miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化中的表達(dá)及靶基因的生物信息學(xué)分析

孫彥杰,李耀強(qiáng),齊 冉,吳 瓊

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院， 河北 石家莊 050000；2. 平鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，河北 平鄉(xiāng) 054500)

目前，臨床上非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病率較高，肝纖維化是慢性肝炎進(jìn)展為肝硬化的重要病理過程，其發(fā)病機(jī)制及分子靶標(biāo)的探明可為該病的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。近年研究發(fā)現(xiàn)microRNAs(miRNAs)參與細(xì)胞分化、凋亡及增殖等多種生物學(xué)過程[1-3]。miR-150-5p是位于6號染色體上的非蛋白編碼區(qū)域加工產(chǎn)生的小分子RNA，既往對miR-150的研究主要集中在癌癥領(lǐng)域，近年研究表明miR-150可抑制肝星狀細(xì)胞的激活[4]，降低CollagenⅠ及α-SMA的表達(dá)[5]，阻止肝纖維化的進(jìn)展，但其在非酒精性脂肪性肝病中的作用不明。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選獲得在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型肝組織中差異表達(dá)的miR-150-5p，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-150-5p靶基因，對其靶基因進(jìn)行功能及信號通路富集分析，旨在為深入研究miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠20只，體重20～25 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號：(11401300055019)。飼養(yǎng)于醫(yī)院動(dòng)物中心，溫度控制在(23±1)℃，自由飲食，晝夜各12 h。本實(shí)驗(yàn)所有操作程序經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)將小鼠分為2組，模型組10只以膽堿-蛋氨酸缺乏飼料喂養(yǎng)建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，正常組10只以膽堿-蛋氨酸充足的飼料喂養(yǎng)，2組均喂養(yǎng)8周后水合氯醛麻醉處死小鼠，留取肝組織標(biāo)本。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1肝組織中miR-150-5p表達(dá)檢測 提取2組小鼠肝組織中RNA，紫外分光光度儀測定A260/280，確定RNA純度。采用microRNA(miRNA)芯片技術(shù)檢測miR-150-5p表達(dá)情況。miRNA芯片微陣列實(shí)驗(yàn)由LC Sciences公司進(jìn)行，用4～8 μg總RNA樣品，使用Poly(A)聚合酶在中RNA 3'端加上poly(A)尾巴，再將一個(gè)寡聚核苷酸標(biāo)記于這個(gè)poly(A)尾巴連接用于后續(xù)的熒光標(biāo)記，在μParaflo微流體芯片上進(jìn)行34℃過夜雜交，RNA與探針雜交后，與標(biāo)記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上染色。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)分析使用LOWESS過濾(Locally-Weighted Regression)進(jìn)行信號歸一化。將差異表達(dá)譜中l(wèi)og2模型/對照>2.0或<0.5作為篩選條件，篩選出miR-150作為本次研究對象。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性10 s，60 ℃退火，72 ℃延伸，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct表示miRNA的表達(dá)水平，每個(gè)樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.2miR-150-5p序列保守性分析及靶基因預(yù)測 選擇miRBase(http://www.mirbase.org/)、UCSC(http:// genome.ucsc.edu/)和Ensembl(http://www.ensembl.org/)基因組在線瀏覽工具獲取miR-150-5p堿基序列、染色體定位、物種保守性等基本信息；選擇TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、miRanda(http://www.microrna.org/)靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-150-5p靶基因，取三者預(yù)測數(shù)據(jù)的交集形成靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.3.3miR-150靶基因的功能富集分析 采用Gene Ontology(GO)(http://www.geneontology.org/)分析對靶基因集合進(jìn)行GO注釋描述，采用BiNGO對靶基因的分子功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)進(jìn)行GO注釋層次分類及富集分析，并進(jìn)行顯著性分析[4]。

1.3.4miR-150靶基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析 在GO注釋分類的基礎(chǔ)上，采用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)公共數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，通過Fisher Exact Test計(jì)算P值，P<0.05表示靶基因集合有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及疾病通路。

2 結(jié) 果

2.1小鼠肝組織中miR-150-5p表達(dá)情況miRNA芯片檢測顯示模型組小鼠肝組織中miR-150-5p表達(dá)較正常組明顯上調(diào)，log2模型/對照為1.32，P=0.0218；實(shí)時(shí)定量PCR檢測，模型組小鼠肝組織中miR-150-5p表達(dá)水平為(1.83±0.31)，正常組為(1.03±0.22)，模型組明顯高于正常組(P<0.05)。

2.2miR-150-5p序列保守性分析 人miR-150-5p位于6號染色體135545397-135545425位置之間。應(yīng)用miRBase對人、小鼠、果蠅等物種的miR-150-5p序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p中“UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG”22個(gè)堿基在物種間高度保守。見表1。

2.3miR-150-5p靶基因預(yù)測情況 應(yīng)用miRanda、TargetScan及PicTar預(yù)測miR-150-5p靶基因數(shù)量分別為275個(gè)、209個(gè)、9 583個(gè)。對3種預(yù)測方法的結(jié)果取交集，共獲得132個(gè)靶基因。DIANA LAB-Tarbase 6.0 數(shù)據(jù)庫收錄已有試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的miR-150-5p靶基因共7個(gè)，分別為Myb、Vegfa、EGR2、P2RX7、VEGF、AGA等。

2.4miR-150-5p靶基因GO分析情況 針對以上132個(gè)靶基因，進(jìn)行GO注釋描述、富集分級及層次網(wǎng)絡(luò)的圖形化顯示。結(jié)果從分子功能看，miR-150-5p的靶基因主要調(diào)節(jié)ATP結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合以及蛋白酶的活性等(P均<0.05)。從生物學(xué)過程看，miR-150-5p主要參與磷脂代謝、蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化和去磷酸化、血管再生與重建及促凋亡等。見表2及表3。

表3 miR-150-5p預(yù)測靶基因GO生物學(xué)過程分類

表2 miR-150-5p預(yù)測靶基因GO分子功能分類

2.5miR-150-5p靶基因信號通路富集分析情況 miR-150-5p靶基因結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集于胰島素信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路(P均<0.05)，另外還涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期過程等信號通路(P均<0.05)。見表4。

表4 miR-150-5p預(yù)測靶基因KEGG信號通路富集分析

3 討 論

miRNA是生物體內(nèi)一類長度為22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，通過與其靶基因mRNA 3'UTR區(qū)結(jié)合，降解或抑制靶基因mRNA的翻譯過程，因此尋找miRNA的靶基因是探明其參與及調(diào)控疾病發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制的關(guān)鍵步驟。每種miRNA可以調(diào)控?cái)?shù)百種靶基因的mRNA，而且一種靶基因的mRNA也可能受到多種靶基因的共同調(diào)控[2]，所以通過生物信息學(xué)準(zhǔn)確預(yù)測miRNA靶基因，明確miRNA與靶基因的作用方式，對miRNA的深入研究具有重要意義。miR-150在缺氧誘導(dǎo)的新生兒肝臟再生[6]，在白色脂肪組織[7]、系統(tǒng)性硬化癥纖維母細(xì)胞[8]中表達(dá)下調(diào)，提示miR-150在肝組織再生、肥胖及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的纖維化形成等過程中發(fā)揮重要作用，可以作為潛在的生物標(biāo)記物及治療的作用靶點(diǎn)。

miRanda、TargetScan和PicTar是目前miRNA靶基因的主要預(yù)測軟件[9]，各自有不同的計(jì)算方法。miRanda數(shù)據(jù)庫是最早利用生物信息學(xué)方法對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測的軟件，其預(yù)測陽性率達(dá)24%～39%，預(yù)測的靶基因數(shù)目較多，但假陽性率也較高[10]；TargetScan是一種預(yù)測哺乳動(dòng)物miRNA靶基因的軟件，與miRanda不同，TargetScan引入了“miRNA種子區(qū)”的概念，預(yù)測的靶基因減少，但準(zhǔn)確性得到了相應(yīng)的提高，降低了假陽性率[11]；PicTar同樣強(qiáng)調(diào)“種子區(qū)”在靶位點(diǎn)識別的關(guān)鍵作用，不同的是PicTar把種子序列分為“完全匹配種子序列”和“不完全匹配種子序列”，進(jìn)一步提高準(zhǔn)確度，降低假陽性率[12]。本研究采用上述3種預(yù)測軟件進(jìn)行miR-150-5p靶基因的預(yù)測，選取預(yù)測結(jié)果的交集，以提高預(yù)測結(jié)果的可靠性，降低假陽性率。

本研究應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)miRNA，采用生物信息學(xué)方法對miR-150-5p進(jìn)行靶基因保守分析及預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p序列在多種物種中高度保守，表明其可能具有較強(qiáng)的生物學(xué)功能。對預(yù)測所得的靶基因集合進(jìn)行功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p靶基因功能主要富集于磷脂代謝、蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化和去磷酸化、血管再生與重建及促凋亡等生物過程，信號通路主要富集于胰島素信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路、糖代謝信號通路及凋亡信號通路等。胰島素信號通路與非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)都參與了肝星狀細(xì)胞的增殖與活化，miR-150-5p通過調(diào)控這些信號通路中的關(guān)鍵基因及其下游的炎癥及纖維化相關(guān)基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程[14-16]。TGF-β信號通路是肝纖維化形成過程中最重要的信號通路，TGF-β1是目前公認(rèn)最強(qiáng)的致肝纖維化形成因子，也是最強(qiáng)的促膠原形成因子[17]，其在非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18]。這些預(yù)測的靶基因參與的信號通路及生物學(xué)過程均涉及脂質(zhì)代謝與肝纖維化等方面，提示miR-150-5p的作用可能與非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。

總之，miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化形成過程中發(fā)揮著一定作用，為后續(xù)研究miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纖維化中的調(diào)控機(jī)制提供了一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。