不同時長的過氧化氫刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老的影響

林樸卿 阮云軍

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院老年病科（廣州510515）

血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）是映襯于血管壁的單層細胞，由于增齡或外界刺激誘導(dǎo)VEC 衰老是血管老化重要的始動因素［1］，在動脈粥樣硬化［2］、肺動脈高壓［3］、腦卒中［4］等血管老化相關(guān)疾病發(fā)病過程扮演著關(guān)鍵角色。因此，研究VEC衰老機制，尋找衰老過程的關(guān)鍵靶點是防治血管老化相關(guān)性疾病有效手段［5］。由于增齡導(dǎo)致自然衰老細胞模型具有周期長、代價大等缺陷，因而較少用于科學(xué)研究，取而代之的是誘導(dǎo)性細胞衰老。在饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激等眾多誘導(dǎo)性衰老手段中，過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是最為常用的細胞衰老誘導(dǎo)手段［6］，具有易于獲得、性質(zhì)穩(wěn)定、周期短等優(yōu)勢，同時也伴有不易控制、凋亡過多等缺點［7］。本研究將運用H2O2制造人臍靜脈內(nèi)皮細胞（humen umbilical vein endothelial cell，HUVEC）衰老模型，并通過檢測不同時間點HUVEC 功能、衰老和凋亡的指標，探討H2O2誘導(dǎo)HUVEC 衰老的最適作用時間，為細胞衰老的科學(xué)研究提供可靠的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料HUVEC 細胞株由南方醫(yī)科大學(xué)中心試驗室贈送；DMEM 無酚紅培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清購自美國Gbico 公司；細胞用過氧化氫購自上海麥克林公司；MTT 購于美國Sigma?Al?drich 公司；細胞衰老SA?β半糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天公司；細胞內(nèi)皮素（ET?1）、NO 檢測ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物公司；MDA、SOD、GSH?px 檢測試劑盒購自南京建成生物公司；Bax、Bcl?2、p21、β?actin 兔抗人單克隆一抗，辣根過氧化物酶標記二抗均購自美國CST 公司。

1.2 實驗分組與處理HUVEC 復(fù)蘇后置于37 ℃二氧化碳含量為5%孵育箱用含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)，隔日換液，待細胞融合率達80%進行傳代，取3 ～5 代細胞進行實驗；按H2O2刺激時間（0.5、1、3、6、12、24、48 和96 h）把HUVEC 分為9 組，分別是空白對照組、0.5 h 組、1 h 組、3 h 組、6 h 組、12 h組、24 h 組、48 h 組和96 h 組。

1.3 MTT 檢測細胞增值活性HUVEC 消化離心后計數(shù)，調(diào)整細胞密度為10×104個/mL，吸100 μL細胞懸液種于96 孔板，細胞分組及處理已如上述，每組設(shè)5 個復(fù)孔，處理后棄去舊培養(yǎng)基，予以100 μL 不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基加10 μL MTT，避光37 ℃孵育4 h 后加入150 μL DMSO，酶標儀570 nm 測OD值，棄去最大、最小值分析統(tǒng)計。

1.4 ELISA 檢測ET?1、NO 水平按照試劑盒說明書完成制備標準品，繪制標準曲線，然后上樣，洗板、加入工作液，再洗板最后到酶標儀檢測OD值，具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.5 MDA、SOD 和GSH?px 測定HUVEC 以適當?shù)拿芏冉臃N于六孔板中，孵育過夜；然后按照上述分組進行相應(yīng)處理；收集細胞，按照試劑盒說明書要求完成MDA、SOD、GSH?px 的檢測。

1.6 Western blotHUVEC 細胞分組處理如上述，加入RIPA 冰上裂解0.5 h 提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。按照要檢測蛋白的分子大小在組裝好的電泳玻璃板中加入適量的10%過硫酸銨、四甲基二乙胺（TEMED）、30%丙烯酰胺（30%Acr?Bis）、蒸餾水等配制成適當濃度的堆積膠與分離膠，插入梳子，每孔加入20 μL 總蛋，完成后續(xù)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別以Bax、Bcl?2、p21 和β?actin 一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，37 ℃孵育二抗1 h，TBST 洗膜三次，ECL 顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示。多組之間的比較分析采用單因素方差分析法；組間多重比較采用最小顯著差異法（LSD）；兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗；率之間的比較采用卡方分析；P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 MTT 檢測細胞活力Fig.1 MTT assay detected cell viability

2.1 MTT 檢測細胞活力與空白組相比，H2O2刺激0.5 h到3 h內(nèi)，細胞活力逐漸增強，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；6 h 細胞增殖活性明顯下降（P＜0.05），往后隨著H2O2刺激時間的延長，細胞活力逐漸下降，96 h 達到最低點。見圖1。

2.2 SA?β糖苷酶染色檢測細胞衰老在H2O2刺激0.5 h 到3 h 內(nèi)，HUVEC 未見明顯衰老著色；但隨著H2O2刺激時間的延長（3 ～24 h），HUVEC 衰老染色陽性細胞明顯增加（P＜0.05），24 h 到達高峰，然后一直維持到96 h。見圖2。

2.3 ELISA 檢測細胞因子變化與空白組相比，在短時間內(nèi)（0.5 ～3 h）H2O2刺激使HUVEC 分泌ET?1 和NO 增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著刺激時間的延長（3 h 以后），HUVEC 分泌ET?1 增多，24 h 到達最高值，然后一直減少；3 h后NO 逐漸減少（P＜0.05），96 h 達到最小值。見圖3。

圖2 SA?β糖苷酶染色檢測細胞衰老Fig2 SA?β staining detected cell senescence

圖3 ELISA 檢測細胞因子變化Fig.3 Endothelial cells′function were detected by ELISA

圖4 各組細胞氧化應(yīng)激水平的變化Fig.4 Oxidative stress in different groups

2.4 各組細胞氧化應(yīng)激水平的變化與空白組相比，H2O2刺激各組細胞氧化應(yīng)激水平明顯升高，表現(xiàn)在MDA 增加，SOD、GSH?px 顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組細胞凋亡和衰老蛋白表達變化研究結(jié)果提示，在H2O2刺激24 h 內(nèi)，各組細胞凋亡蛋白Bax 和Bcl?2 表達無差異；24 h 后，隨著H2O2刺激時間的延長，Bax 表達逐漸增多（P＜0.05），Bcl?2 表達逐漸減少（P＜0.05）。衰老蛋白p21 在H2O2刺激3 h 內(nèi)表達無差異，6 ～12 h 隨著刺激時間的延長，p21 表達逐漸增多，24 h 最高（P＜0.05），48 h 后表達減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞凋亡和衰老蛋白表達變化Fig.5 Expressions of apoptosis and senescence proteins in different groups

3 討論

正如被譽為“英國的希波克拉底”醫(yī)生THOMAS SYDENHAM 所說：“A man is as old as his arteries”，與個體衰老伴隨而來的是血管老化［8］。VEC 衰老是血管整體老化必不可少的改變，也是眾多血管老化相關(guān)疾病，如動脈粥樣硬化、腦卒中、冠心病等疾病的重要始動因素［9-11］。因此，有學(xué)者認為，心腦血管疾病發(fā)病率隨著年齡逐漸增加的一個重要原因就是由于VEC 衰老降低了這些疾病的發(fā)病閾值［12］。

外源性H2O2是強氧化應(yīng)激因子，可通過損傷DNA、使端粒區(qū)域單鏈斷裂等機制在較短時間內(nèi)誘導(dǎo)細胞早衰［13］，使細胞高表達復(fù)制性衰老相關(guān)的標志物，因此H2O2是優(yōu)秀的細胞衰老造模工具。但由于H2O2化學(xué)性質(zhì)活潑、不穩(wěn)定，因此關(guān)于H2O2造細胞衰老模型的濃度和時間不同實驗室之間均存在較大的差異［14-15］。

本實驗室長期致力于VEC 衰老研究，經(jīng)過反復(fù)驗證，項目成員發(fā)現(xiàn)200 μmol/L 的H2O2可制造出較為穩(wěn)定的HUVEC 衰老模型［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2作用的0 ～3 h 內(nèi)，細胞活力反而增強，這是因為在強氧化應(yīng)激作用下，細胞在短時間內(nèi)通過調(diào)動細胞應(yīng)激反應(yīng)以“度過難關(guān)”［17］，因此此時間段內(nèi)細胞因子（NO、ET?1）分泌稍微增加，但衰老并不明顯。但隨著H2O2刺激時間的延長（6 ～24 h），細胞氧化應(yīng)激水平持續(xù)升高并超過細胞應(yīng)激調(diào)整能力，細胞活力開始下降，NO 分泌減少，ET?1 分泌增加，p21 表達增加，SA?β陽性率升高，并且以24 h最明顯，即H2O2作用24 h 可作為衰老造模的可靠時間點。一旦超過24 h（48 ～96 h）細胞SA?β糖苷酶染色和p21 表達無明顯變化，持續(xù)升高的氧化應(yīng)激水平伴有凋亡蛋白表達明顯增高，細胞因子分泌減少，這就提示，過長時間的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細胞凋亡增多，細胞衰老反而沒那么明顯。

強烈的氧化應(yīng)激既可以引起細胞衰老，又可以導(dǎo)致細胞凋亡［18］，因此H2O2誘導(dǎo)細胞衰老的一大難點是如何確定一個合適的濃度和合適的作用時長以保證衰老相關(guān)指標表達明顯增高又能保證細胞凋亡不明顯［19］。由于細胞種系的不同，文獻報道的H2O2誘導(dǎo)細胞衰老模型的濃度和處理時間亦不一致，濃度低者可至5 μmol/L［20］，高者可達1 000 μmol/L［21］；作用時間也從4 h［22］到5 d［21］不等。本實驗室長期致力血管老化的研究，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)［22-24］并參考國內(nèi)外研究報道［25-26］，認為H2O2誘導(dǎo)細胞衰老的濃度可因細胞種系和實驗條件的不同而調(diào)整，但作用時間不宜過長，一方面因為刺激時間過長可直接破壞線粒體質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞色素C 釋放至細胞質(zhì)，激活caspase 家族，誘導(dǎo)細胞凋亡［27-28］；另一方面，刺激時間過長可導(dǎo)致培養(yǎng)液血清耗盡，從而不能界定是氧化應(yīng)激還是營養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)的細胞衰老［29-30］。綜合以上研究結(jié)果，筆者認為200 μmol/L 的H2O2作用24 h 可成功誘導(dǎo)出HUVEC 衰老模型，可作為其他科學(xué)研究的參考。

本研究使用最為常用的H2O2作為工具藥物，通過連續(xù)觀察9 個不同時間點HUVEC 的功能、衰老和凋亡指標，證實了200 μmol/L 的H2O2作用24 h可成功誘導(dǎo)出HUVEC 衰老模型，為血管衰老的研究提供了細胞模型，并可作為實驗參考推廣至其他種系細胞的研究。但是，由于本研究監(jiān)測的時間點有限，觀察指標尚不完整，因此仍需要進一步的研究去完善H2O2造HUVEC 衰老模型的其他細節(jié)問題。