Y-STR基因座在鑒別Ⅰ期臨床試驗混淆生物樣本中的應(yīng)用初探

曾麗艷 王 倩 柯 晶 董華娟 孟現(xiàn)民

（上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心 上海 201500）

Ⅰ期臨床試驗是藥物有效性和安全性評價的重要環(huán)節(jié)，采集自受試者的生物樣本是后續(xù)檢測分析的基礎(chǔ)，因生物樣本是有限而寶貴的樣本資源，所以對生物樣本進行有效管理是臨床試驗質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)［1-2］。然而在生物樣本采集的過程中，難免出現(xiàn)標(biāo)識信息不清楚或者標(biāo)簽脫落的情況，時常因無法識別生物樣本的個體來源而將其銷毀處理，這不僅造成了資源的浪費，而且試驗數(shù)據(jù)的缺失在一定程度上導(dǎo)致了臨床試驗結(jié)果的偏倚［3-5］。我院開展的一項Ⅰ期臨床試驗中，研究護師在采集10號和22號受試者血液樣本時（10號受試者為女性，22號受試者為男性），因采血管負(fù)壓出現(xiàn)問題而緊急更換了兩支空白標(biāo)簽的備用采血管，導(dǎo)致血液樣本送到實驗室后，實驗室工作人員無法判定這兩個樣本來自哪個個體。研究報道Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（Y-chromosomal short tandem repeat，YSTR）是位于男性Y染色體上的人類多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）位點，一般情況下，只有男性個體才有Y染色體，因此，Y-STR具有男性遺傳、男性特異性的特點，Y-STR可作為性別鑒定的依據(jù)，在標(biāo)準(zhǔn)常染色體DNA譜分析不能提供信息的情況下常被法醫(yī)用于DNA分析［6］，如在調(diào)查性侵案件的司法取證和父系譜系分化中非常有用［7］。但是，至今國內(nèi)外未有將Y-STR檢測運用于Ⅰ期臨床試驗的研究報導(dǎo)。為了保證臨床試驗數(shù)據(jù)的完整性，本文首次創(chuàng)新性地將Y-STR檢測方法運用于Ⅰ期臨床試驗中，以探討該方法在Ⅰ期臨床試驗生物樣本來源識別中的應(yīng)用。

資料和方法

樣本來源某生物等效性實驗空腹試驗部分第一周期第13個采血點因標(biāo)簽標(biāo)識不清而無法辨別的10號和22號受試者全血樣本（6 mL EDTA抗凝采血管）2管，實驗時分別編號為：A和B。已知男性全血樣本1管，作為陽性對照，編號為P。已知女性全血樣本1管，作為陰性對照，編號為N。

儀器與試劑血基因組DNA小量試劑盒和D15000 Marker（美國Axygen公司），Trans2K Plus DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖和6×加樣緩沖液（美國Genview公司），2×PCR buffer Mix、Ex Taq HS和dd H2O（日 本TaKaRa公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），紫外凝膠成像儀（北京天根生化科技有限公司）。引物合成由美國Invitrogen公司完成。

DNA抽提將P、N、A和B 4支采血管放于低溫離心機中，4℃、1 200×g離心10 min，分別分離血漿和血細(xì)胞沉淀，留作備用，離心操作在采血后2 h內(nèi)完成。按照血基因組DNA小量試劑盒說明書分別提取200μL血漿和200μL血細(xì)胞沉淀中的DNA。

基因座選擇和引物設(shè)計根據(jù)Y-STR基因座DYS460［8］的序列特征，設(shè)定所選目標(biāo)基因座的片段大小，用Primer 5.0軟件分別設(shè)計正反引物序列（表1）。DYS513［9］和DYS570［10］的 引 物 序 列 來 源 于 參考文獻（表1）。

表1 DYS460、DYS513和DYS570的正反引物序列和產(chǎn)物片段大小Tab 1 The sequence of the forward and reverse primers and product fragment sizesof DYS460，DYS513 and DYS570

PCR擴增基因片段將引物稀釋成濃度10 mol/L，每對正反引物各取10μL混合，形成PCR引物混合液。DNA模板分別吸取A和B的血漿和血細(xì)胞樣本中提取的DNA。制備25μL的PCR反應(yīng)液為：12.5μL 2×PCR buffer Mix、2μL Ex Taq HS、6μL dd H2O、2μL PCR引物混合液和2.5μL DNA模板，將PCR反應(yīng)液放于PCR擴增儀中擴增（反應(yīng)條件見表2）。

表2 體外擴增Y-STR基因座片段（DYS460、DYS 513和DYS 570）的反應(yīng)條件Tab 2 The reaction conditions of Y-STR locus（DYS460，DYS 513 and DYS 570）amplified in vitro

DNA檢測各取5μL DNA模板，加入1μL 6×加樣緩沖液混勻。制備1%瓊脂糖凝膠，將混合液加入凝膠孔中，D15000 Marker作為參照，于120 V電壓下電泳15 min。電泳結(jié)束后，于紫外凝膠成像儀中拍照觀察。

PCR產(chǎn)物檢測各取5μL PCR產(chǎn)物模板，加入1μL 6×加樣緩沖液混勻。制備2%瓊脂糖凝膠，將混合液加入凝膠孔中，Trans2K Plus DNA Marker作為參照，于120 V電壓下電泳20 min。電泳結(jié)束后，于紫外凝膠成像儀中拍照觀察。

結(jié) 果

P、N、A和B的血細(xì)胞中均抽提到DNAP和N樣本的血細(xì)胞DNA、A和B樣本的血漿和血細(xì)胞DNA分別用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示。A和B血漿DNA樣本均無主條帶，而P、N、A和B血細(xì)胞樣本有清晰的DNA主條帶，表明A和B的血漿中DNA含量可能非常少而無法用瓊脂糖凝膠電泳分離出，而P、N、A和B的血細(xì)胞中均成功抽提到了DNA。

圖1 血細(xì)胞和血漿的DNA電泳結(jié)果Fig 1 DNA electrophoresis results of blood cells and plasma

圖2 體外擴增DYS460、DYS513和DYS570基因座的電泳結(jié)果Fig 2 Electrophoresisresults of in vitro amplification of DYS460，DYS513 and DYS570 loci

A樣本的血細(xì)胞DNA均擴增出3個Y-STR基因座P和N樣本的血細(xì)胞DNA、A和B樣本的血漿和血細(xì)胞DNA均分別用3個Y-STR基因座（DYS460、DYS513和DYS570）的引物進行擴增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。結(jié)果如圖2所示，作為陰性對照的N樣本血細(xì)胞DNA以及B樣本的血細(xì)胞DNA和血漿DNA都無法擴增出YSTR基因座條帶，而作為陽性對照的P樣本血細(xì)胞DNA以及A的血細(xì)胞DNA樣本中均擴增出3個YSTR基因座，且產(chǎn)物條帶大小與理論值（表1）相符，說明A樣本為20號男性受試者的樣本，B樣本為10號女性受試者的樣本。因A樣本的血漿幾乎不含Y染色體DNA，因此也無法擴增出產(chǎn)物。

討 論

Ⅰ期臨床試驗常涉及密集采血，血液采集數(shù)量多、時間短、要求高，涉及環(huán)節(jié)也比較多，加上操作人員的熟練程度、受試者的靜脈條件、采血管壓力等原因，會出現(xiàn)臨床樣本標(biāo)識不清、標(biāo)簽脫落等情況，導(dǎo)致無法辨別樣本來自哪個個體。

自2015年7月原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《關(guān)于開展藥物臨床試驗數(shù)據(jù)自查核查工作的公告（2015年第117號）》以后，藥物臨床試驗數(shù)據(jù)完整性問題越來越受到重視，臨床試驗質(zhì)量的控制措施進一步被細(xì)化［11-12］。因此，建立鑒定混淆生物樣本的應(yīng)急管理措施，能夠為后續(xù)生物樣本的檢測和數(shù)據(jù)的完整性提供樣本基礎(chǔ)，從而保障臨床試驗的質(zhì)量。

本文以血細(xì)胞DNA為模板，選取Y染色體的3個基因座（DYS460、DYS513和DYS570），成功鑒別出2個不同性別受試者的血液樣本。針對不同性別受試者的血液樣本混淆的情況，此方法可以作為生物樣本質(zhì)量控制中的一種應(yīng)急措施，建議將其納入生物樣本質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序中。然而，本文探討的案例限于兩位異性受試者樣本的鑒別，至于多位男性受試者的樣本的鑒別方法，因Y-STR的基因多樣性和單倍型多樣性［13-14］，以及Y-STR基因座存在突變的可能［15-16］，建議可以利用個人前后采血點的樣本進行Y-STR的檢測和比對分析，但是其中涉及的相關(guān)倫理問題還需要進一步研究決定。為了盡可能避免樣本標(biāo)識數(shù)據(jù)缺失的情況，除了在樣本采集前對物品進行充分準(zhǔn)備外，也應(yīng)對研究護師加強培訓(xùn)，如可以配備一名機動護師在旁邊，幫助采血護師及時補上樣本標(biāo)識信息。此外，本文提倡的應(yīng)急措施還需進一步建立統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，有待在后續(xù)研究中進行完善。

作者貢獻聲明曾麗艷 論文構(gòu)思，實驗執(zhí)行，數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計分析，論文撰寫和修訂。王倩 數(shù)據(jù)分析、論文撰寫和修訂?？戮?文獻調(diào)研和整理。董華娟 論文修訂。孟現(xiàn)民 研究指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。