Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)效果評價

錢雪琴， 盧洪洲

（1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗醫(yī)學(xué)科，上海 201508；2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心感染與免疫科，上海 201508）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性感染性疾病，分枝桿菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)。如何提高臨床樣本中分枝桿菌培養(yǎng)陽性率、縮短培養(yǎng)時間，是提高結(jié)核病防治效率的關(guān)鍵。培養(yǎng)基的選擇是影響培養(yǎng)陽性率和報陽時間的直接因素。目前，分枝桿菌培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩大類。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時間短，分枝桿菌培養(yǎng)陽性率高，但需要配備昂貴的檢測系統(tǒng)，我國基層醫(yī)院尚不具備廣泛使用的條件。固體培養(yǎng)基根據(jù)固化劑種類可分為以羅氏培養(yǎng)基為代表的雞蛋培養(yǎng)基和以Middlebrook7H11為代表的瓊脂固體培養(yǎng)基。目前，我國臨床實驗室主要使用的是羅氏培養(yǎng)基，Middlebrook7H11僅用于科研。國外關(guān)于以羅氏培養(yǎng)基為對照，使用Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基分離分枝桿菌，再通過顯微鏡觀察結(jié)果的報道很多，但對于Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基的使用情況，國內(nèi)外均鮮有文獻報道。本研究將不同類型臨床樣本分別接種于Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基，比較2種培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)陽性率、污染率及報陽時間的差異。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2014年5月4日—7月3日上海市公共衛(wèi)生臨床中心住院和門診患者各類臨床樣本599例，其中呼吸道樣本415例（痰液樣本374例、灌洗液樣本22例、支氣管刷取物樣本19例）、其他體液樣本159例（穿刺液樣本37例、尿液樣本29例、胃液樣本27例、胸腔積液樣本18例、膿性分泌物樣本18例、腦脊液樣本22例、引流物樣本5例、腹腔積液樣本3例）、糞便樣本21例、肺組織和骨髓樣本各2例。

1.2 病例分類

599例患者中，臨床擬診為陳舊性肺結(jié)核72例、肺結(jié)核41例、肺外結(jié)核65例、肺部感染167例、肺部陰影20例、淋巴結(jié)炎37例、艾滋病48例、肺癌和支氣管擴張等其他疾病149例。肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：以病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢查結(jié)果為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)輔助檢查及鑒別診斷等進行綜合分析作出診斷；以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)；兒童肺結(jié)核的診斷除痰液病原學(xué)檢查結(jié)果外，還要參考胃液病原學(xué)檢查結(jié)果[1]。

1.3 培養(yǎng)基

Middlebrook7H11干粉培養(yǎng)基購自美國BD公司。（1）Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基配制。添加營養(yǎng)增強劑（油酸、牛血清蛋白、右旋糖苷、觸媒），每管7～9 mL，傾斜放置，凝固后放入冰箱避光冷藏保存，有效期為1個月。（2）Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基性能驗證。抽取2%～5%新批號培養(yǎng)基，（36±1）℃孵育，48 h后觀察是否有細(xì)菌生長，無培養(yǎng)物生長為無菌性測試合格；如果發(fā)現(xiàn)任何一支培養(yǎng)基有培養(yǎng)物生長，則將同一批次的所有培養(yǎng)基（36±1）℃孵育48 h，逐一檢查，棄去有細(xì)菌生長的培養(yǎng)管，將沒有培養(yǎng)物生長的培養(yǎng)管擰緊螺蓋保存?zhèn)溆茫涣砣?管分別接種結(jié)核分枝桿菌H37Rv、胞內(nèi)分枝桿菌進行生長試驗，挑取菌落至磨菌容器，加入無菌0.9% NaCl溶液1～2滴，研磨后加入0.9% NaCl溶液制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海皇褂眯?zhǔn)后的接種環(huán)或移液管取10 μL菌液進行接種，于35℃～37℃、5%～10% CO2環(huán)境孵育，培養(yǎng)21 d；21 d后有菌落生長，抗酸染色排除污染為試驗合格。標(biāo)準(zhǔn)菌株結(jié)核分枝桿菌（ATCC 27294）、包內(nèi)分枝桿菌（ATCC 13950）購自上海市疾病預(yù)防控制中心。羅氏培養(yǎng)基由上海市疾病預(yù)防控制中心配送，批準(zhǔn)文號為滬械注準(zhǔn)20162400085。

1.4 方法

1.4.1 樣本處理 按照BACTEC 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)（美國BD公司）操作手冊要求處理樣本。稀薄痰、灌洗液、支氣管刷取物、穿刺液等液態(tài)樣本用2% NaOH-N-乙酰半胱氨酸按1∶1比例處理；黏稠痰、尿沉渣、膿性分泌物等黏稠樣本采用NaOH與樣本按3∶1比例處理；糞便樣本取綠豆大小，加入蒸餾水10 mL，震蕩混勻后靜置15 min，取上清5 mL，加入3倍體積的NaOH處理。將處理后的樣本渦旋震蕩30 s，消化15～20 min，加含有100 U/mL青霉素的蒸餾水至50 mL，3 000×g離心15 min，棄上清，沉淀物加1 mL含有100 U/mL青霉素的蒸餾水混勻，待接種。

1.4.2 接種、培養(yǎng) 取0.1 mL處理后的臨床樣本，分別接種于Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況，以后每周觀察1次，8周未見生長視為陰性。

1.4.3 結(jié)果分級報告 參照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[2]標(biāo)準(zhǔn)，以菌落生長不足斜面1/4為分枝桿菌培養(yǎng)陽性（X個菌落），菌落生長占斜面1/4為分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+），菌落生長占斜面1/2為分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+），菌落生長占斜面3/4為分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+），菌落生長鋪滿斜面為分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+），培養(yǎng)8周仍無菌落生長為分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗比較2種培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)陽性率、污染率、陽性早出現(xiàn)例數(shù)的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果比較

599例臨床樣本中，Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為12.9%，羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為12.4%，兩者聯(lián)合培養(yǎng)陽性率為15%。Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率稍高于羅氏培養(yǎng)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.07，P>0.05）；羅氏培養(yǎng)基污染率高于Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基（χ2=4.67，P＜0.05）；同一樣本Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性早出現(xiàn)1周的例數(shù)多于羅氏培養(yǎng)基（χ2=11.62，P＜0.01），陽性培養(yǎng)時間縮短1周；Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基同一樣本菌落數(shù)稍多于羅氏培養(yǎng)基，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.66，P>0.05）。見表1、表2、表3。

表3 2種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果一致性比較 例

2.2 374例痰液樣本2種方法培養(yǎng)結(jié)果比較

347例痰液樣本Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為12.6%，羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為12.0%，兩者聯(lián)合培養(yǎng)陽性率為14.7%。Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基之間陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.05，P>0.05）。見表4。

表4 374例痰液樣本2種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果一致性比較 例

2.3 不同疾病類型2種培養(yǎng)基陽性結(jié)果比較

所有類型疾病中，肺部陰影培養(yǎng)陽性率最高，其次為淋巴結(jié)炎及肺部感染，陳舊性肺結(jié)核陽性率最低。見表5。

表5 不同疾病類型2種培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性結(jié)果比較

3 討論

分枝桿菌培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液/固雙相培養(yǎng)基。Middlebrook7H9培養(yǎng)基為常用液體培養(yǎng)基。20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的以Middlebrook7H9培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的自動化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括有放射性的BACTEC460培養(yǎng)體系和無放射性的MB/BacT Alert 3D、BACTEC Myco/Flytic、BACTEC MGIT 960、VersaTREK培養(yǎng)系統(tǒng)，通過測定細(xì)菌生長代謝來檢測分枝桿菌。BACTEC460培養(yǎng)體系由于存在放射性，已不再使用。其他商品化的液體培養(yǎng)檢測系統(tǒng)因儀器及試劑價格昂貴，基層醫(yī)院很少使用。與固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基提高了分枝桿菌檢出率。CRUCIANI等[3]對10項研究中分離自14 745例臨床樣本的1 381株分枝桿菌進行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)MGIT系統(tǒng)的分析靈敏度為81.5%，而羅氏培養(yǎng)基的靈敏度為67%。SIMNER等[4]報道MGIT系統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculosisMycobacterium，NTM）平均報陽時間分別為10 d和14 d，Middlebrook7H11瓊脂平板培養(yǎng)時間分別為20 d和23 d。

固體培養(yǎng)基主要分為以雞蛋為基礎(chǔ)和以瓊脂為基礎(chǔ)的2類培養(yǎng)基。以雞蛋為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基使用最廣泛的是羅氏培養(yǎng)基，具有很好的緩沖能力，可以保存較長時間（數(shù)月），培養(yǎng)基中所含的孔雀綠可抑制雜菌生長，不需要特殊的儀器，用于MTB培養(yǎng)效果較好，但牛分枝桿菌生長不佳，用丙酮酸鈉代替培養(yǎng)基中的甘油，可以促進牛分枝桿菌的生長。以瓊脂為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基主要有Middlebrook7H11和Middlebrook7H10，其主要成分為瓊脂、有機化合物、氯化鈉、甘油和白蛋白，可用于分枝桿菌的分離培養(yǎng)和藥物敏感性試驗。Middlebrook7H11在Middlebrook7H10的基礎(chǔ)上進行了改良，通過添加0.1%的酪蛋白水解物，用于在Middlebrook7H10瓊脂上因苛養(yǎng)生長不良或異煙肼耐藥的MTB的培養(yǎng)[5]。瓊脂培養(yǎng)基最大的優(yōu)點是培養(yǎng)基凝固后完全透明，當(dāng)樣本被接種到含有該種培養(yǎng)基的平皿后，10～12 d就可以通過普通光學(xué)顯微鏡或解剖鏡觀察到MTB菌落生長，而羅氏培養(yǎng)基需要18～24 d才出現(xiàn)肉眼可見的菌落[6]；缺點是保存時間較短（1個月），過度加熱和光照會釋放甲醛，對分枝桿菌有毒性。

BATTAGLIOLI等[7]發(fā)現(xiàn)羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌敏感性為76%，低于Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基（8 6%）。I D I G O R A S等[8]以羅氏培養(yǎng)基為對照，應(yīng)用顯微鏡觀察Middlebrook7H11平板培養(yǎng)結(jié)果，比較兩者陽性率及報陽時間，羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率為4.9%（265/5 438），Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基陽性率為4.2%（227/5 438），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Middlebrook7H11平板培養(yǎng)平均檢出時間為12 d，而羅氏培養(yǎng)基平均檢出時間為23 d。本研究使用Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基，每周肉眼觀察，以出現(xiàn)針尖樣菌落后涂片抗酸染色陽性為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基陽性率為12.9%，羅氏培養(yǎng)基陽性率為12.4%，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與文獻報道[8]結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基陽性最早檢出時間是11 d，中位時間是28 d，平均為31 d；羅氏培養(yǎng)基陽性最早檢出時間為12 d，中位時間為30 d，平均為31 d，與文獻[8]比較，陽性時間有所延長。本研究有12例樣本Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基陽性時間與羅氏培養(yǎng)基相比縮短1周。THARMALINGAM等[9]將107例涂片陽性樣本同時采用羅氏培養(yǎng)基和Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中106例在2種培養(yǎng)基上均生長；Middlebrook7H11平板培養(yǎng)后通過顯微鏡觀察結(jié)果，有51例（48.1%）樣本1周內(nèi)發(fā)現(xiàn)有菌落生長，其余樣本2周之內(nèi)全部發(fā)現(xiàn)有菌落生長；而羅氏培養(yǎng)基菌落最早生長時間為14 d，有12例（11.3%）樣本2周才開始有菌落生長，5周內(nèi)有79例（74.5%）樣本有菌落生長。本研究使用Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基，2周內(nèi)僅4例（5.2%）樣本有菌落生長，遠(yuǎn)低于文獻報道[9]的結(jié)果。

本研究未采用Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，是基于分枝桿菌固體培養(yǎng)需要8周時間，考慮到平板培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中易干燥，顯微鏡觀察增加了生物安全的危險性和實驗室人員工作量，故將瓊脂培養(yǎng)基做成了斜面，肉眼觀察培養(yǎng)結(jié)果。本研究的局限性是樣本接種于培養(yǎng)基后，按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[2]規(guī)定，第3、7天各觀察1次菌落生長情況，以后每周觀察1次，沒能做到每天觀察菌落，記錄的菌落生長時間可能要晚于實際菌落生長時間。考慮到臨床檢測工作與科研工作的差別，本研究的菌落生長時間僅代表臨床檢測工作中分枝桿菌生長時間。

本研究發(fā)現(xiàn)，Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基污染率（5.3%）低于羅氏培養(yǎng)基（8.5%），與文獻報道[5]一致。可能由Middlebrook7H11培養(yǎng)基成分相對簡單，一些苛氧菌生長不良所致。

目前，臨床實驗室中常用的雙相培養(yǎng)基包括Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉湯和羅氏斜面/Middlebrook7H9肉湯。與固體培養(yǎng)基相比，雙相培養(yǎng)基可縮短分枝桿菌培養(yǎng)時間，提高培養(yǎng)的陽性率。 GHATOLE等[10]對雙相培養(yǎng)基（Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉湯）與羅氏培養(yǎng)基進行比較，涂陽樣本雙相培養(yǎng)基陽性率為97.0%，報陽時間為（21.00±4.44）d；羅氏培養(yǎng)基陽性率為79.41%，報陽時間為（28.00±3.76）d；雙相培養(yǎng)基污染率較低（1.33%），對MTB的分離效果優(yōu)于羅氏培養(yǎng)基。本研究僅使用了Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基，陽性率與羅氏培養(yǎng)基比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），報陽時間長于雙相培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基可提高分枝桿菌培養(yǎng)陽性率，縮短培養(yǎng)時間。Middlebrook7H11平板培養(yǎng)后通過顯微鏡觀察結(jié)果，可顯著縮短分枝桿菌陽性檢出時間，但存在生物安全隱患、培養(yǎng)基易干燥、結(jié)果觀察步驟繁瑣等弊端。配制成斜面，可避免上述情況發(fā)生，但延長了報陽時間。與羅氏培養(yǎng)基相比，Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基對于一部分陽性樣本可提前1周報告病原菌結(jié)果。Middlebrook7H11斜面培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基在分枝桿菌培養(yǎng)中具有互補性，兩者聯(lián)合可提高分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率，縮短部分樣本陽性報告時間。綜合文獻及本研究結(jié)果，我們認(rèn)為理想的分枝桿菌培養(yǎng)組合為Middlebrook7H11平板培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基和MGIT 960 3種培養(yǎng)基聯(lián)合培養(yǎng)。