獲得性免疫缺陷綜合征患者隱球菌病的發(fā)病率更可高達30%[1]。在免疫功能正常的人群中，隱球菌的感染率則很低，僅有十萬分之一感染的可能，早期診斷對預后至關(guān)重要[2]。耐藥性的產(chǎn)生是導致臨床抗隱球菌感染治療失敗的重要原因之一。近年來，隱球菌屬對氟康唑的最小抑菌濃度明顯升高[3]，及時、規(guī)范的真菌藥物敏感性試驗結(jié)果對精準治療具有重要意義。發(fā)病隱匿、病死率高是隱球菌性腦膜腦炎的重要特征[4]。本研究對1例免疫功能正常的中年男性隱球菌感染病例的診斷與治療過程進行分析，為臨床合理選擇診斷項目，提高檢驗路徑的臨床應用提供實驗室依據(jù)。

1 病例資料

患者，男，46歲。10年前曾患胃炎，平素體健，無藥物過敏和慢性病史，無傳染病及手術(shù)外傷史，否認有鴿子接觸史。1周前無明顯誘因開始出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳白色黏痰，伴有胃反酸、頭痛、畏寒。2019年7月23日來上海市東方醫(yī)院南院急診內(nèi)科就診，體溫37.5 ℃，予以左氧氟沙星、頭孢美唑抗感染治療，奧西康抑酸護胃等對癥支持治療。治療5 d后癥狀未見明顯好轉(zhuǎn)，仍有反復發(fā)熱，且近2 d出現(xiàn)腹瀉。7月30日因“發(fā)熱伴咳嗽、咳痰1周”入院。入院影像學檢查示：腦部未見明顯可疑感染癥狀，左肺上葉小結(jié)節(jié)，雙側(cè)胸膜局部小結(jié)節(jié)樣增厚，雙肺少許纖維灶，見圖1。

圖1 腦部和胸部影像學檢查結(jié)果

患者入院后完善相關(guān)檢查，呼吸內(nèi)科先后予以莫西沙星0.4 g qd、鹽酸萬古霉素1 g q12 h靜滴進行抗感染治療。8月3日，患者反復發(fā)熱伴頭痛，腋窩淋巴結(jié)增大，雙側(cè)腹股淋巴結(jié)增大?？紤]患者發(fā)熱與病毒感染有關(guān)，給予比阿培南、地塞米松及更昔洛韋繼續(xù)抗感染、抗病毒對癥支持治療，同時給予甘露醇降顱壓。

2019年8年5日，考慮顱內(nèi)感染轉(zhuǎn)入神經(jīng)內(nèi)科，給予更昔洛韋、頭孢曲松鈉抗感染治療，脫水利尿。8月7日出現(xiàn)頸項強直、四肢抽搐，突發(fā)頸項強直，腦膜刺激征陽性，腦電圖中度彌漫性異常。行腰椎穿刺，腦脊液壓力35.0 cm H2O，腦脊液墨汁染色檢查危急值報告提示“查見大量有莢膜的酵母樣真菌孢子，疑似隱球菌感染”，轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護病房后調(diào)整用藥方案，給予氟康唑抗真菌感染治療?；颊甙橛邪l(fā)熱，考慮真菌血癥，采集雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)送檢，同時采集腦脊液進行細菌和真菌培養(yǎng)。

臨床微生物實驗室進行真菌培養(yǎng)鑒定和體外藥物敏感性試驗，結(jié)果提示棘白菌素耐藥，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B根據(jù)流行病學折點（epidemiological cutoff value，ECV）判讀為敏感[5]。邀華山醫(yī)院感染科專家會診后，應家屬要求轉(zhuǎn)入華山醫(yī)院感染科住院治療。治療方案為兩性霉素B用藥至累積2.5 g，調(diào)整方案為氟康唑600 mg qd聯(lián)合5-氟胞嘧啶1.5 g qd口服。對患者隨訪6個月，患者用藥期間無明顯不適，腰椎穿刺、血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)未見明顯異常，預后良好。

2 實驗室檢查

8月3日，巨細胞病毒抗體、單純皰疹I型IgG抗體檢測均為陽性。腦脊液用細胞離心機771×g離心20 min后制片，烤干玻片后進行革蘭染色。腦脊液771×g離心20 min，棄上清，取沉淀進行真菌熒光染色和墨汁染色。同時，對腦脊液上清液進行隱球菌莢膜抗原快速檢測。將5 mL腦脊液注入需氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)增菌，同時采集雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)瓶置Versa TREK240全自動血培養(yǎng)儀（美國賽默飛世爾公司）培養(yǎng)。對血培養(yǎng)和腦脊液培養(yǎng)分離出的新生隱球菌進行快速質(zhì)譜鑒定和體外藥物敏感性試驗。

腦脊液常規(guī)檢查結(jié)果為無色、透明，白細胞547×106/L，中性粒細胞42%，單核細胞5%，淋巴細胞53%，紅細胞計數(shù)1 000×106/L，潘氏試驗結(jié)果為陽性。腦脊液生化檢測結(jié)果顯示葡萄糖＜1.10 mmol/L，氯112 mmol/L，總蛋白1 240 mg/L。隱球菌莢膜抗原快速檢測陽性。取1 mL腦脊液通過細胞離心機制片后行革蘭染色，查見大量酵母樣真菌孢子。真菌熒光染色找到真菌孢子，隱球菌墨汁染色查見大量有莢膜的酵母樣真菌孢子，疑似隱球菌。見圖2。

圖2 新生隱球菌墨汁染色、革蘭染色、相差顯微鏡和熒光染色結(jié)果

腦脊液和血培養(yǎng)瓶分別培養(yǎng)24～48 h，血培養(yǎng)儀器提示陽性，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板、巧克力平板、麥康凱平板和沙保弱平板（美國賽默飛世爾公司）。35 ℃培養(yǎng)24 h后，采用Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（鄭州安圖公司）進行菌株鑒定，腹腔積液3次檢測結(jié)果均為新生隱球菌（Cryptococcus neoformans），鑒定分值均>9.50。

參照2017年美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）要求進行隱球菌藥物敏感性試驗，采用YeastOne真菌藥物敏感性試驗試劑盒（美國賽默飛世爾公司）進行檢測，72 h后使用SensititreVizion全自動藥物敏感性試驗判讀系統(tǒng)判讀結(jié)果。同時，進行近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC 6258）藥物敏感性試驗質(zhì)量控制，24 h質(zhì)量控制檢測結(jié)果均在控。參考隱球菌屬微量肉湯稀釋法常規(guī)藥物敏感性試驗ECV值[5]（表1），≤ECV值判讀為野生型，>ECV值判讀為非野生型。對該菌株的藥物敏感性試驗結(jié)果進行判讀：氟康唑4 μg/mL（野生型）、伊曲康唑0.03 μg/mL（野生型）、泊沙康唑0.03 μg/mL（野生型）、兩性霉素B 0.5 μg/mL（野生型）、5-氟胞嘧啶1 μg/mL（野生型）、伏立康唑0.015 μg/mL（野生型），米卡芬凈8 μg/mL（天然耐藥）、阿尼芬凈8 μg/mL（天然耐藥）和卡泊芬凈8 μg/mL（天然耐藥）。

3 討論

隱球菌廣泛分布于土壤、鴿糞等自然環(huán)境中，是常見的條件致病性真菌。通過呼吸系統(tǒng)進入人體發(fā)生定植和感染，可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚、骨骼系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等，對腦和腦膜有特殊的親和力。隱球菌性腦膜腦炎是由隱球菌侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的一種深部侵襲性真菌病，多見于免疫功能受抑制和免疫功能低下的患者，免疫功能正常者罕見發(fā)病[6-9]。

隱球菌性腦膜腦炎的臨床表現(xiàn)多無特異性，影像學診斷也缺乏特異性。常表現(xiàn)為進行性頭痛加劇，病程遷延，常伴有惡心、嘔吐及視力障礙。肺部感染常見多發(fā)性結(jié)節(jié)，隱球菌莢膜抗原快速檢測可以早期快速篩查隱球菌肺部感染。目前，腦脊液真菌培養(yǎng)鑒定仍是鑒定隱球菌性腦膜腦炎的唯一“金標準”[10-11]。隱球菌性腦膜腦炎的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查與結(jié)核性腦膜炎極為相似，臨床容易誤診[8，12]。本例患者系平時體健中年男性，無基礎疾病，急性起病，持續(xù)頭痛伴發(fā)熱，癥狀逐漸加重，病情進展快，符合隱球菌性腦膜腦炎的表現(xiàn)，臨床上比較罕見。

有學者對1 049例艾滋病患者的血液和腦脊液樣本進行檢測方法學比較后發(fā)現(xiàn)，血清隱球菌抗原檢測是診斷隱球菌感染的理想方法[11]。對誤診隱球菌性腦膜腦炎的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，4例患者均以頭痛起病，病程中均出現(xiàn)發(fā)熱，被誤診為病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎及上呼吸道感染各1例。最終通過腦脊液墨汁染色檢出新生隱球菌，確診為新生隱球菌性腦膜腦炎[12]。近年來，隱球菌性腦膜腦炎和隱球菌性肺炎的發(fā)病率有不斷升高的趨勢，臨床應提高與病毒性腦膜炎或肺炎等疾病相鑒別的能力，選擇合適的檢測項目，早期快速確診。對疑似隱球菌感染的患者，血清隱球菌莢膜抗原檢測和腦脊液墨汁染色可提高診斷的及時性和準確性。通過真菌培養(yǎng)，對腦脊液和血液標本進行隱球菌分離培養(yǎng)，進行規(guī)范的真菌藥物敏感性試驗，結(jié)合現(xiàn)有的隱球菌ECV出具藥物敏感性報告，可以早期診斷并實施精準治療。

目前，臨床治療隱球菌病的藥物僅限于兩性霉素B、唑類和5-氟胞嘧啶，長期使用抗真菌藥物可引起隱球菌耐藥，從而導致臨床治療失敗。隱球菌感染治療費用昂貴，治療周期漫長[13]，因此迫切需要對其耐藥性進行監(jiān)測，對其耐藥機制進行深入研究，對臨床探索有效治療方案具有重要意義[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌對伏立康唑和兩性霉素B的耐藥率為1.32%，對5-氟胞嘧啶的耐藥率為0.33%[15]。在長期的抗真菌治療過程中，隱球菌對抗真菌藥物會產(chǎn)生耐藥，從而導致治療失敗。因此，臨床治療需要實驗室的體外藥物敏感性試驗報告作為合理用藥的依據(jù)[16]。

本研究通過對該患者進行血清、腦脊液的隱球菌莢膜抗原檢測，快速確診為隱球菌感染，結(jié)合血培養(yǎng)和腦脊液培養(yǎng)分離出致病真菌，為臨床確診提供了重要證據(jù)。對于肺部影像學檢查有結(jié)節(jié)，并且具有肺部或者腦部癥狀的患者，早期篩查隱球菌莢膜抗原具有重要意義。對分離的隱球菌進行質(zhì)譜快速鑒定，可以準確鑒定到種。采用商品化真菌藥敏試劑盒進行藥物敏感性試驗，結(jié)合隱球菌ECV發(fā)布藥物敏感性報告，并進行適當?shù)呐R床溝通和結(jié)果解釋，有助于推動臨床合理使用抗真菌藥物，提高隱球菌感染的臨床治愈率。