五糧液原酒中特殊芳香族化合物的空間分布

楊康卓，劉 芳，何張?zhí)m，張建敏，喬宗偉，彭志云，鄭 佳，趙 東

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007）

芳香族化合物是一類具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，白酒中常見的芳香族化合物有苯酚、對(duì)甲酚、苯乙醇、苯甲醇、苯乙醛、苯甲醛、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等等，對(duì)白酒酒體貢獻(xiàn)馬廄味、煙熏味、丁香味、花香味等等，是白酒中主要呈香物質(zhì)的同時(shí)也是異嗅類物質(zhì)。因而研究芳香族化合物在白酒中的量比關(guān)系對(duì)提高白酒質(zhì)量無疑具有重要的意義。

芳香族化合物廣泛存在于濃香型白酒釀造過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)。在不同酒精度的五糧液中，通過氣相色譜嗅聞（GC-O）技術(shù)檢測(cè)到了11種芳香族化合物，其中苯乙酸乙酯等化合物被認(rèn)為是造成高度和低度五糧液風(fēng)味特征區(qū)別的原因[1]；包包曲中共有22種芳香族化合物被檢測(cè)到[2]，其中苯乙醇、愈創(chuàng)木酚被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)濃香型大曲的主要香味成分，而苯甲醛、苯甲醇為優(yōu)質(zhì)濃香型大曲香味體系的組成部分[3]；在窖泥與糟醅中也檢出了12種芳香族化合物，其中對(duì)甲酚可能是由窖泥產(chǎn)出的形成區(qū)別于糟醅香氣特征的原因之一[4]。由此可見，芳香族化合物是濃香型白酒中一種很重要的呈香物質(zhì)，掌握它們?cè)谠浦械木唧w含量是很有必要的。

五糧液是多糧濃香型白酒的典型代表，其具有“香氣悠久、味醇厚、入口甘綿、入喉凈爽、諸味協(xié)調(diào)、恰至好處、尤以味全面而著稱”的獨(dú)特酒體風(fēng)格。這種風(fēng)格與五糧液特有的“分層起糟、分層蒸餾，按質(zhì)并壇”工藝有著必然聯(lián)系。其中“分層起糟、分層蒸餾”的原因是不同空間層次的糟醅所接觸的條件不同，形成了質(zhì)量差異，其蒸出的酒也是品質(zhì)各異。據(jù)研究表明，濃香型白酒中不同空間層次的原酒從感官和呈香物質(zhì)的含量上均有明顯差異[5]。而“按質(zhì)并壇”就是為了將這些不同層次、品質(zhì)各異的原酒區(qū)別開來，按質(zhì)組合，為后期的勾調(diào)工藝打好基礎(chǔ)[6-7]。因此，掌握不同層次原酒中風(fēng)味物質(zhì)的準(zhǔn)確信息對(duì)“按質(zhì)并壇”具有非常重要的指導(dǎo)意義。

目前國(guó)內(nèi)的濃香型原酒研究中，少有對(duì)芳香族化合物進(jìn)行定量的報(bào)道，而且對(duì)它們?cè)诓煌瑢哟卧浦械目臻g分布規(guī)律了解得也不夠全面。因此，本研究對(duì)9種生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的具有特殊香氣貢獻(xiàn)的芳香族化合物進(jìn)行了定量研究，分析了它們的空間分布規(guī)律，為濃香型原酒的層次判定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為“按質(zhì)并壇”工藝提供了新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)原酒均采集自五糧液股份有限公司釀酒車間隨機(jī)選取11口窖池；所選窖池均為40年以上窖齡。

空間層次分布：空間層次分為上層、中層和下層；其中上層為距地面10～20 cm處，中層為黃水線上20～30 cm處，下層為黃水線下30 cm處。

原酒采集方法：不同空間層次的原酒均采集于對(duì)應(yīng)空間層次的糟醅。糟醅經(jīng)蒸餾后去掉酒頭，摘取的一級(jí)酒為實(shí)驗(yàn)分析原酒。

所有實(shí)驗(yàn)原酒酒精度均在65%vol～70%vol。

1.2 儀器與藥品

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（帶有自動(dòng)前處理平臺(tái)的GC/MS）PAL RTC2-7890B/5977B，美國(guó)Agilent公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；渦旋儀Vortex-Genie 2，美國(guó)Scientific Industries公司。

無水乙醇（色譜純），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（CH2Cl2，ACS級(jí)），上海百靈威有限公司。無水硫酸鈉、氯化鈉（ACS級(jí)），阿拉丁試劑有限公司；4-辛醇，GC標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、苯酚、對(duì)甲酚等，GC標(biāo)準(zhǔn)品，日本TCI公司。

1.3 液液微萃?。↙LME）

將10 mL酒樣和20 mL飽和食鹽水加入50 mL離心管中,再加入內(nèi)標(biāo)物50 μL(4-辛醇，100 mg/L)，用1 mL重蒸的二氯甲烷進(jìn)行萃取，振蕩混勻1 min，經(jīng)3000 r/min離心3 min后分層，取1 μL下層的萃取劑進(jìn)入GC-MS進(jìn)行分析。

1.4 GC-MS分析

氣相色譜條件：載氣為He(99.999 %)，流速1 mL/min；色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；不分流進(jìn)樣；柱箱升溫程序?yàn)?0 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍35.00～350.00 amu。

1.5 定性

通過與NIST14a.L(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)比并與標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖、保留時(shí)間及文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)比對(duì)定性指定的所有芳香族化合物。

1.6 定量

采用內(nèi)標(biāo)法(以4-辛醇為內(nèi)標(biāo))繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)芳香族化合物進(jìn)行定量分析。具體操作步驟是用60%vol乙醇水溶液將需定量的芳香族化合物標(biāo)準(zhǔn)品配制為高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋配制成不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取10 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述液液微萃取的方法萃取后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，用特征離子(SIM)對(duì)待測(cè)化合物進(jìn)行積分，以需定量的芳香族化合物的標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的特征離子峰的峰面積之比為橫坐標(biāo)，檢出的芳香族化合物的標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢出限（LOD）：以信噪比為3時(shí)，所檢測(cè)出的物質(zhì)濃度作為該物質(zhì)的檢出限。

定量限（LOQ)：以信噪比為10時(shí)，所檢測(cè)出的物質(zhì)濃度作為該物質(zhì)的定量限。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測(cè)定的數(shù)據(jù)來計(jì)算RSD。

回收率：在已知目標(biāo)化合物的濃度酒樣中，添加一定量的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定3次，通過以下公式（加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)÷加標(biāo)量×100%）計(jì)算回收率。

重現(xiàn)性：以同一天連續(xù)測(cè)定15次的化合物保留時(shí)間的RSD作為日內(nèi)重現(xiàn)性；以連續(xù)5 d相同時(shí)間段測(cè)定的化合物保留時(shí)間的RSD作為日間重現(xiàn)性。

1.7 香氣活度值（OAV）

香氣活度值是指測(cè)定的化合物濃度與該化合物的香氣閾值濃度之比，以此來表示該化合物對(duì)香氣的貢獻(xiàn)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 芳香族化合物定量方法的評(píng)估

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)

本研究中芳香族化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9971（苯乙酸乙酯），線性良好；所測(cè)酒樣中芳香族化合物的含量均在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)；方法的檢測(cè)限為0.23～3.67 μg/L，定量限為0.77～12.23 μg/L，均較低（表1）。

表1 芳香類物質(zhì)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

2.1.2 精密度、回收率及重現(xiàn)性

采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為定量方法的精密度（表2），經(jīng)測(cè)定9種芳香族化合物的RSD均小于2 %，加標(biāo)回收率在102.18 %～122.41 %。而各化合物的日間重現(xiàn)性與日內(nèi)重現(xiàn)性均小于1%。綜上所述，該方法能滿足五糧液原酒中9種芳香族化合物的定量分析需求。

表2 芳香族化合物定量的精密度、回收率和重現(xiàn)性

2.2 原酒中9種芳香族化合物含量空間分布和OAV分析（圖1、表3）

圖1 原酒中9種芳香族化合物的含量空間分布

表3 9種芳香族化合物在原酒中的OVA值

由圖1可知，原酒中9種芳香族化合物的濃度各不相同，它們的高低順序分別為苯乙酸乙酯＞苯甲醛＞苯乙醛＞苯乙醇＞對(duì)甲酚＞苯丙酸乙酯＞苯甲醇＞愈創(chuàng)木酚。

通過計(jì)算各物質(zhì)的OAV值，發(fā)現(xiàn)苯乙酸乙酯、對(duì)甲酚、苯甲醛、苯丙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚等5種化合物在五糧液原酒中OAV值均大于1，說明它們對(duì)原酒的香氣具有貢獻(xiàn)。苯酚、苯乙醇、苯甲醇等3種化合物的OAV值均小于1，說明這3種物質(zhì)對(duì)原酒香氣的貢獻(xiàn)度可能很低。然而在以往研究中，苯酚被認(rèn)為是五糧液酒中一個(gè)重要的風(fēng)味物質(zhì)[6-7]。因此，它對(duì)香氣的貢獻(xiàn)還需進(jìn)一步深入研究。

2.3 9種芳香族化合物的空間分布規(guī)律（圖2）

由圖2可知，9種芳香族化合物中愈創(chuàng)木酚、苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇等4種化合物在不同空間層次的原酒中未有明顯差異。通過將其余5種化合物進(jìn)行不同層次間的差異化分析，我們發(fā)現(xiàn)：對(duì)甲酚，學(xué)名為4-甲基苯酚，被認(rèn)為與窖泥臭有十分密切的關(guān)系[11]。從空間分布規(guī)律來看，其表現(xiàn)為下層＞中層＞上層，含量隨著窖池空間深度的增加而增加。這是因?yàn)?-甲基苯酚主要是窖泥中的厭氧微生物產(chǎn)生，下層空間中隨著深度的增加厭氧環(huán)境變好，窖泥中對(duì)甲酚的含量便隨之增加[12]；由于窖泥與糟醅香氣物質(zhì)的交換效果，對(duì)甲酚不同層次間糟醅含量也存在了明顯差異[12]；在五糧液“分層起糟、分層蒸餾”的特有工藝前提下，形成了不同空間層次的五糧液原酒中對(duì)甲酚的分布規(guī)律。

圖2 不同空間層次原酒種4種芳香族化合物的差異化分析

苯乙酸乙酯、苯酚的含量在下層原酒中明顯高于中層和上層，但在中層和上層間區(qū)別并不明顯。而苯乙醛正好相反，其含量在上層原酒中明顯高于中層和下層，在中層和下層間區(qū)別不明顯。

3 結(jié)論

本研究基通過LLME-GC/MS的方法進(jìn)行了定量分析。該方法具有線性好，檢出限低，精度高，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，完全能滿足五糧液原酒中9種芳香族化合物的定量需求。通過定量，五糧液原酒中芳香族化合物的排列規(guī)律為苯乙酸乙酯＞苯甲醛＞苯乙醛＞苯乙醇＞對(duì)甲酚＞苯丙酸乙酯＞愈創(chuàng)木酚＞苯甲醇。其中苯乙酸乙酯、對(duì)甲酚、苯甲醛、苯丙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚是較為重要的呈香物質(zhì)，對(duì)甲酚隨窖池深度增加而升高的現(xiàn)象明顯。因此，可把對(duì)甲酚作為一種除傳統(tǒng)醇酯指標(biāo)外，判定五糧液原酒層次的一種潛在的特征指標(biāo)。