腸道菌群對慢性蕁麻疹患者血清炎癥因子的影響

任 媛， 張 敏， 殷 翔， 曾倩雯

[1.陸軍特色醫(yī)學中心（大坪醫(yī)院）整形外科，重慶 400042；2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶 400038；3.陸軍特色醫(yī)學中心（大坪醫(yī)院）脊柱外科，重慶 400042；4.陸軍特色醫(yī)學中心（大坪醫(yī)院）皮膚科，重慶 400042]

蕁麻疹是臨床常見皮膚病，其特征是出現(xiàn)風疹和/或血管性水腫，分為急性蕁麻疹和慢性蕁麻疹。急性蕁麻疹主要與食物、藥物、感染、過敏或擬過敏反應有關；慢性蕁麻疹是一種自發(fā)性，或可被誘發(fā)的疾病，持續(xù)時間超過6周。一部分急性蕁麻疹可能會轉變?yōu)槁允n麻疹。與急性蕁麻疹相比，慢性蕁麻疹是一種更復雜的疾病，可能與免疫、炎癥和凝血失衡有關[1]。目前，關于慢性蕁麻疹的研究較多，但其發(fā)病機制尚不明確。腸道菌群是一個復雜的生物生態(tài)系統(tǒng)，與宿主腸上皮細胞相互作用，并在宿主健康和疾病平衡中起著重要的作用。有研究結果表明，腸道菌群組成和/或活動（營養(yǎng)不良）的紊亂可能是過敏性疾病的發(fā)病機制，腸道定植細菌與位于腸上皮和樹突狀細胞上的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）反應，可刺激免疫效應細胞的信號通路[2]。短鏈脂肪酸是腸道微生物通過膳食纖維發(fā)酵而產(chǎn)生的，被認為是宿主腸道的重要能量來源，包括乙酸、丙酸和丁酸，這些代謝產(chǎn)物被宿主利用，發(fā)揮它們在機體中的作用[3]。有研究者發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平明顯高于對照組，表明這些炎癥因子在慢性蕁麻疹發(fā)病機制中有重要作用，并有可能為治療慢性蕁麻疹的新策略提供理論依據(jù)[4-5]。本研究通過分析慢性蕁麻疹患者腸道菌群、腸道短鏈脂肪酸、血清TLR4、核因子（nuclear factor，NF）-κB、TNF-α和IL-6水平的關系，探討慢性蕁麻疹患者腸道菌群對血清炎癥因子的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年8月大坪醫(yī)院皮膚科收治的慢性蕁麻疹患者，同時招募大坪醫(yī)院體檢健康者。所有研究對象排便習慣正常，6個月內未使用抗菌藥物、甾體類藥物和微生態(tài)制劑，未發(fā)生過非創(chuàng)傷性感染、過敏、免疫異常疾病、慢性腸胃功能紊亂、胃腸道疾病，近期未進行過手術，無心理和行為學異常[6]。最終納入慢性蕁麻疹患者60例（慢性蕁麻疹組），其中男31例、女29例，年齡（43.40±11.75）歲；體檢健康者60名（健康對照組），其中男35名、女25名，年齡（45.30±13.92）歲。2個組之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經(jīng)大坪醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有研究對象均知情同意。

1.2 儀器與試劑

IQ5實時熒光定量PCR擴增儀（美國伯樂公司），試劑盒購自日本TaKaRA公司；人糞便細菌DNA提取試劑盒（德國凱杰公司）；去核酸水[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 采用肛拭子收集所有研究對象晨起空腹中段糞便樣本，標記姓名及分組后放入液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另采集所有研究對象晨起空腹靜脈血，離心收集血清，置于1.5 mL Eppendorf管中，標記姓名及分組，同樣置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6檢測 從-80 ℃冰箱中取出血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。

1.3.3 細菌總DNA提取 從-80 ℃冰箱中取出糞便樣本，嚴格按照細菌DNA提取試劑盒說明書要求進行操作，采用NanoOne微量分光光度計（杭州佑寧儀器有限公司）檢測提取的總DNA的純度和濃度。

1.3.4 目標菌16S rDNA基因檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測所有研究對象腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌。PCR反應體系為25 μL，包括上、下游引物各1 μL、去核酸水8.5 μL、熒光染料12.5 μL、總DNA模板2 μL（60 ng）。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃15 s；61 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，59 ℃30 s；72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。普拉梭菌上下游引物分別為5'-GGAGGATTGACCCCTTCAGT-3'、5'-CTGGTCCCGAAGAAACACAT-3'；柔嫩梭菌上、下游引物分別為5'-GCACAAGCAGTG GAGT-3'、5'-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3'；雙歧桿菌上、下游引物分別為5'-CTCCTGGAAACG GGTGG-3'、5'-GGTGTTCTTCCCGATATCTA CA-3'；乳酸桿菌上、下游引物分別為5'-CTCGTT GCGGGACTTAA-3'、5'-GCAGCAGTAGGGAAT CTTC-3'[7-8]。

1.3.5 腸道短鏈脂肪酸測定 精密稱取糞便樣本0.3 g，預處理后配置乙酸、丙酸和丁酸標準品，采用8860 GC氣相色譜儀（美國安捷倫公司）進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。定性分析采用相對數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗。腸道細菌、短鏈脂肪酸和TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-6水平比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Logistic回歸分析慢性蕁麻疹的腸道保護因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群比較

16S rDNA基因實時熒光定量PCR結果顯示，慢性蕁麻疹組腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌豐度明顯少于對照組（t=4.061，P＜0.05；t=3.910，P＜0.05；t=3.858，P＜0.05）。2個組之間腸道雙歧桿菌豐度差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.175，P>0.05）。見圖1。

圖1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群比較

2.2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道短鏈脂肪酸比較

與對照組比較，慢性蕁麻疹組腸道丁酸含量明顯下降（t=4.596，P＜0.05）。乙酸和丙酸含量2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.560，P>0.05；t=1.797，P>0.05）。見圖2。

圖2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道短鏈脂肪酸水平比較

2.3 慢性蕁麻疹與對照組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比較

與對照組比較，慢性蕁麻疹組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平明顯上升（t=-12.639，P＜0.05；t=-17.546，P＜0.05；t=-12.132，P＜0.05；t=-5.302，P＜0.05）。見圖3。

圖3 慢性蕁麻疹與對照組血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比較

2.4 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6的相關性分析

腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌、丁酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平均呈負相關（P＜0.05）。見表1。

表1 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平相關性分析

2.5 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群和短鏈脂肪酸多因素Logistic回歸分析

以慢性蕁麻疹為因變量，以腸道菌群（普拉梭菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌）和短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸是慢性蕁麻疹的保護因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.124、0.152、0.104、0.738，95%可信區(qū)間分別為0.030～0.520、0.033～0.689、0.016～0.698、0.575～0.946]。見表2。

表2 慢性蕁麻疹組與對照組腸道菌群、短鏈脂肪酸多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

慢性蕁麻疹與全身性炎癥相關的免疫反應改變有關，而腸道菌群在免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群與慢性蕁麻疹密切相關，并可能參與慢性蕁麻疹的發(fā)生、發(fā)展。有研究通過年齡和性別進行匹配，招募并檢測慢性蕁麻疹患者和健康者腸道菌群的變化，結果顯示，與健康者比較，慢性蕁麻疹患者腸道中的柔嫩梭菌和普拉梭菌水平顯著下降，而腸桿菌科細菌水平無變化[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌水平顯著降低[10]。66%～93%的慢性蕁麻疹患者患有慢性自發(fā)性蕁麻疹，WANG等[11]通過16SrRNA基因測序分析慢性自發(fā)性蕁麻疹組和健康對照組腸道菌群，結果顯示，與健康對照組比較，慢性自發(fā)性蕁麻疹組腸道微生物種群的α多樣性降低；慢性自發(fā)性蕁麻疹患者腸道中腸桿菌科細菌豐度增加，而擬桿菌和雙歧桿菌的豐度顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，慢性蕁麻疹組腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌水平明顯下降，與文獻報道[10]基本一致；而雙歧桿菌水平2個組之間無變化，與文獻報道[10]不一致，可能與納入慢性蕁麻疹患者時未對疾病發(fā)展程度及類型進行進一步分類有關。

普拉梭菌和柔嫩梭菌均屬于梭菌Ⅳ簇，在胃腸道中主要產(chǎn)生丁酸，是健康人腸道微生物群中豐富的共生菌之一[12]。腸道中產(chǎn)丁酸鹽細菌豐度的降低可減少通過過氧化物酶體增殖物激活的受體γ引起的上皮信號傳導，從而增加腔內氧氣的生物利用度，導致大腸埃希菌和沙門菌等潛在致病性腸桿菌科細菌的大量增殖[13]。因此，產(chǎn)丁酸鹽細菌豐度的降低會減少結腸細胞的重要能源，不利于機體健康。短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸，是腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中丁酸是結腸細胞的主要能量底物，可刺激結腸中鈉和水的吸收，并對腸道細胞具有營養(yǎng)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，慢性蕁麻疹組腸道丁酸含量明顯下降，與產(chǎn)丁酸鹽細菌普拉梭菌和柔嫩梭菌下降一致。說明慢性蕁麻疹患者腸道主要產(chǎn)丁酸鹽細菌豐度的減少會進一步導致腸道中丁酸含量的降低。

有研究發(fā)現(xiàn)，普拉梭菌上清液對葡聚糖硫酸鈉誘導的實驗性結腸炎小鼠有顯著的疾病預防和治療作用，可能與通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低TNF-α、IL-6和環(huán)氧合酶-2的表達有關[15]。此外，嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738可調節(jié)腸道菌群，改善β-乳球蛋白致敏小鼠的超敏反應，并伴有TLR4/NF-κB信號表達減少。嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738的攝入可能與識別TLR信號傳導有關，可抑制變態(tài)反應[16]，提示腸道菌群結構的改變及腸道微生物代謝產(chǎn)物可能會影響TLR4/NF-kB信號通路的傳導。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可降低肝臟中TLR4的表達[17]。因此，我們推測腸道產(chǎn)丁酸鹽細菌豐度的降低會導致丁酸含量降低，從而上調TLR4/NF-κB信號通路的表達，導致炎癥因子水平升高。本研究中，慢性蕁麻疹患者血清中TLR4和NF-κB水平明顯高于健康對照者的結果驗證了這一推測。有文獻報道動物模型結腸組織中的TLR4/NF-κB信號通路表達下調[15]，與本研究2個組之間血清TLR4和NF-κB水平比較結果基本一致。

激活TLR4/NF-κB信號通路可促進TNF-α和IL-6的分泌[18-19]。本研究結果與其他多項研究結果[20-21]均表明，慢性蕁麻疹可能與血清TNF-α和IL-6水平升高有關。慢性蕁麻疹患者血清和皮膚組織中的TNF-α表達上調，抗TNF-α治療可能對這些患者有益。有研究用TNF-α抑制劑阿達木單抗、依那西普或英夫利昔單抗治療25例慢性蕁麻疹患者，其中15例（60%）產(chǎn)生完全反應，包括奧馬珠單抗難治性的患者[22]。另有學者用TNF-α抑制劑治療6例慢性蕁麻疹患者后，患者癥狀得到完全緩解或部分改善[23]，提示TNF-α抑制劑可在一定程度上改善慢性蕁麻疹的癥狀。但抗IL-6療法是否同樣有效還需進一步研究[24]。值得關注的是，通過給予慢性自發(fā)性蕁麻疹患者每天2次口服2種益生菌（唾液乳桿菌LS01和短雙歧桿菌BR03），持續(xù)8周，可能會降低一部分慢性自發(fā)性蕁麻疹患者的癥狀評分，提高生活質量評分[25]，提示改善腸道菌群可能也是治療慢性蕁麻疹的一個方向。

本研究對慢性蕁麻疹患者和健康對照者腸道菌群、短鏈脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌及丁酸與血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6均呈負相關。此外，多因素Logistic回歸分析結果顯示，腸道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸是慢性蕁麻疹的保護因素，提示腸道普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸桿菌和丁酸水平的升高可降低炎癥因子的表達，有益于改善慢性蕁麻疹癥狀。

綜上所述，腸道菌群中產(chǎn)丁酸鹽細菌的減少可能會降低丁酸的含量，從而上調TLR4/NF-κB信號通路，導致TNF-α和IL-6的表達增加，加劇慢性蕁麻疹患者炎癥反應和免疫功能失調，但其機制還需進一步研究。