腸道菌群對慢性蕁麻疹患者血清炎癥因子的影響

任 媛， 張 敏， 殷 翔， 曾倩雯

[1.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）整形外科，重慶 400042；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶 400038；3.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）脊柱外科，重慶 400042；4.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）皮膚科，重慶 400042]

蕁麻疹是臨床常見皮膚病，其特征是出現(xiàn)風(fēng)疹和/或血管性水腫，分為急性蕁麻疹和慢性蕁麻疹。急性蕁麻疹主要與食物、藥物、感染、過敏或擬過敏反應(yīng)有關(guān)；慢性蕁麻疹是一種自發(fā)性，或可被誘發(fā)的疾病，持續(xù)時間超過6周。一部分急性蕁麻疹可能會轉(zhuǎn)變?yōu)槁允n麻疹。與急性蕁麻疹相比，慢性蕁麻疹是一種更復(fù)雜的疾病，可能與免疫、炎癥和凝血失衡有關(guān)[1]。目前，關(guān)于慢性蕁麻疹的研究較多，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。腸道菌群是一個復(fù)雜的生物生態(tài)系統(tǒng)，與宿主腸上皮細(xì)胞相互作用，并在宿主健康和疾病平衡中起著重要的作用。有研究結(jié)果表明，腸道菌群組成和/或活動（營養(yǎng)不良）的紊亂可能是過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制，腸道定植細(xì)菌與位于腸上皮和樹突狀細(xì)胞上的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）反應(yīng)，可刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞的信號通路[2]。短鏈脂肪酸是腸道微生物通過膳食纖維發(fā)酵而產(chǎn)生的，被認(rèn)為是宿主腸道的重要能量來源，包括乙酸、丙酸和丁酸，這些代謝產(chǎn)物被宿主利用，發(fā)揮它們在機(jī)體中的作用[3]。有研究者發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平明顯高于對照組，表明這些炎癥因子在慢性蕁麻疹發(fā)病機(jī)制中有重要作用，并有可能為治療慢性蕁麻疹的新策略提供理論依據(jù)[4-5]。本研究通過分析慢性蕁麻疹患者腸道菌群、腸道短鏈脂肪酸、血清TLR4、核因子（nuclear factor，NF）-κB、TNF-α和IL-6水平的關(guān)系，探討慢性蕁麻疹患者腸道菌群對血清炎癥因子的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年8月大坪醫(yī)院皮膚科收治的慢性蕁麻疹患者，同時招募大坪醫(yī)院體檢健康者。所有研究對象排便習(xí)慣正常，6個月內(nèi)未使用抗菌藥物、甾體類藥物和微生態(tài)制劑，未發(fā)生過非創(chuàng)傷性感染、過敏、免疫異常疾病、慢性腸胃功能紊亂、胃腸道疾病，近期未進(jìn)行過手術(shù)，無心理和行為學(xué)異常[6]。最終納入慢性蕁麻疹患者60例（慢性蕁麻疹組），其中男31例、女29例，年齡（43.40±11.75）歲；體檢健康者60名（健康對照組），其中男35名、女25名，年齡（45.30±13.92）歲。2個組之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)大坪醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有研究對象均知情同意。

1.2 儀器與試劑

IQ5實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國伯樂公司），試劑盒購自日本TaKaRA公司；人糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒（德國凱杰公司）；去核酸水[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 采用肛拭子收集所有研究對象晨起空腹中段糞便樣本，標(biāo)記姓名及分組后放入液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另采集所有研究對象晨起空腹靜脈血，離心收集血清，置于1.5 mL Eppendorf管中，標(biāo)記姓名及分組，同樣置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6檢測 從-80 ℃冰箱中取出血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

1.3.3 細(xì)菌總DNA提取 從-80 ℃冰箱中取出糞便樣本，嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，采用NanoOne微量分光光度計（杭州佑寧儀器有限公司）檢測提取的總DNA的純度和濃度。

1.3.4 目標(biāo)菌16S rDNA基因檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測所有研究對象腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括上、下游引物各1 μL、去核酸水8.5 μL、熒光染料12.5 μL、總DNA模板2 μL（60 ng）。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃15 s；61 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，59 ℃30 s；72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。普拉梭菌上下游引物分別為5'-GGAGGATTGACCCCTTCAGT-3'、5'-CTGGTCCCGAAGAAACACAT-3'；柔嫩梭菌上、下游引物分別為5'-GCACAAGCAGTG GAGT-3'、5'-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3'；雙歧桿菌上、下游引物分別為5'-CTCCTGGAAACG GGTGG-3'、5'-GGTGTTCTTCCCGATATCTA CA-3'；乳酸桿菌上、下游引物分別為5'-CTCGTT GCGGGACTTAA-3'、5'-GCAGCAGTAGGGAAT CTTC-3'[7-8]。

1.3.5 腸道短鏈脂肪酸測定 精密稱取糞便樣本0.3 g，預(yù)處理后配置乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用8860 GC氣相色譜儀（美國安捷倫公司）進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定性分析采用相對數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗。腸道細(xì)菌、短鏈脂肪酸和TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-6水平比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Logistic回歸分析慢性蕁麻疹的腸道保護(hù)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群比較

16S rDNA基因?qū)崟r熒光定量PCR結(jié)果顯示，慢性蕁麻疹組腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌豐度明顯少于對照組（t=4.061，P＜0.05；t=3.910，P＜0.05；t=3.858，P＜0.05）。2個組之間腸道雙歧桿菌豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.175，P>0.05）。見圖1。

圖1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群比較

2.2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道短鏈脂肪酸比較

與對照組比較，慢性蕁麻疹組腸道丁酸含量明顯下降（t=4.596，P＜0.05）。乙酸和丙酸含量2個組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.560，P>0.05；t=1.797，P>0.05）。見圖2。

圖2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道短鏈脂肪酸水平比較

2.3 慢性蕁麻疹與對照組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比較

與對照組比較，慢性蕁麻疹組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平明顯上升（t=-12.639，P＜0.05；t=-17.546，P＜0.05；t=-12.132，P＜0.05；t=-5.302，P＜0.05）。見圖3。

圖3 慢性蕁麻疹與對照組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比較

2.4 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6的相關(guān)性分析

腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌、丁酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平相關(guān)性分析

2.5 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群和短鏈脂肪酸多因素Logistic回歸分析

以慢性蕁麻疹為因變量，以腸道菌群（普拉梭菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌）和短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸是慢性蕁麻疹的保護(hù)因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.124、0.152、0.104、0.738，95%可信區(qū)間分別為0.030～0.520、0.033～0.689、0.016～0.698、0.575～0.946]。見表2。

表2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

慢性蕁麻疹與全身性炎癥相關(guān)的免疫反應(yīng)改變有關(guān)，而腸道菌群在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群與慢性蕁麻疹密切相關(guān)，并可能參與慢性蕁麻疹的發(fā)生、發(fā)展。有研究通過年齡和性別進(jìn)行匹配，招募并檢測慢性蕁麻疹患者和健康者腸道菌群的變化，結(jié)果顯示，與健康者比較，慢性蕁麻疹患者腸道中的柔嫩梭菌和普拉梭菌水平顯著下降，而腸桿菌科細(xì)菌水平無變化[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌水平顯著降低[10]。66%～93%的慢性蕁麻疹患者患有慢性自發(fā)性蕁麻疹，WANG等[11]通過16SrRNA基因測序分析慢性自發(fā)性蕁麻疹組和健康對照組腸道菌群，結(jié)果顯示，與健康對照組比較，慢性自發(fā)性蕁麻疹組腸道微生物種群的α多樣性降低；慢性自發(fā)性蕁麻疹患者腸道中腸桿菌科細(xì)菌豐度增加，而擬桿菌和雙歧桿菌的豐度顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，慢性蕁麻疹組腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌水平明顯下降，與文獻(xiàn)報道[10]基本一致；而雙歧桿菌水平2個組之間無變化，與文獻(xiàn)報道[10]不一致，可能與納入慢性蕁麻疹患者時未對疾病發(fā)展程度及類型進(jìn)行進(jìn)一步分類有關(guān)。

普拉梭菌和柔嫩梭菌均屬于梭菌Ⅳ簇，在胃腸道中主要產(chǎn)生丁酸，是健康人腸道微生物群中豐富的共生菌之一[12]。腸道中產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度的降低可減少通過過氧化物酶體增殖物激活的受體γ引起的上皮信號傳導(dǎo)，從而增加腔內(nèi)氧氣的生物利用度，導(dǎo)致大腸埃希菌和沙門菌等潛在致病性腸桿菌科細(xì)菌的大量增殖[13]。因此，產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度的降低會減少結(jié)腸細(xì)胞的重要能源，不利于機(jī)體健康。短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸，是腸道細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中丁酸是結(jié)腸細(xì)胞的主要能量底物，可刺激結(jié)腸中鈉和水的吸收，并對腸道細(xì)胞具有營養(yǎng)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，慢性蕁麻疹組腸道丁酸含量明顯下降，與產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌普拉梭菌和柔嫩梭菌下降一致。說明慢性蕁麻疹患者腸道主要產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度的減少會進(jìn)一步導(dǎo)致腸道中丁酸含量的降低。

有研究發(fā)現(xiàn)，普拉梭菌上清液對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎小鼠有顯著的疾病預(yù)防和治療作用，可能與通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低TNF-α、IL-6和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)有關(guān)[15]。此外，嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738可調(diào)節(jié)腸道菌群，改善β-乳球蛋白致敏小鼠的超敏反應(yīng)，并伴有TLR4/NF-κB信號表達(dá)減少。嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738的攝入可能與識別TLR信號傳導(dǎo)有關(guān)，可抑制變態(tài)反應(yīng)[16]，提示腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變及腸道微生物代謝產(chǎn)物可能會影響TLR4/NF-kB信號通路的傳導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可降低肝臟中TLR4的表達(dá)[17]。因此，我們推測腸道產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度的降低會導(dǎo)致丁酸含量降低，從而上調(diào)TLR4/NF-κB信號通路的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥因子水平升高。本研究中，慢性蕁麻疹患者血清中TLR4和NF-κB水平明顯高于健康對照者的結(jié)果驗證了這一推測。有文獻(xiàn)報道動物模型結(jié)腸組織中的TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)下調(diào)[15]，與本研究2個組之間血清TLR4和NF-κB水平比較結(jié)果基本一致。

激活TLR4/NF-κB信號通路可促進(jìn)TNF-α和IL-6的分泌[18-19]。本研究結(jié)果與其他多項研究結(jié)果[20-21]均表明，慢性蕁麻疹可能與血清TNF-α和IL-6水平升高有關(guān)。慢性蕁麻疹患者血清和皮膚組織中的TNF-α表達(dá)上調(diào)，抗TNF-α治療可能對這些患者有益。有研究用TNF-α抑制劑阿達(dá)木單抗、依那西普或英夫利昔單抗治療25例慢性蕁麻疹患者，其中15例（60%）產(chǎn)生完全反應(yīng)，包括奧馬珠單抗難治性的患者[22]。另有學(xué)者用TNF-α抑制劑治療6例慢性蕁麻疹患者后，患者癥狀得到完全緩解或部分改善[23]，提示TNF-α抑制劑可在一定程度上改善慢性蕁麻疹的癥狀。但抗IL-6療法是否同樣有效還需進(jìn)一步研究[24]。值得關(guān)注的是，通過給予慢性自發(fā)性蕁麻疹患者每天2次口服2種益生菌（唾液乳桿菌LS01和短雙歧桿菌BR03），持續(xù)8周，可能會降低一部分慢性自發(fā)性蕁麻疹患者的癥狀評分，提高生活質(zhì)量評分[25]，提示改善腸道菌群可能也是治療慢性蕁麻疹的一個方向。

本研究對慢性蕁麻疹患者和健康對照者腸道菌群、短鏈脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌及丁酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6均呈負(fù)相關(guān)。此外，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸是慢性蕁麻疹的保護(hù)因素，提示腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸水平的升高可降低炎癥因子的表達(dá)，有益于改善慢性蕁麻疹癥狀。

綜上所述，腸道菌群中產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌的減少可能會降低丁酸的含量，從而上調(diào)TLR4/NF-κB信號通路，導(dǎo)致TNF-α和IL-6的表達(dá)增加，加劇慢性蕁麻疹患者炎癥反應(yīng)和免疫功能失調(diào)，但其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。