骨髓血管內(nèi)皮生長因子水平在彌漫性大B細胞淋巴瘤療效監(jiān)測中的價值

李 斌， 趙 冬， 黃 蓉， 郭娟蓀

（1.安康市中醫(yī)醫(yī)院血液風濕科，陜西 安康 725000；2.延安大學附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 延安 716000；3.安康市中心醫(yī)院感染性疾病科，陜西 安康 725000）

在我國，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）占惡性淋巴瘤的比例遠高于霍奇金?。℉odgkin disease，HD）[1]。由于骨髓受累預示著NHL患者的治療效果較差，且骨髓受累也會阻礙造血干細胞的生成，因此對NHL患者骨髓受累的評估至關(guān)重要。目前，NHL骨髓受累的臨床診斷多采用骨髓穿刺活檢，但穿刺所取的小片骨髓不能完整反映整個骨髓的病理狀態(tài)，因此骨髓穿刺活檢有一定的局限性[2]。更重要的是，骨髓檢查只顯示NHL患者骨髓受累的結(jié)果，并不能反映腫瘤細胞入侵骨髓的情況。為了更好地預測NHL患者腫瘤細胞入侵骨髓的風險，臨床亟需尋找一種新的生物標志物。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促血管生成的細胞因子，可通過增加血管通透性刺激新生血管的形成，促進腫瘤生長，在血管生成中起重要作用[3]。彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是NHL的常見類型之一，有研究結(jié)果顯示，VEGF有望成為新的DLBCL臨床診斷標志物[4]。目前，大部分研究在檢測DLBCL患者VEGF水平時所用的樣本為血清，由于在收集患者外周血時會發(fā)生凝血現(xiàn)象，此時血小板（platelet，PLT）會釋放VEGF，導致血清VEGF水平升高。為此，本研究擬探討骨髓VEGF水平在DLBCL療效監(jiān)測中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2012年1月—2016年1月來安康市中醫(yī)醫(yī)院接受治療的DLBCL患者40例（男22例、女18例，年齡26～80歲），其中臨床分期Ⅰ期4例、Ⅱ期10例、Ⅲ期7例、Ⅳ期19例。40例DLBCL患者中有8例發(fā)生骨髓侵入，32例未發(fā)生骨髓侵入；有18例發(fā)生結(jié)外侵入，22例未發(fā)生結(jié)外侵入。美國東部腫瘤協(xié)作組（the Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分0分15例、1分22例、≥2分3例；國際預后指數(shù)（international prognosis index，IPI）評分0～1分10例、2分11例、3分12例、4分7例。所有患者均采用利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案（環(huán)磷酰胺、吡柔比星、長春新堿和潑尼松）治療6個療程。本研究獲得安康市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 經(jīng)骨髓穿刺活檢和全血細胞計數(shù)確診為DLBCL，無其他臟器衰竭，無相關(guān)惡性腫瘤、自身免疫疾病及器官移植病史，由患者本人或直系親屬簽署知情同意書，同意提供患者的詳細資料。

1.2.2 排除標準 合并心、肝、脾、肺、腎等器官損傷者，既往存在乙醇依賴或毒品依賴者，未簽署科研研究知情同意書者。

1.3 療效評價

采用Cheson標準評價療效[5]。（1）完全緩解（complete response，CR）：所有的病灶證據(jù)均消失；（2）部分緩解（partial response，PR）：可測量病灶縮小，無新病灶；（3）疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：未達CR、PR或疾病進展（progressive disease，PD）；（4）PD：出現(xiàn)任何新增加的病灶或原病灶直徑增大≥50%。根據(jù)療效將所有患者分為治療有效組（28例）和治療無效組（12例）。CR和PR為治療有效，SD和PD為治療無效。

1.4 方法

參照文獻[6]采集患者治療后骨髓樣本，1 006×g離心10 min，分離骨髓中的血漿，-80 ℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測骨髓VEGF水平，試劑盒購自美國R&D公司。采用RT7200全自動血液分析儀（深圳雷杜公司）及配套試劑檢測骨髓PLT。采用速率法檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），試劑盒購自上海經(jīng)科化學科技有限公司，檢測儀器為AU2700全自動生化分析儀（日本奧林巴斯公司）。計算VEGF/PLT比值。

1.5 隨訪

臨床醫(yī)師通過門診復查病例資料和電話隨訪獲取相關(guān)信息，隨訪至患者死亡或2019年1月31日。患者從開始接受治療到觀察到疾病發(fā)生進展或任何原因?qū)е碌乃劳鲋g的時間為無進展生存時間（progression free survival，PFS），治療開始至死亡或末次隨訪日期為總生存時間（overall survival time，OS）。本研究隨訪時間為13～58個月，中位隨訪時間為36.2個月。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，當1＜理論數(shù)＜5時采用χ2校正檢驗，當理論數(shù)＜1時采用Fisher確切概率法。采用Spearman相關(guān)分析評估各參數(shù)間的相關(guān)性，采用非線性相關(guān)性分析評估非等級相關(guān)資料的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存曲線。采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，確定影響患者OS和PFS的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間VEGF、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較

年齡≥65歲、ECOG評分≥2分、IPI評分>3分、治療無效的DLBCL患者骨髓VEGF水平分別高于年齡＜65歲、ECOG評分＜2分、IPI評分≤3分、治療有效的DLBCL患者（P＜0.05），PLT計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。腫瘤細胞未侵犯骨髓的DLBCL患者PLT計數(shù)高于腫瘤細胞侵犯骨髓的DLBCL患者（P＜0.05），骨髓VEGF水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。年齡≥65歲、腫瘤細胞侵入骨髓、IPI評分>3分、治療無效的DLBCL患者VEGF/PLT比值分別高于年齡＜65歲、腫瘤細胞未侵入骨髓、IPI評分≤3分、治療有效的DLBCL患者（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間骨髓VEGF、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

表1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間骨髓VEGF、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

病理參數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6 pg性別男性 542.25±125.23 225.65±22.56 2.74±0.16女性 559.65±124.62 256.52±22.59 2.21±0.12 P值 0.85 0.16 0.55年齡＜65歲 335.65±56.59 254.62±26.36 1.62±0.15≥65歲 652.38±57.52 209.61±65.25 3.55±0.12 P值 0.03 0.33 ＜0.01臨床分期Ⅰ～Ⅱ 586.62±102.36 235.62±63.23 1.95±0.06Ⅲ～Ⅳ 526.34±112.63 240.11±66.59 3.05±0.14 P值 0.59 0.09 0.26 ECOG評分0～1分 552.64±128.62 236.52±36.58 2.26±0.08≥2分 1025.81±142.95 255.47±55.26 4.06±0.21 P值 0.03 0.52 0.16

續(xù)表1 ±s

續(xù)表1 ±s

病理參數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6 pg腫瘤細胞是否侵入骨髓侵入 542.16±102.65 135.26±70.23 4.68±0.33未侵入 561.03±115.26 244.52±81.26 2.99±0.15 P值 0.52 0.01 0.01是否有結(jié)外侵入結(jié)外侵入 574.26±148.26 225.62±61.02 3.32±0.52無結(jié)外侵入 456.38±106.38 245.32±52.16 1.65±0.41 P值 0.51 0.33 0.15 LDH＜700 IU/L 574.32±88.56 229.52±93.52 3.32±0.33≥700 IU/L 549.55±90.54 241.36±81.20 1.65±0.24 P值 0.52 0.62 0.33 IPI評分≤3分 456.29±105.87 254.32±36.59 1.85±0.15>3分 885.62±115.63 186.39±26.55 4.35±0.54 P值 0.02 0.15 ＜0.01治療反應有效 406.35±125.33 286.62±35.84 1.62±0.23無效 956.32±156.34 182.34±40.12 3.95±0.52 P值 ＜0.01 0.19 0.01

2.2 DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計數(shù)的相關(guān)性

DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.33，P＜0.05），見圖1。

圖1 DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計數(shù)的相關(guān)性

2.3 治療有效與治療無效DLBCL患者骨髓VEGF水平、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較

治療有效組VEGF/PLT比值低于治療無效組（P＜0.05），而骨髓VEGF水平、PLT計數(shù)2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 治療有效組與治療無效組骨髓VEGF水平、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

表2 治療有效組與治療無效組骨髓VEGF水平、PLT計數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

注：空白表示無此項。

組別 例數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6pg治療有效組 28 654.8±60.6 245.1±13.2 3.0±0.4治療無效組 12 661.4±48.1 252.0±11.1 3.4±0.7 t值 -0.334 -1.584 -2.293 P值 0.370 0.061 0.014

2.4 DLBCL患者的Kaplan-Meier生存曲線

按VEGF/PLT比值的均值分為＜3×10-6pg組和≥3×10-6pg組。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，VEGF/PLT比值＜3×10-6pg組的PFS、OS高于VEGF/PLT比值≥3×10-6pg組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同VEGF/PLT比值DLBCL患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 影響DLBCL患者PFS和OS的多因素分析

Cox比例風險回歸分析結(jié)果顯示，VEGF/PLT比值是影響DLBCL患者PFS的危險因素[風險比（hazard ratio，HR）=3.277，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為2.276～5.901]；ECOG評分、IPI評分、骨髓VEGF水平是影響DLBCL患者OS的危險因素（HR值分別為4.26、3.33、3.52，95%CI分別為3.102～5.466、2.257～5.009、2.620～4.104）。VEGF/PLT比值越大、ECOG評分越高、IPI評分越高、骨髓VEGF水平越高，DLBCL患者預后越差。見表3。

表3 DLBCL患者PFS和OS影響因素的多因素分析

3 討論

目前，臨床上治療DLBCL的主要方法是抑制腫瘤血管再生[6]。近幾年來，關(guān)于血管再生與造血系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究取得了一定的進展，有學者發(fā)現(xiàn)血管再生對多種血液系統(tǒng)疾病都有重要的預后判斷價值[7-8]。VEGF是重要的促血管生成因子，能夠維持正常血管再生及成熟，促進內(nèi)皮細胞活化及遷移[9]。當腫瘤細胞發(fā)生癌基因活化、血管內(nèi)皮細胞增殖和巨噬細胞增殖時，VEGF均可通過自/旁分泌方式特異作用于血管內(nèi)皮細胞受體，促進內(nèi)皮細胞增殖，促進腫瘤生長[10]。有研究結(jié)果顯示，VEGF水平高表達與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-13]。VEGF在淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中具有重要的臨床價值[14]。柳曉雷[15]檢測了急性白血病患者和無骨髓浸潤淋巴瘤患者的血漿及骨髓中的VEGF水平，發(fā)現(xiàn)急性白血病患者骨髓VEGF水平顯著高于血漿VEGF水平（P＜0.05），而無骨髓浸潤的淋巴瘤患者血漿VEGF水平高于骨髓VEGF水平（P＜0.05），提示在不同腫瘤及血液系統(tǒng)疾病中，VEGF的作用機制不同。因此，有必要對VEGF在不同疾病中的價值進行研究。

本研究除檢測骨髓VEGF水平外，還選擇PLT計數(shù)和VEGF/PLT比值作為骨髓VEGF表達的參照。主要原因在于骨髓富含造血細胞，骨髓中VEGF的來源不僅是腫瘤細胞，還可能包括血細胞，尤其是PLT。采用PLT計數(shù)校準的VEGF水平比VEGF水平本身與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性更強[16]。在研究DLBCL患者的VEGF水平時引入PLT計數(shù)，可以從另一方面反映骨髓VEGF水平檢測的臨床價值。

本研究結(jié)果顯示，VEGF水平與PLT計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.33，P＜0.05），但r值較低。這是因為在正常情況下，人體內(nèi)的VEGF主要由PLT分泌，但當存在腫瘤時，腫瘤細胞也會分泌大量的VEGF，促進血管生長，以支持腫瘤的快速增殖。本研究結(jié)果顯示，年齡≥65歲、ECOG評分≥2分、IPI評分>3分以及治療無效的DLBCL患者骨髓VEGF水平較高，腫瘤細胞未侵入骨髓的DLBCL患者PLT計數(shù)較高，年齡≥65歲、腫瘤細胞侵入骨髓、IPI評分>3分以及治療無效的DLBCL患者VEGF/PLT比值較高，與KIM等[17]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，VEGF/PLT比值＜3×10-6pg組的PFS、OS高于VEGF/PLT比值≥3×10-6pg組（P＜0.05）。表明可將骨髓VEGF、VEGF/PLT比值判斷DLBCL預后的臨界值設為655 pg/mL、3×10-6pg，當骨髓VEGF＜655 pg/mL、VEGF/PLT比值＜3×10-6pg時，DLBCL患者的預后相對較好。VEGF水平過高，可刺激內(nèi)皮細胞增生，增加腫瘤高血源性和高淋巴源性擴散的風險；VEGF/PLT比值偏大，提示VEGF水平過高或PLT數(shù)量偏少，不利于抗炎、止血、修復破損血管，有利于腫瘤細胞擴散。

總之，骨髓VEGF水平與DLBCL患者預后有關(guān)。隨著研究的深入，關(guān)于VEGF在腫瘤中的作用機制以及VEGF基因和蛋白深層次的調(diào)控網(wǎng)絡將被一一揭示，骨髓VEGF水平或可為血管形成相關(guān)疾病的診斷和治療提供依據(jù)。