隨機(jī)尿游離型NMN、MN HPLC-ED檢測方法的建立和臨床應(yīng)用

張 磊， 左 明， 鄒文畢， 王浩然， 張曉清， 丁 敏

（1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，重慶 400016；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科實驗室，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016）

嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL）是起源于腎上腺髓質(zhì)和腎上腺外交感神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)分泌腫瘤，以分泌大量兒茶酚胺為特征，典型表現(xiàn)為“心悸、大汗、頭痛”三聯(lián)征和繼發(fā)性高血壓等[1]。PPGL最大的危害是并發(fā)高血壓危象、急性左心功能衰竭和腦出血，嚴(yán)重者可危及生命[2]。有研究結(jié)果顯示，甲氧基腎上腺素類物質(zhì)，包括甲氧基去甲腎上腺素（normetanephrine，NMN）、甲氧基腎上腺素（metanephrine，MN）是診斷PPGL最好的指標(biāo)[3]。目前，臨床上常用的診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的方法是檢測血漿游離型NMN、MN[4-5]，但血漿游離型NMN、MN檢測易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[6]。有研究結(jié)果顯示，24 h尿總NMN和總MN對嗜鉻細(xì)胞瘤診斷的特異性優(yōu)于血漿游離型NMN 、MN[7]。然而，在體內(nèi)代謝過程中，總甲氧基腎上腺素類物質(zhì)易受外源性和神經(jīng)源性兒茶酚胺等因素的影響。此外，24 h尿存在收集困難、尿量計算不準(zhǔn)確、患者依從性差等缺點。隨機(jī)尿的采集方便、快速，患者依從性好，能夠在門診廣泛普及。因此，本研究擬建立檢測隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度的高效液相色譜-電化學(xué)（high performance liquid chromatographyelectrochemical detection，HPLC-ED）方法，并評估其臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年7月—2016年6月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的嗜鉻細(xì)胞瘤患者35例（嗜鉻細(xì)胞瘤組，其中男15例、女20例，年齡15～71歲）、原發(fā)性高血壓患者70例（高血壓組，其中男34例、女36例，年齡16～72歲）、非嗜鉻細(xì)胞瘤腎上腺占位患者78例（腎上腺占位組，其中男38例、女40例，年齡27～73歲）。嗜鉻細(xì)胞瘤經(jīng)過組織學(xué)檢查或術(shù)后病理診斷證實；非嗜鉻細(xì)胞瘤腎上腺占位經(jīng)過組織學(xué)檢查或者術(shù)后病理診斷證實；原發(fā)性高血壓的確診包括3個方面：（1）經(jīng)B超或電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）等影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位現(xiàn)象；（2）經(jīng)相關(guān)檢查排除因其他疾病導(dǎo)致的繼發(fā)性高血壓；（3）患者在隨后的1年內(nèi)未出現(xiàn)任何相關(guān)的PPGL陽性結(jié)果（影像學(xué)、生化檢測、病理檢查等）。另選取同期重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢健康者44名（正常對照組），其中男20名、女24名，年齡15～73歲。所有研究對象均經(jīng)血漿游離型NMN、MN篩查[9]，且肝功能、腎功指標(biāo)均無明顯異常。

1.2 儀器與試劑

Waters 1525高效液相色譜儀（美國Waters公司），包括Waters 1525泵、Waters 2465電化學(xué)檢測器和Waters 2707自動進(jìn)樣器。ZORBAX SB-C18色譜柱（3 mm×100 mm，3.5 μm；美國Agilent公司），C18保護(hù)柱（4 mm×3 mm，5 μm；美國Phenomenex公司），SampliQ Silica SCX萃取小柱（100 mg/mL，美國Agilent公司），Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。NMN、MN和4-羥基-3-甲氧基芐胺鹽酸鹽（4-hydroxy-3-methoxybenzylamine hydrochloride，HMBA）標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。甲醇和乙腈均為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣本采集及處理

囑所有對象在樣本采集前5 d禁服對乙酰氨基酚類藥物和抗抑郁類藥物，樣本采集前1 d禁食香蕉、濃茶和咖啡等，樣本采集時先靜息15 min，然后采用預(yù)冷的5 mL肝素抗凝管采集所有對象空腹靜脈血4 mL，采集后立即冰上保存，以4 100×g離心5 min，分離血漿，-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測。血漿樣本的采集、分離和保存需在2 h內(nèi)完成。另收集所有對象10 mL隨機(jī)尿，分裝后-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測。所有對象的血漿和隨機(jī)尿均為同時收集。

取200 μL隨機(jī)尿，加入超純水5 mL、0.2 mol/L醋酸200 μL、100 μg/L HMBA（內(nèi)標(biāo)）100 μL，混勻。采用10%氨水-甲醇（V∶V=1∶3）5 mL、10 g/L KOH-甲醇溶液2 mL、超純水2 mL依次活化萃取小柱，將上述混勻樣本上樣，流速為1～2 mL/min。用10 mmol/L醋酸-甲醇溶液（V∶V=9∶1）2 mL、10 mmol/L磷酸銨溶液2 mL，超純水2 mL依次淋洗萃取小柱。用2 mL 氨水-甲醇溶液洗脫。將洗脫液真空旋干，用0.2 mol/L醋酸溶液200 μL復(fù)溶，取50 μL進(jìn)樣檢測。隨機(jī)尿肌酐（creatinine，Cr）濃度采用BS-380全自動生化分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測。血漿樣本的預(yù)處理步驟參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.4 色譜條件

流動相為0.10 mol/L磷酸二氫鈉（pH值3.2，含0.40 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和0.50 mmol/L辛烷磺酸鈉）與乙腈的混合溶液（V∶V=95.5∶4.5）。流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，電化學(xué)檢測器檢測電壓為+0.85 V，進(jìn)樣量為50 μL，分析時間為18 min。

1.5 方法學(xué)評價

1.5.1 線性范圍 將20 μL不同濃度的NMN和MN標(biāo)準(zhǔn)溶液（均為250、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 μg/L）加入180 μL正常對照者的混合尿液中，配置成系列濃度（25、200、500、1 000、1 500、2 000、2 500 μg/L）的工作液，按尿液樣本處理及檢測步驟進(jìn)行處理并檢測。以待測物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值與基質(zhì)中待測物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值的差值為Y，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X，進(jìn)行線性回歸分析。

1.5.2 檢測限 分別對250 μg/LNMN標(biāo)準(zhǔn)品溶液和250 μg/L MN標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行倍比稀釋，分別配制成50.00、25.00、12.50、6.25 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將測出的信號與空白樣本的信號進(jìn)行比較，以信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）=3時對應(yīng)的濃度為檢測限。

1.5.3 精密度 選取嗜鉻細(xì)胞瘤患者混合尿液（高濃度）和正常對照者混合尿液（低濃度），日內(nèi)重復(fù)測定5次，連續(xù)測定5 d，進(jìn)行精密度評估。

1.5.4 回收實驗 在正常對照者混合尿液中分別添加低（25 ng/L）、中（625 ng/L）、高（1 250 ng/L）3個濃度的NMN、MN混合標(biāo)準(zhǔn)品，測定加標(biāo)前后NMN和MN的濃度，每個濃度平行測定3次，計算相對回收率，計算公式為：相對回收率（%）=（加入標(biāo)準(zhǔn)品的樣本濃度-未加入標(biāo)準(zhǔn)品的樣本濃度）/加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度×100%。

1.5.5 初步臨床應(yīng)用 采用建立的HPLC-ED法檢測正常對照組、高血壓組、腎上腺占位組及嗜鉻細(xì)胞瘤組隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度。同時檢測尿Cr，計算尿NMN/Cr比值和尿MN/Cr比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，2個組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標(biāo)診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評價

2.1.1 線性范圍 HPLC-ED法檢測NMN和MN的線性范圍均為25～2 500 μg/L。NMN的回歸方程為Y=0.023X-0.139（r=0.999），MN的回歸方程為Y=0.016X-0.075（r=0.999）。

2.1.2 檢測限 以RSN=3時對應(yīng)的濃度為檢測限，NMN和MN的檢測限分別為5.9 μg/L和11.3 μg/L。

2.1.3 精密度驗證 NMN高、低2個濃度的批內(nèi)CV分別為3.7%和2.2%，批間CV分別為5.6%和3.3%；MN高、低2個濃度批內(nèi)CV分別為4.3%和2.7%，批間CV分別為5.1%和3.4%。見表1。

表1 精密度驗證結(jié)果

2.1.4 回收實驗 隨機(jī)尿樣本中NMN和MN的平均回收率為92.8%～103.4%。見表2。

表2 回收實驗結(jié)果

2.2 各組隨機(jī)尿及血漿游離型NMN、MN濃度檢測

嗜鉻細(xì)胞瘤組隨機(jī)尿游離型NMN、MN濃度和尿NMN/Cr比值、尿MN/Cr比值明顯高于高血壓組、腎上腺占位組及正常對照組（P＜0.001），高血壓組、腎上腺占位組及正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。嗜鉻細(xì)胞瘤組血漿游離型NMN和MN濃度明顯高于高血壓組、腎上腺占位組及正常對照組（P＜0.001）。見表3。HPLC-ED法檢測隨機(jī)尿游離型NMN、MN的色譜圖見圖1。

表3 各組隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度及尿NMN/Cr比值、尿MN/Cr比值比較 M（P25～P75）

圖1 HPLC-ED法檢測隨機(jī)尿游離型NMN、MN的色譜圖

2.3 隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，隨機(jī)尿游離型NMN、隨機(jī)尿游離型MN、尿NMN/Cr比值、尿MN/Cr比值、血漿游離型NMN、血漿游離型MN診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.91、0.88、0.96、0.94、0.93和0.88。尿NMN/Cr比值和尿MN/Cr比值診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的最佳臨界值分別為122.5和65.0 μg/g Cr，敏感性均為85.7%，特異性分別為98.3%、95.0%。血漿游離型NMN和MN診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的最佳臨界值分別為431.4和131.2 ng/L，敏感性分別為82.9%、80.0%，特異性分別為92.7%、84.4%。見表4、圖2。

圖2 隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN和尿NMN/Cr比值、尿MN/Cr比值診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的ROC曲線

在70例原發(fā)性高血壓患者（陰性對照）中，有13例患者血漿游離型NMN、MN濃度高于最佳臨界值，有4例患者的隨機(jī)尿游離型NMN、MN濃度高于最佳臨界值。

2.4 嗜鉻細(xì)胞瘤患者術(shù)前、術(shù)后隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度的變化

35例嗜鉻細(xì)胞瘤患者中，有15例患者在術(shù)后1周檢測了隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度。結(jié)果顯示，嗜鉻細(xì)胞瘤患者術(shù)后1周，尿MN/Cr比值均降為正常，有2例患者術(shù)后血漿MN濃度高于術(shù)前，有1例患者術(shù)后血漿NMN濃度高于術(shù)前。見圖3。

3 討論

嗜鉻細(xì)胞瘤與兒茶酚胺的分泌密切相關(guān)。嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞合成的兒茶酚胺主要包括去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和腎上腺素（epinephrine，E）。NE和E中的一部分直接由腫瘤細(xì)胞分泌進(jìn)入血液，另一部分在腫瘤細(xì)胞兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）的作用下分別生成游離型NMN和MN，統(tǒng)稱為甲氧基腎上腺素類物質(zhì)。這些游離型NMN、MN由腫瘤細(xì)胞緩慢分泌進(jìn)入血液循環(huán)[9]，血液中游離的NMN、MN可以通過腎臟由尿液直接排出，或在肝臟通過單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）代謝生成終末代謝產(chǎn)物香草扁桃酸（vanillylmandelic acid，VMA），隨尿液排出體外。此外，游離型NMN、MN還可以在胃腸道器官經(jīng)磺基轉(zhuǎn)移酶作用生成硫酸結(jié)合型NMN和硫酸結(jié)合型MN，然后經(jīng)尿液排出體外[10]。因此，血漿和尿液中游離型NMN、MN直接來源于腫瘤細(xì)胞，其水平的增高是兒茶酚胺長期大量合成的結(jié)果，能反映嗜鉻細(xì)胞瘤患者兒茶酚胺合成的情況。

在本研究70例原發(fā)性高血壓患者（陰性對照）中，有13例患者血漿游離型MN濃度高于最佳臨界值，有4例患者的隨機(jī)尿游離型MN濃度高于最佳臨界值，血漿游離型MN的假陽性率為18%（13/70），而隨機(jī)尿游離型MN的假陽性率為6%（4/70）。這提示服用降壓藥物也是影響嗜鉻細(xì)胞瘤診斷的一個重要因素，而尿液游離型NMN、MN檢測受上述因素影響較小，比血漿游離型NMN、MN更能反映嗜鉻細(xì)胞瘤患者兒茶酚胺的代謝情況。本研究結(jié)果顯示，尿NMN/Cr比值和尿MN/Cr比值診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的特異性分別為98.3%和95.0%，明顯高于血漿游離型NMN、MN檢測，與文獻(xiàn)報道[6]基本一致。

本研究結(jié)果還顯示，15例嗜鉻細(xì)胞瘤患者術(shù)后隨機(jī)尿和血漿游離型NMN、MN濃度均出現(xiàn)了不同程度的下降，隨機(jī)尿游離型NMN、MN濃度和隨機(jī)尿NMN/Cr比值、隨機(jī)尿MN/Cr比值的下降幅度比血漿游離型NMN、MN濃度更大。由于血漿游離型NMN、MN易受外界因素影響，因此其下降的幅度小于隨機(jī)尿游離型NMN、MN。在本研究中，有2例患者術(shù)后血漿游離型NMN、MN出現(xiàn)了較術(shù)前升高的現(xiàn)象，極易對臨床的術(shù)后評估產(chǎn)生干擾。因此，相對于血漿游離型NMN、MN，隨機(jī)尿游離型NMN、MN能更準(zhǔn)確地反映嗜鉻細(xì)胞瘤術(shù)后效果。

綜上所述，本研究建立了檢測隨機(jī)尿游離型NMN、MN濃度的HPLC-ED方法，該法具有良好的靈敏度和回收率。尿NMN/Cr比值和尿MN/Cr比值診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的效能均優(yōu)于血漿游離型NMN、MN，在嗜鉻細(xì)胞瘤的術(shù)后評估中也有較好的價值。由于本研究的樣本量較小，檢測時間較長（從樣本處理到報告結(jié)果需要8 h），因此后續(xù)除擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗證本研究結(jié)論外，還要對檢測流程進(jìn)行優(yōu)化，以縮短檢測時間，更好地服務(wù)于臨床。