基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究NCAM 1在運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓及特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓中的差異表達(dá)

何楊柯 易 鑫 李卓霖 黃 瑋

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 重慶 400016）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是死亡率高、診斷時(shí)間晚且無(wú)法徹底治愈的惡性病。在我國(guó)，未經(jīng)治療的PAH患者5年生存率僅為21%［1］。PAH早期癥狀隱匿，經(jīng)常被誤診和漏診，患者從出現(xiàn)癥狀到確診，平均需要27個(gè)月，對(duì)于無(wú)典型危險(xiǎn)因素的特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（idiopathic PAH，IPAH）患者，診斷時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)47個(gè)月［2］。臨床上，超過(guò)75%的PAH患者確診時(shí)WHO心功能為Ⅲ或Ⅳ級(jí)［3］。早期診斷并得到有效治療的PAH患者遠(yuǎn)期生存率遠(yuǎn)高于中晚期診斷的PAH患者，因此早期診斷對(duì)改善PAH患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用的PAH篩查方法，如超聲心動(dòng)圖、心電圖、MRI、B型鈉尿肽、肌鈣蛋白等，均不能提示早期改變。無(wú)創(chuàng)的心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)（cardiopulmonary exercise testing，CPET）會(huì)發(fā)現(xiàn)PAH患者早期運(yùn)動(dòng)耐量下降，但不能早期診斷PAH。侵入性心肺運(yùn)動(dòng)試 驗(yàn)（invasive cardiopulmonary exercise testing，iCPET）是美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院率先開(kāi)展的新技術(shù)，可診斷運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的PAH（exercise induced PAH，EiPAH）。與非侵入性CPET不同的是，iCPET運(yùn)動(dòng)前需要置入肺動(dòng)脈導(dǎo)管和橈動(dòng)脈導(dǎo)管，這一關(guān)鍵區(qū)別可提供休息和運(yùn)動(dòng)時(shí)完整的心肺血流動(dòng)力學(xué)和外周組織血?dú)夥治龅南嚓P(guān)數(shù)據(jù)。如果患者有不明原因的呼吸困難（排除心力衰竭、PAH及原發(fā)性肺?。?，靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查平均肺動(dòng)脈壓力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）<25 mmHg（1 mmHg=0.133 k Pa，下同），各項(xiàng)檢測(cè)值均正常，即可行iCPET檢查，通過(guò)運(yùn)動(dòng)時(shí)mPAPmax≥30 mmHg且肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）PVRmax≥120 dyne·s·cm-5，即 可診斷為EiPAH，其可能是PAH早期階段。

本研究旨在通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)液相質(zhì)譜等技術(shù)，觀察在EiPAH、IPAH患者血漿中人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（human neural cell adhesion molecule 1，NCAM 1）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，為進(jìn)一步揭示其與疾病的關(guān)系以及研究PAH早期生物標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

資料和方法

患者資料及分組經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，根據(jù)入組診斷標(biāo)準(zhǔn)，回顧性分析2016年1月至2018年11月我院心血管內(nèi)科收治的14例EiPAH及IPAH患者。IPAH診斷標(biāo)準(zhǔn)：2015年歐洲心臟病學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)《肺動(dòng)脈高壓診斷和治療指南》［4］，由我院心血管內(nèi)科導(dǎo)管室行右心導(dǎo)管術(shù)后確診。EiPAH診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院附屬Brigham and Women’s Hospital肺血管中心主任Waxman等［5］制定的iCPET診斷標(biāo)準(zhǔn)，由我院心血管內(nèi)科導(dǎo)管室iCPET中心行iCPET后確診。排除以下影響NCAM 1血漿濃度的疾?。汗谛牟。?］，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)病變［7］，其他惡性腫瘤疾病。對(duì)照組：2018年10月在我院體檢合格或行右心導(dǎo)管及iCPET檢查排除心血管內(nèi)科相關(guān)疾病，排除心、腦、肝、腎、內(nèi)分泌腺等重要臟器疾患，肝腎功能試驗(yàn)正常，家族中無(wú)心血管內(nèi)科相關(guān)疾病病史，與實(shí)驗(yàn)組和疾病對(duì)照組在性別、年齡、體重方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。擴(kuò)大樣本檢驗(yàn)中納入標(biāo)準(zhǔn)未變。

試劑與儀器試劑：ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，小樣品研磨試劑盒、IPG 13 cm（p H 3-10 NL）非線性膠帶、DIGE染料（Cy2TM，Cy3TM，Cy5TM）、EDTA抗凝管購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。無(wú)水乙醇、乙酸等常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器：電泳儀（SE-600全套電泳設(shè)備，瑞典Amersham公司），Ty-phoon掃描儀和De圖譜分析軟件（美國(guó)GE healthcare公司），光密度掃描儀（型號(hào)：GS-710，美國(guó)Bio-Rad公司）；質(zhì)譜平臺(tái)（型號(hào)：Thermo Q ExactiveTMHF-X）和色譜平臺(tái)（型號(hào)：Easy nanoLC 1200）（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Bioworks軟件（美國(guó)Ginkgo Bioworks公司）。

標(biāo)本采集對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照組及患者（行右心導(dǎo)管前），使用EDTA抗凝管采集靜脈血2 mL，上下顛倒混勻10次，于4℃、1 600×g離心10 min。用移液器將上層血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，添加蛋白酶抑制劑混勻，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

去除白蛋白的血漿樣品制備及處理血樣品解凍后，各取1 mL樣品，于4℃、12 000×g離心1 min，吸取中間層，除去上層油脂。稀釋后用0.22μm濾膜過(guò)濾，用高豐度蛋白分離柱（美國(guó)Agilent公司）處理去除高豐度蛋白質(zhì)。使用Bradford法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5標(biāo)記。將標(biāo)記樣品加入同一EP管中，震蕩混勻，點(diǎn)動(dòng)離心。同時(shí)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，加入等體積的2×樣品緩沖液，冰浴10 min。進(jìn)行IEF與SDS-PAGE。電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色方法染色。

掃描及凝膠圖像分析使用Typhoon掃描儀和eCyderTM v6.5軟件（美國(guó)GE Healthcare公司）進(jìn)行掃描，獲取圖像進(jìn)行分析。1張膠片經(jīng)過(guò)掃描后得到3張膠圖，對(duì)膠圖上每個(gè)蛋白點(diǎn)掃描進(jìn)行膠內(nèi)分析（differential in-gel analysis，BVA），匹配后再對(duì)各個(gè)蛋白點(diǎn)的相對(duì)量進(jìn)行比較（Cy3/Cy2或Cy5/Cy2）以確定差異蛋白質(zhì)，組間差異蛋白質(zhì)采用t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行定量比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

質(zhì)譜鑒定對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解、MALDI質(zhì)譜分析，并用BIOWORKS軟件搜索ipi HUMAN v3.53蛋白質(zhì)庫(kù)，鑒定差異蛋白質(zhì)。

ELISA檢測(cè)樣本擴(kuò)增后，運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)各組血漿中NCAM 1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，ELISA按試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）說(shuō)明書執(zhí)行。

結(jié) 果

各組患者臨床資料的比較該研究招募的患者及健康對(duì)照組的基線統(tǒng)計(jì)如表1所示。與EiPAH組比較，IPAH組靜息時(shí)常規(guī)右心導(dǎo)管測(cè)得值肺動(dòng)脈收縮壓［（45.63±9.01）mmHg］和血管阻力［（805±394）dyn·s·cm-5］均遠(yuǎn)高于EiPAH組（P<0.05）。IPAH組與EiPAH組相比，血尿酸、肌酐、總膽紅素水平更高，腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，eGFR）更低。兩組患者的血尿酸與靜息時(shí)mPAP、肺血管阻力呈正相關(guān)，而與心率、體循環(huán)血壓和肺毛細(xì)血管楔嵌壓無(wú)相關(guān)性（表2）。

蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜結(jié)果分析凝膠圖像發(fā)現(xiàn)，IPAH組與對(duì)照組共有119種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中66種表達(dá)上調(diào)，53種表達(dá)下調(diào)；EiPAH組與對(duì)照組相比，共有115種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中44種表達(dá)上調(diào)，71種表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照組相比，兩實(shí)驗(yàn)組NCAM 1均上調(diào)。IPAH組和EiPAH組的NCAM 1相對(duì)定量值分別為19 997.4±5 471.1和21 538.4±5 938.4，相比于對(duì)照組的4 991.4±1 046.4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P=0.003），兩組NCAM 1的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）分別為4.01和4.32。

ELISA驗(yàn)證血漿中NCAM 1蛋白質(zhì)水平采用ELISA法檢測(cè)各組血漿中NCAM 1蛋白質(zhì)水平。與對(duì)照組［（2 188.03±207.995）pg/mL］相比，IPAH組和EiPAH組血漿中NCAM1蛋白質(zhì)水平明顯增高，分別 為 （2 704.667±380.402）pg/mL（P=0.002）和（2 864.222±288.602）pg/mL（P=0.001）。檢測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，EiPAH組增高更明顯，EiPAH組與IPAH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。

受試者工作特征曲線從受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線數(shù)據(jù)可知（圖1），IPAH組與EiPAH組NCAM 1的AUCROC分別為0.93和0.98，表明該指標(biāo)能較好地預(yù)測(cè)疾病。然而，對(duì)NCAM 1與兩組患者的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，包括靜息時(shí)和運(yùn)動(dòng)高峰時(shí)的肺動(dòng)脈平均壓、肺血管阻力、肺毛細(xì)血管嵌頓壓、心排量等指標(biāo)，未獲得有意義的結(jié)論。

表1 IPAH組、EiPAH組和對(duì)照組的臨床資料比較Tab 1 Comparison of clinical characters between IPAN group，EiPAH group and control group （±s）

表1 IPAH組、EiPAH組和對(duì)照組的臨床資料比較Tab 1 Comparison of clinical characters between IPAN group，EiPAH group and control group （±s）

a IPAH group vs.Control group；b EiPAH group vs.Control group；c IPAH group vs.EiPAH group.FC：Fold change.

Clinical charactersIPAH groupEiPAH groupControl groupP aP bP c（n=8） （n=6） （n=9）Age（y）36±644±1229±80.3870.0200.066 Female（%）5050600.8320.8470.988 BMI（kg/m2）23±223±121±20.1240.0510.522 WHO FCⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ0/1/5/20/4/2/0---- Transverse diameter of right atrium（mm）44±934±4---0.012 Right ventricular end-diastolic diameter（mm）29±1020±2---0.002 NT-proBNP（pg/mL）731±83132±19---<0.001 Bilirubin（μmol/L）20±179±3---0.112 Creatinine（μmol/L）76±2867±12---0.441 Uric acid（μmol/L）447±138295±72---0.003 eGFR（mL·min-1·1.73m-2）98±24111±15---0.364 Mean pulmonary artery pressure（mmHg）46±917±4---<0.001 Mean pulmonary pressure during exercise（mmHg）-33±1---- Pulmonary vascular resistance（dyn·s·cm-5）805±394104±15---<0.001 Pulmonary vascular resistance during exercise（dyn·s·cm-5）-243±44----

表2 IPAH組和EiPAH組的血尿酸水平與平均肺動(dòng)脈壓，肺血管阻力的相關(guān)性Tab 2 Correlation between blood uric acid levels and mean pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular resistance in IPAH group and EiPAH group

討 論

我們與美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院附屬Brigham and Women’s Hospital肺血管中心主任Aaron B.Waxman教授合作，于2017年5月在中國(guó)開(kāi)展第1例iCPET診斷EiPAH［8］，同時(shí)建立了EiPAH的生物樣本數(shù)據(jù)庫(kù)和隨訪隊(duì)列，并在全國(guó)推廣這項(xiàng)新技術(shù)，協(xié)助廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院于2018年4月開(kāi)展此項(xiàng)新技術(shù)。2017年，我們報(bào)道了iCPET診斷EiPAH、早期舒張性心力衰竭等疑難呼吸困難的價(jià)值［9］。2018年，我們?cè)趪?guó)際上首次報(bào)道舒張性心力衰竭合并早期肺動(dòng)脈功能障礙的患者再住院率明顯增加［10］。然而，iCPET為侵入性檢查，操作復(fù)雜，系統(tǒng)配置較昂貴，檢查費(fèi)用高，尚不能在全國(guó)范圍廣泛開(kāi)展。因此，研究早期診斷PAH的血漿生物標(biāo)志物是目前臨床急需解決的問(wèn)題。

圖1 IPAH及EiPAH患者血漿中NCAM 1蛋白的ROC曲線Fig 1 ROC curves for NCAM 1 in the plasma of patientswith IPAH and EiPAH

本研究結(jié)果表明，NCAM 1血漿蛋白質(zhì)表達(dá)水平在IPAH和EiPAH患者中明顯升高。NCAM 1是免疫球蛋白超家族分子，也是細(xì)胞黏附分子的一員，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能，在神經(jīng)細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用。人NCAM 1基因定位于11q22～23，是一種膜蛋白，既往關(guān)于該蛋白的研究均基于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。近年來(lái)的更多研究表明，該蛋白可能是重要的信號(hào)受體，參與影響細(xì)胞黏附、遷移、增殖、凋亡、分化，并進(jìn)一步影響細(xì)胞存活及其他功能。該分子在缺血性心肌病的心肌細(xì)胞、急性心肌梗死的心肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的血漿中都報(bào)道過(guò)不同程度的升高，但機(jī)制尚不明確［6］。目前，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道NCAM 1與肺血管相關(guān)疾病有相關(guān)性。同時(shí)，本研究結(jié)果表明IPAH患者血尿酸、肌酐、膽紅素水平增高，且血尿酸水平與mPAP、肺血管阻力呈正相關(guān)，此結(jié)果與van Albada等［11］報(bào)道相似。該結(jié)果可能與IPAH患者的心輸出量下降、通氣血流比例失調(diào)、機(jī)體組織缺血缺氧、腎血流灌注下降所導(dǎo)致的尿酸產(chǎn)量增多而排泄減少有關(guān)。由于尿酸檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉且非侵入性，可反復(fù)測(cè)量，本研究提示尿酸可能成為臨床上反映IPAH疾病嚴(yán)重程度的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

IPAH及EiPAH與PAH相關(guān)性的具體機(jī)制尚不明確，但平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡抵抗導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)被認(rèn)為是IPAH的重要病理生理過(guò)程。已有研究表明，Wnt3a/β-catenin/survivin信號(hào)通路可能參與PAH發(fā)生發(fā)展，而該通路已被證實(shí)參與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗、過(guò)度增殖的調(diào)控［12］。故有學(xué)者提出，IPAH與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制或有共同點(diǎn)。近年來(lái)，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的含量異常升高。研究表明，NCAM 1可使乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡減少，并促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，該作用機(jī)制可能激活了β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附減弱，因此更具侵襲性［13］。Gavert等［14］通過(guò)研究神經(jīng)細(xì)胞黏附分子與大腸癌的關(guān)系認(rèn)為，該蛋白可以活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，該信號(hào)通路與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，NF-κB激活又進(jìn)一步加強(qiáng)NCAM 1對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移作用［15］。本研究首次發(fā)現(xiàn)EiPAH患者血漿中NCAM 1較正常對(duì)照組明顯升高，其在IPAH患者血漿中也有明顯升高，但升高程度不及EiPAH患者。

由于EiPAH在國(guó)內(nèi)為新技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)開(kāi)展例數(shù)較少。該研究針對(duì)的疾病IPAH、EiPAH皆為罕見(jiàn)病，在擴(kuò)大驗(yàn)證的情況下，本研究的樣本量依然有限。對(duì)照組的受試者明顯年輕，可能對(duì)研究結(jié)果有一定影響，但對(duì)已有的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析可知，NCAM 1與年齡的相關(guān)性不顯著（r=0.291，P=0.179）。本課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證NCAM 1與IPAH及EiPAH相關(guān)性的機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明何楊柯 數(shù)據(jù)采集，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。易鑫 數(shù)據(jù)采集，論文修訂。李卓霖 論文構(gòu)思、撰寫和修訂。黃瑋 數(shù)據(jù)分析，論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。