微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)在固體粉末樣品檢測中的應(yīng)用

廖燮恒，趙海鋒

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.高露潔棕欖（中國）有限公司，廣東廣州 510620）

微生物檢測，是食品，藥品，化妝品等領(lǐng)域產(chǎn)品的重要釋放指標(biāo)[1]。隨著社會產(chǎn)品的多元化，人民對健康越來越重視，對產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來越高[2]。一方面，社會發(fā)展，政府為保障消費(fèi)者對質(zhì)量監(jiān)控加大力度，檢測方法逐漸與國際接軌，質(zhì)量對應(yīng)的法律法規(guī)更加嚴(yán)謹(jǐn)，而食源性污染又是食品行業(yè)最突出的問題[3,4]。另一方面，產(chǎn)品競爭也愈演愈烈，商家都希望能通過自動化手段降低產(chǎn)品成本，增加競爭力。微生物的傳統(tǒng)檢測具有時(shí)間長，人工操作多的特點(diǎn)，需要數(shù)天才能完成，往往成為產(chǎn)品釋放時(shí)間的瓶頸，商家需要為此建立起對應(yīng)的原料以及成品庫存，當(dāng)有超標(biāo)事故發(fā)生，往往是數(shù)天之后，連續(xù)生產(chǎn)的產(chǎn)品可能已經(jīng)受到多天的污染。因此，可靠的微生物自動快速檢測技術(shù)，能為檢測結(jié)果提供預(yù)警信號的儀器，受到市場上的廣泛關(guān)注[5-8]。

市面上有不少成熟的微生物自動化檢測技術(shù)，大部分是采取非瓊脂培養(yǎng)的方式。例如，利用ATP技術(shù)，有Celsis和Charm。利用電化學(xué)法，有梅里埃的Tempo和Sy-Lab的Bactrac。利用顏色變化法，有梅里埃的Bact/Alert。利用流式細(xì)胞技術(shù)，有BD的Microcount，F(xiàn)oss公司的BactoScan和梅里埃的Chemunex。除此之外，還有酶聯(lián)免疫法ELISA[9]，熒光定量PCR法[10,11]，高通量測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)[12]，阻抗法[13]，快速測試紙片[14]，分子生物學(xué)法等。另外一些方式是利用一些預(yù)警的軟件而達(dá)到控制風(fēng)險(xiǎn)的目的[15]。企業(yè)在正式實(shí)施這些方法前，需要有完整的方法驗(yàn)證作為支持，以證明代替方法與傳統(tǒng)方法一致或者更加嚴(yán)格。

傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)，是通過倒瓊脂平皿，然后放置到合適的溫度中培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后人工目視讀數(shù)結(jié)果。微生物檢測的過程中，關(guān)鍵步驟結(jié)果讀數(shù)，大多數(shù)是依賴人工目視讀數(shù)，并且依賴于實(shí)驗(yàn)員的主觀經(jīng)驗(yàn)[16]。目前有不少學(xué)者研究通過自動化的技術(shù)例如影像菌落讀數(shù)儀器對培養(yǎng)皿菌落進(jìn)行自動計(jì)數(shù)[17-19]。我們嘗試使用下文中的Microu3D檢測儀器，在不改變微生物實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間等培養(yǎng)條件的情況下，通過儀器對培養(yǎng)過程中平皿變化的連續(xù)監(jiān)控，探討其與傳統(tǒng)的人工目視讀數(shù)結(jié)果間的一致性，以拓展其在食品和日化品中微生物快速檢測的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)菌株：Escherichia coli ATCC 8739大腸埃希氏桿菌、Staphylococcus aureus ATCC 6538金黃色葡萄球菌、Candida albicans ATCC 10231白假絲酵母菌和Aspergillus brasiliensis ATCC 16404巴西曲霉購買于KWIK-STIK Plus Culture，Microbiologics。

培養(yǎng)基：Modified Letheen Agar (MLA)、Sabouraud Dextrose Agar (SDA)和TAT購于美國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)MicroBio u3D 252398，BD公司；高壓滅菌鍋，美國Steris公司；培養(yǎng)箱BD240，Binder公司；純水儀Elix-10，密理博公司；生物安全柜A2，Thermo公司；超凈工作臺ACB-4A1，Thermo公司；比濁儀，BBL公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備及滅菌

按照供應(yīng)商指引準(zhǔn)備好MLA，SDA，TAT和生理鹽水。培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌15 min。瓊脂培養(yǎng)基使用前放置于46 ℃水浴鍋中保溫，稀釋劑和生理鹽水滅菌后冷卻至常溫使用。

1.3.2 菌懸液的制備

準(zhǔn)備多支0.85%的生理鹽水，用于稀釋菌懸液。無菌條件下將目標(biāo)菌株轉(zhuǎn)接到MLA/SDA平板上進(jìn)行劃線和菌種復(fù)蘇，得到新鮮菌株。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌：將細(xì)菌劃線到MLA平板上，放置于30 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，獲得新鮮菌種。白色念珠球菌：將霉菌劃線到SDA平板里面，放置于22.5 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48小時(shí)。巴西曲霉：將霉菌劃線到SDA斜面試管，放置于22.5 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7～8 d，準(zhǔn)備好比濁儀，將菌懸液調(diào)整到麥?zhǔn)蠞舛?.5（0.5 McFarland standard）。此時(shí)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的濃度為1.5x108CFU/mL，用1:10的濃度進(jìn)行稀釋得到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，共6個(gè)菌液濃度。而白色念珠球菌的濃度為1.0×106CFU/mL，按同樣的方法稀釋得到105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL。用50 mL的生理鹽水，對霉菌斜面試管進(jìn)行潤洗，利用玻璃珠將霉菌芽孢洗脫。對其進(jìn)行1:10稀釋四次，此時(shí)每10 μL的菌懸液大約為20 CFU。

1.3.3 傾注法平板計(jì)數(shù)

1.3.3.1 只接種標(biāo)準(zhǔn)菌株

將目標(biāo)菌種的菌懸液移到平皿中，每種菌的接種梯度為兩個(gè)，分別是20 CFU左右的低濃度接種和150 CFU左右的高濃度接種，每個(gè)平板倒入15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固，分別放入自動讀數(shù)儀和培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌平板培養(yǎng)溫度為30 ℃，真菌平板培養(yǎng)溫度為22.5 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為96 h。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株中加入雜質(zhì)的影響

在平皿中先加入1 g珍珠粉末作為雜質(zhì)，然后接種約50 CFU左右的標(biāo)準(zhǔn)菌株。每個(gè)平板倒入15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固，分別放入自動讀數(shù)儀和培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌平板培養(yǎng)溫度為30 ℃，真菌平板培養(yǎng)溫度為22.5 ℃，培養(yǎng)總時(shí)間為96 h。

1.3.3.3 實(shí)際應(yīng)用

使用某種白色粉末原料，進(jìn)行常規(guī)的微生物污染檢測，使用TAT作為肉湯，然后分別傾注MLA培養(yǎng)基作為細(xì)菌計(jì)數(shù)平板，SDA培養(yǎng)基作為真菌及霉菌計(jì)數(shù)平板。

1.3.4 計(jì)數(shù)對比

每天分別記錄自動讀數(shù)儀和培養(yǎng)箱內(nèi)平板的讀數(shù)，記錄，并對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，利用數(shù)據(jù)分析軟件Minitab對相關(guān)性R2和比值%進(jìn)行評價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 23對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果與分析

2.1.1 儀器與讀數(shù)

儀器外觀如圖1a所示，它具有微生物培養(yǎng)箱的功能，可以設(shè)定不同的溫度，通過每30 min一次的圖片采集（圖1b），形成3D圖像（圖1c），判斷菌落生長的形成，確認(rèn)它是否菌落。由于照片是連續(xù)的，所以可以實(shí)現(xiàn)生長情況的連續(xù)監(jiān)控，如果有超標(biāo)的情況可以實(shí)時(shí)得知。

圖1 MicroBio 3D儀器外觀以及檢測原理Fig.1 Appearance and detection principle of MicroBio 3D

圖2 培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌落時(shí)儀器讀數(shù)和目視讀數(shù)的相關(guān)性Fig.2 Correlation of both methods for microbial colony detection

圖3 加入雜質(zhì)時(shí)儀器讀數(shù)和目視讀數(shù)的相關(guān)性Fig.3 Correlation of both methods for microbial colony detection supplementation with residue

2.1.2 儀器讀數(shù)和目視讀數(shù)的一致性

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉在MLA和SDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h后，分別采用目視法和儀器法進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩種方法的相關(guān)性如圖2所示。由圖2可知，對于金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和白假絲酵母菌，機(jī)器讀數(shù)與目視讀數(shù)的相關(guān)性都在95%以上，而對于巴西曲霉，機(jī)器讀數(shù)與目視讀數(shù)的相關(guān)性為85%，表明兩種方法在測試菌株上具有很高的等效性。

2.1.3 雜質(zhì)對機(jī)器讀數(shù)的影響

將添加有珍珠粉雜質(zhì)的樣品，接種4種實(shí)驗(yàn)菌株，然后測試雜質(zhì)對供試菌株讀數(shù)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，對于金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和白假絲酵母菌，機(jī)器讀數(shù)與目視讀數(shù)的相關(guān)性都在95%以上，表明雜質(zhì)對機(jī)器讀數(shù)的影響較小；而對于巴西曲霉，機(jī)器讀數(shù)與目視讀數(shù)的相關(guān)性是75%，說明雜質(zhì)對霉菌的檢測結(jié)果影響較大。這可能與霉菌的生長形態(tài)有關(guān)，當(dāng)霉菌生長成熟時(shí)在瓊脂表面菌落會蔓延，可能會遮擋其他菌落的形成，加上雜質(zhì)的影響，圖片采集時(shí)可能出現(xiàn)阻擋的情況而使機(jī)器的檢出率降低。

2.1.4 Boxplot分析

圖4 標(biāo)準(zhǔn)菌儀器讀數(shù)與目視讀數(shù)的比值Fig.4 Ratio of results obtained by both methods

圖5 加入雜質(zhì)時(shí)儀器讀數(shù)與目視讀數(shù)的比值Fig.5 Effects of residue on the ratio of results obtained by both methods

參考AOAC指引，接種回收率比值的可接受范圍是50%～200%。比值%=機(jī)器讀數(shù)值除以目視讀數(shù)的數(shù)值。圖4展示了4種實(shí)驗(yàn)菌株的回收率和離散性，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和白假絲酵母菌的回收率平均值分別為112%，105%和114%，具有良好的回收率，而巴西曲霉的回收率平均值是155%。巴西曲霉之所以被檢測出超過100%的回收率，一個(gè)原因可能是對于在霉菌孢子周圍形成的新菌落，機(jī)器比肉眼更敏感故能檢測出來。另一個(gè)原因可能是對于鄰近幾個(gè)菌落形成的片狀，人眼的讀數(shù)會報(bào)讀成一個(gè)菌落，而機(jī)器能檢測出原始擴(kuò)散點(diǎn)而讀數(shù)更高。圖5是當(dāng)加入雜質(zhì)時(shí)對機(jī)器讀數(shù)的影響，從圖5中看到幾個(gè)回收值均比單純培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌落時(shí)要下降，這可能是當(dāng)菌落較小時(shí)，雜質(zhì)會對微小的菌落形成阻擋而令鏡頭無法拍攝到。

2.1.5 圖像

機(jī)器能實(shí)時(shí)顯示出時(shí)間與菌落讀數(shù)的趨勢圖，從圖中發(fā)現(xiàn)，檢測出的速度與回收率，與菌種的類型與菌落形態(tài)有很大關(guān)系。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，能在24 h內(nèi)完成檢測。對于白假絲酵母菌，使用MLA培養(yǎng)基培養(yǎng)的平板能在24 h到達(dá)范圍，而使用SDA平板的需要到48 h才能到達(dá)，這與培養(yǎng)的溫度有關(guān)，SDA培養(yǎng)的溫度較低，故菌落生長相對慢。而巴西曲霉，需要到72 h才能完成檢測，這也是由其生長特性決定的。

2.1.6 雜質(zhì)的區(qū)分

通過比較圖像的差異，可以區(qū)分機(jī)器讀數(shù)是真正的菌落還是由于雜質(zhì)而誤判。因?yàn)榫湓诓煌臅r(shí)間點(diǎn)會變大而雜質(zhì)則維持不變，這在放大的3D圖會更加明顯。最終結(jié)果判讀的時(shí)候，可以結(jié)合目視的讀數(shù)和機(jī)器的讀數(shù)做判斷。

圖6 儀器的檢測時(shí)間與讀數(shù)Fig.6 Detection time and results of MicroBio 3D

圖7 大腸桿菌菌落放大圖Fig.7 Enlarge image of E.coli colony detected by MicroBio 3D

如圖7b所示，結(jié)果頁面會出現(xiàn)培養(yǎng)皿的照片，菌落的位置會顯示紅色標(biāo)記。當(dāng)將鼠標(biāo)指向培養(yǎng)皿內(nèi)區(qū)域，能出現(xiàn)那個(gè)位置的放大三維顯示圖。如果是沒有菌落生長的位置，三維圖像平面不會有變化，顯示圖會出現(xiàn)像圖7a圖像，當(dāng)鼠標(biāo)移到有菌落生長的地方，會顯示出菌落生長的三維圖，如圖7c所示。利用這個(gè)功能也可以區(qū)分開特定區(qū)域的雜質(zhì)和菌落。

2.1.7 MicroBio 3D在固體粉末樣品中的實(shí)際應(yīng)用

表1是采用兩種方法對某白色粉末樣品進(jìn)行微生物污染測試的結(jié)果。由表1可知，22個(gè)樣品，MLA培養(yǎng)皿和SDA培養(yǎng)皿各44個(gè)，對比目視讀數(shù)和儀器讀數(shù)，共88個(gè)培養(yǎng)皿中83個(gè)培養(yǎng)皿的讀數(shù)是一致的，比例為94%。其余5個(gè)培養(yǎng)皿儀器讀數(shù)多于目視讀數(shù)。

表1 儀器法與目視法在固體粉末樣品中的實(shí)際應(yīng)用Table 1 The practical application of both methods for microbial colony detection in solid powder samples

在22個(gè)樣品目視觀察中，樣品1、7、11、18結(jié)果報(bào)告是有菌落生長的，這四個(gè)樣品對應(yīng)的儀器讀數(shù)均對應(yīng)有生長，其中，樣品11的MLA平板目視讀數(shù)為30 CFU/g而儀器讀數(shù)為40 CFU/g，儀器讀數(shù)稍高于目視讀數(shù)。

對于18個(gè)目視讀數(shù)均無任何生長的樣品中，樣品6，12和22則儀器分別報(bào)告有10～20 CFU/g的生長。因此，儀器檢測更為敏感，讀數(shù)稍微多于目視讀數(shù)。

2.2 討論

除了讀數(shù)高度一致性以外，當(dāng)遇到有嚴(yán)重污染或者超標(biāo)的情況，儀器能實(shí)時(shí)發(fā)出郵件警報(bào)，不需要等到培養(yǎng)結(jié)束的時(shí)候才發(fā)現(xiàn)，從而對超標(biāo)結(jié)果起到預(yù)警作用。為微生物實(shí)驗(yàn)室的自動化，實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)完整性，提供了一個(gè)較好的選擇[20]。

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，儀器具備參數(shù)設(shè)定功能，對于特定的微生物，則需要有對應(yīng)的最敏感參數(shù)。對于菌落很小的目標(biāo)菌種，可以調(diào)節(jié)較為敏感的參數(shù)，這樣即使在肉眼未能很好判斷的階段，儀器已經(jīng)能判別出菌落的生長從而起到很好的預(yù)警作用。而對于菌落形態(tài)較大，例如是生長在營養(yǎng)瓊脂表面的芽孢菌落往往會長成片狀，或者是像巴西曲霉那樣的會在瓊脂表面長出孢子的，如果參數(shù)調(diào)節(jié)得敏感，則會有較多的誤判，儀器會將凹凸不平的單菌落誤判為多菌落，一個(gè)成熟霉菌菌落生長出來的許多孢子，肉眼觀察是一個(gè)菌落而機(jī)器會將所有孢子都判斷成為菌落而造成誤判。故此在日常使用過程中，可以優(yōu)先考慮常見菌或者是特定的致病菌，尋找對應(yīng)合適的參數(shù)而使得儀器能在盡可能短的時(shí)間內(nèi)檢測出菌落。另外，當(dāng)雜質(zhì)和菌落在同一個(gè)垂直面上并且菌落非常小的時(shí)候，雜質(zhì)有可能擋住菌落而無法讀出[21]。

從2010年起有不少學(xué)者對通過影像系統(tǒng)對培養(yǎng)皿讀數(shù)進(jìn)行研究[16,20,22,23]，市面上的儀器成品也各有千秋，其核心是影像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理算法，不同的算法影響了儀器的判讀能力、精度和產(chǎn)生誤判機(jī)會的大小[24]。有些儀器能通過菌落的外觀例如大小，顏色，質(zhì)感，邊緣表現(xiàn)等，通過大數(shù)據(jù)分析形成菌落形態(tài)的數(shù)據(jù)庫，當(dāng)檢測樣品菌落數(shù)量的同時(shí)對菌落形態(tài)進(jìn)行分析判定，從而對培養(yǎng)皿上的菌落作菌種鑒定。而到菌種鑒定的步驟，需要有足夠大的數(shù)據(jù)庫，并且同一種菌，生長在瓊脂的不同位置，其形態(tài)和顏色也有所不同，其精確度比起單純的菌落數(shù)量計(jì)算更為復(fù)雜，期望在不久的將來這項(xiàng)技術(shù)能有所突破。

3 結(jié)論

本文討論的儀器能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測的情況下，對活菌的生長進(jìn)行計(jì)算，在不改變檢測方法的前提下，包括培養(yǎng)基的種類，培養(yǎng)的溫度和方式都保持不變，用機(jī)器的判讀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工目視讀數(shù)。在人工接種包括在高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌時(shí)，儀器的檢測讀數(shù)和人工目視讀數(shù)有較高的一致性；在有雜質(zhì)的情況下，儀器判定的菌落更為準(zhǔn)確；而當(dāng)使用實(shí)際樣品進(jìn)行微生物污染檢測時(shí)，儀器讀數(shù)能等同或者稍高于人工讀數(shù)，顯示了其優(yōu)越性。