紅心獼猴桃發(fā)酵液的工藝優(yōu)化及其風味分析

張龍飛，劉瀟瀟，馬娟，李文靜，甘鈺培，陳夢穎，陳大衛(wèi)，顧瑞霞，肖麗霞

（揚州大學江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州 225000）

獼猴桃中營養(yǎng)成分種類多、含量高，因此有 “ 水果之王 ” 的美名[1]。獼猴桃果實具有豐富的營養(yǎng)成分以及良好的醫(yī)療保健作用[2]，其含有豐富的多酚，具有抗炎和抗癌性，可預防某些癌癥并降低患糖尿病的風險，也能夠很好地抑制部分腫瘤細胞的增殖，具有抗氧化和預防心血管疾病的功能[3]。其中紅心獼猴桃，因其果味濃香、甜而不膩、品質(zhì)優(yōu)良而深受消費者的青睞，市場供不應求[4]。

益生菌有利于機體健康，可以直接被人類服用[5]。益生菌的功能較多，如調(diào)節(jié)腸道功能[6]、抗氧化[7]、維持口腔健康、預防糖尿病[8]、防治肥胖[9]、預防癌癥[10]等功能。乳酸桿菌是典型的有益人體腸道健康益生菌，其在腸道中定植、繁殖，進而改善腸道環(huán)境，當攝入足夠的量時，直接或通過與宿主或其他微生物的相互作用提供健康益處[11]。

獼猴桃果蔬汁經(jīng)過益生菌發(fā)酵后，除了風味物質(zhì)的增加外，還有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化、降低脂肪和膽固醇、軟化血管、降血壓、美容、增強抵抗力等[12]功效。同時，獼猴桃發(fā)酵液的生物活性使其具有多種功效：抵抗外來病原菌感染；促進代謝和能量吸收；凈化血液；活化與修復細胞組織[13]。

紅心獼猴桃發(fā)酵液的工藝已有研究，因而本研究從江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室前期篩選的9株益生菌（3株植物乳桿菌、3株發(fā)酵乳桿菌以及3株鼠李糖乳桿菌），以感官評價與耐酸耐膽鹽為檢測指標，篩選出適宜發(fā)酵紅心獼猴桃的植物乳桿菌兩株，通過單因素正交實驗對紅心獼猴桃發(fā)酵液的發(fā)酵工藝進行研究，而后利用GC-MS對最優(yōu)發(fā)酵條件下的紅心獼猴桃發(fā)酵液進行揮發(fā)性風味物質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

紅心獼猴桃，連云港金傲來農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供；在4 ℃相對濕度為90%條件下保存；果膠酶、蔗糖（食品級）、鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶，北京索萊寶；牛膽鹽，榮氏生物制品。

菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）11、154、58，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）56、57、8，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）98、19、22，其中11、154、58、56、57由廣西巴馬長壽人群腸道中篩選而出，8、19、22以及98由云南西藏傳統(tǒng)乳制品中篩選所得，保藏于實驗室。

1.1.2 實驗儀器

美國西屋0965真空破壁機，美國Westhouse公司；SRH60-70申鹿均質(zhì)機，上海申路均質(zhì)機有限公司；真空脫氣機，張家港兆恒機械有限公司；海爾HBL-P08D1B攪拌機，青島海爾成套家電服務有限公司；梅特勒托利多FE28型酸度計，上海右一儀器有限公司；Trace ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

在10 mL MRS液體培養(yǎng)基中接種3%菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h活化二代，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。

1.2.2 耐酸、耐膽鹽實驗

將活化好的菌以3%加入到制備的人工胃液[14]和含有0.3%牛膽鹽[15]MRS液體培養(yǎng)基中。在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h后采用平板菌落計數(shù)法計算其活菌數(shù)并計算菌株的存活率[16]。

1.2.3 酸度

酸堿滴定法分別測獼猴桃發(fā)酵液在發(fā)酵0、6、12、18、22、26、28、30、32、38、40 h的酸度[17]。

1.2.4 活菌數(shù)

用平板計數(shù)法在與測量酸度同一發(fā)酵時間處測定獼猴桃發(fā)酵液的活菌數(shù)[18]。

1.2.5 工藝流程

1.3 操作要點

1.3.1 去皮、去籽、榨汁

選擇成熟、新鮮的紅心獼猴桃果實，清洗去皮，切塊后按照一定料水比4 s初榨，過篩去籽，無籽果肉進入破壁機榨汁80 s。

1.3.2 膠磨、酶解、均質(zhì)

將制備好的獼猴桃漿進入膠磨機，重復兩次后加入0.30%果膠酶，45 ℃水浴1 h酶解[19]。酶解后在20 MPa壓力下均質(zhì)兩次[20]。

1.3.3 脫氣、分裝、殺菌

壓力為80 kPa下真空脫氣30 min[21]，分裝后，進行熱力殺菌（70 ℃、15 min）[22]，果膠酶失活。

1.3.4 冷卻、發(fā)酵、后酸化

殺菌后進行接觸水冷卻，接菌后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。而后放入4 ℃冰箱中12 h進行后酸化[23]，制成成品獼猴桃發(fā)酵液。

1.4 單因素與正交

1.4.1 單因素實驗

以感官與活菌數(shù)為檢測指標，固定接菌量為3%（11和154為1:1），蔗糖添加量為6%，設置料水比分別為4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4；固定接菌量為3%，料水比為1:1，設置蔗糖添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%；固定蔗糖添加量為6%，料水比為1:1，設置接菌量為接菌量為2%、3%、4%、5%、6%。

1.4.2 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，通過感官評價的方法，以蔗糖的添加量（A）、接菌量（B）、料液比（C）為考察因素，進行正交試驗，以感官評分標準為依據(jù)，確定獼猴桃發(fā)酵液的最佳配方，實驗因素與水平詳見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 獼猴桃發(fā)酵液的感官評定標準Table 2 The sensory evaluation criteria for kiwi fruit fermentation broth

1.4.3 感官評價

本實驗采用描述型分析感官評價[24]，評價人員按照表2感官評價表打分，滿分為100分，分為色澤、香味、滋味、組織狀態(tài)這四個方面，各占30%、30%、30%、10%。具體評分標準如表2。

1.5 獼猴桃發(fā)酵液的風味分析

采用GC-MS對未發(fā)酵的獼猴桃汁和獼猴桃發(fā)酵液成品中的揮發(fā)性物質(zhì)的進行分析[23,24]。5 mL的樣品放入頂空固相瓶中，將老化（250 ℃，40 min）好的固相萃取頭進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取，萃取時間為30 min。

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），柱箱升溫程序為：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持3 min，而后以4 ℃/min升溫至250 ℃，維持1 min。載氣He；流速0.8 mL/min；不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～550 u，進樣口溫度250 ℃，MS四極桿溫度150 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并進一步利用Origin 2018進行分析。所有樣品均重復三次。

2 結果與分析

2.1 菌株的耐酸、耐膽鹽能力分析

圖1 菌株耐酸、耐膽鹽情況Fig.1 Strain resistance to acid and bile salts

由圖1分析可知，在耐酸實驗中，在pH=3的耐酸試驗中，9株菌都有較好的耐酸能力，其中植物乳桿菌11、154與58存活率達70%以上，顯著高于發(fā)酵乳桿菌56、57和8以及鼠李糖乳桿菌98、19和22，這與某些植物乳桿菌本身具有耐酸性一致[25,26]；在耐膽鹽實驗中，3 h以后的活菌數(shù)低于106CFU/mL，則認為該菌株不具備耐膽鹽能力，只有植物乳桿菌11、154和58的活菌數(shù)達到了106CFU/mL，可作為發(fā)酵菌株，這與前人報道[27]的從人和動物來源的乳桿菌具有高的存活能力一致。

表3 不同菌株發(fā)酵后的感官評價Table 3 Sensory evaluation of different strains after fermentation

由表3分析可知，9株菌在料水比為1:1獼猴桃液中的發(fā)酵24 h后的感官評價，其中11與154的感官評分均顯著高于其他菌株，達到80分以上，該兩株菌間存在無顯著差異。因而后續(xù)利用11與154號菌進行實驗。

2.2 菌株的發(fā)酵性能

圖2 發(fā)酵時間對酸度與活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on acidity and viable count

由圖2分析，在0～22 h時，活菌數(shù)與酸度隨著發(fā)酵時間而增長，在發(fā)酵22 h時兩株菌活菌數(shù)均達到最大值。22 h后，活菌數(shù)均保持平穩(wěn)或略有下降，酸度也由原始66.00 °T變成89.47 °T與99.47 °T。這可能是由于前期菌株發(fā)酵產(chǎn)物使得發(fā)酵液環(huán)境酸度升高，發(fā)酵環(huán)境不適宜菌株繼續(xù)生長繁殖，抑制了活菌的生長，因而確定后續(xù)菌株的發(fā)酵時間為22 h。

2.3 單因素實驗

2.3.1 料水比對發(fā)酵液的感官與活菌數(shù)的影響

圖3 料水比對感官與活菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of material-water ratio on sensory evaluation and viable count

由圖3可知，料水比過高或過低時，獼猴桃的果香味會過強或過弱，同時發(fā)酵液的pH、酸度及果糖含量等也會發(fā)生顯著變化，從而影響菌株的生長狀態(tài)。感官評價分數(shù)超過80分的料水比有3:1、2:1、1:1（g:g），其感官評價分分別為84.33、86.33、82.33分，此時的活菌數(shù)也分別達到了3.71×108CFU/mL、6.54×108CFU/mL、4.31×108CFU/mL。

2.3.2 蔗糖添加量對發(fā)酵液的感官與活菌數(shù)的影響

圖4 蔗糖添加量對感官與活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of sucrose addition on sensory evaluation and viable count

作為菌株生長的碳源，在一定范圍內(nèi)的增加蔗糖可以使得活菌數(shù)升高，但過多會造成溶液的濃度與滲透壓發(fā)生變化，從而導致菌體死亡；由圖4可知，感官評價分與活菌數(shù)隨著蔗糖添加量的增加先上升后下降。感官評價分數(shù)較高的蔗糖添加量有6.00%、8.00%、10.00%，其感官評價分分別為81.67、86.67、77.67分；活菌數(shù)分別達到了5.41×108CFU/mL、6.28×108CFU/mL、3.71×108CFU/mL。

2.3.3 接菌量對發(fā)酵液的感官與活菌數(shù)的影響

圖5 接菌量對感官與活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of inoculum amount on sensory evaluation and viable count

接種量高低直接影響發(fā)酵液的發(fā)酵效率，過低會影響菌株生長速率從而導致產(chǎn)酸速率過慢，過高則會在短時間內(nèi)造成發(fā)酵產(chǎn)物快速積累，從而導致菌株死亡，影響口感[28]，由圖5可知，感官評價分數(shù)達到84分及以上的有84.47、87.33、85.26分，其對應的接菌量分別為2.00%、3.00%、4.00%，此時對應的活菌數(shù)分別為4.97×108CFU/mL、5.68×108CFU/mL、3.78×108CFU/mL。

2.4 最佳獼猴桃發(fā)酵液配方的確定

由表4可知，獼猴桃發(fā)酵液的感官評價分會隨蔗糖添加量、接菌量、料水比的變化而改變，其中感官評價分數(shù)最高的是2號實驗組，感官評價分為93.34分。其酸甜適中、組織狀態(tài)較為均勻、呈略微偏綠的黃色、帶有獼猴桃自身的果香味，其對應的優(yōu)化組合為A1B2C2，其配方為蔗糖添加量為6.00%（g:g），接菌量為3.00%（g:g），料水比為2:1（g:g）。通過極差R分析發(fā)現(xiàn)影響獼猴桃發(fā)酵液感官的因素關系為A＞C＞B＞D，理論的最優(yōu)組合為A1B2C2，感官評價結果一致。

表4 正交實驗設計及結果Table 4 Orthogonal experimental design and results

2.5 獼猴桃發(fā)酵液風味分析

2.5.1 GC-MS對未發(fā)酵的獼猴桃汁和獼猴桃發(fā)酵液風味物質(zhì)的分析結果

采用GC-MS在未經(jīng)發(fā)酵的獼猴桃汁和獼猴桃發(fā)酵液中分別鑒定出近百種風味物質(zhì)成分。如圖6所示，未經(jīng)發(fā)酵的獼猴桃汁中有70種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類20種、酯類11種、酸類4種、烷烯烴類11種、醛酮類12種和其他類10種；而獼猴桃發(fā)酵液中有107種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類22種、酯類18種、酸類17種、烷烯烴類11種、醛酮類12種和其他類25種。這與張業(yè)芳[29]的研究結果一致，她運用氣相色譜－質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術對獼猴桃乳酸菌飲料進行揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測，共檢測酸類、酯類、醇類及其他類。由圖6還可知，未經(jīng)發(fā)酵的獼猴桃汁與獼猴桃發(fā)酵液中的各物質(zhì)的相對含量均有變化。這兩者中醇類的相對含量分別為7.89%、11.96%；酯類的相對含量分別為15.07%、23.02%；酸類的相對含量分別為30.46%、38.90%；烷烯烴類的相對含量分別為28.07%、0.85%；醛酮類的相對含量分別為13.42%、12.91%；其他類的相對含量分別為1.85%、4.76%。經(jīng)過益生菌發(fā)酵及后酸化后，獼猴桃發(fā)酵液中的醇類、酯類、酸類、其他類的風味物質(zhì)種類和相對含量明顯增加。這與熊濤[30]等人的研究結果一致，他們研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的胡蘿卜汁醇酯類物質(zhì)增加，富有豐富的胡蘿卜清香。其中，發(fā)酵后的酸類種類是發(fā)酵前的4倍多，主要是菌體利用糖類進行發(fā)酵后，產(chǎn)生了許多包括乳酸、乙酸在內(nèi)的有機酸；烷烯烴類的種類數(shù)目未變，但含量明顯下降。獼猴桃發(fā)酵液中相對含量較高的風味物質(zhì)分別是2-乙基丁酸（36.28%）、苯甲酸乙酯（19.06%）、2-甲基環(huán)戊酮（10.03%）、正己醇（2.2%）、乙醇（1.82%）、乙酸（1.66%）：酸度劑，增香劑、乙醛（1.46%）、1-戊炔-3-醇（1.21%）、油酸甲酯（1.12%）、桉葉油醇。發(fā)酵后獼猴桃汁的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類豐富，有獼猴桃獨特的清涼協(xié)調(diào)感，數(shù)據(jù)與感官評價相貼合。

圖6 獼猴桃發(fā)酵前后中各成分種類的數(shù)目及其相對含量Fig.6 The relative contents of various components in kiwifruit fermentation broth

圖7 獼猴桃發(fā)酵前揮發(fā)性風味物質(zhì)的總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds in kiwi fruit before fermentation

圖8 獼猴桃發(fā)酵后揮發(fā)性風味物質(zhì)的總離子流圖Fig.8 Total ion current diagram of volatile flavor compounds in kiwi fruit after fermentation

2.5.2 獼猴桃發(fā)酵液理化指標與微生物指標參數(shù)

表5 理化指標與微生物指標參數(shù)Table 5 The physicochemical parameters and microbial parameters

經(jīng)植物乳桿菌11以及154混合發(fā)酵后，其酸度達到97.47 °T，pH為4.14，活菌數(shù)為2.21×109CFU/mL，此時產(chǎn)品酸甜可口，風味口感俱佳，活菌數(shù)高，具有良好益生功能潛力。

3 結論

3.1 植物乳桿菌11、58、154的耐酸、耐膽鹽能力較優(yōu)，優(yōu)于其余包括發(fā)酵乳桿菌與鼠李糖乳桿菌，而11與154發(fā)酵的紅心獼猴桃漿感官評價結果較好，因而11和154號菌株適宜發(fā)酵紅心獼猴桃漿的生產(chǎn)。

3.2 11與154號菌株在紅心獼猴桃漿中22 h時的酸度最高，活菌數(shù)達到最大，因而選擇22 h為發(fā)酵終點。以紅心獼猴桃和11、154號菌為原料，通過單因素、正交實驗確定益生菌發(fā)酵獼猴桃發(fā)酵液的配方。配方為：蔗糖添加量為6.00%，接菌量為3.00%，料水比為2:1（g:g），經(jīng)過酶解、膠磨、均質(zhì)、脫氣、滅酶殺菌以及發(fā)酵工藝后，最終制成的獼猴桃發(fā)酵液成品呈略微偏綠的黃色，色澤均勻一致，組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，擁有獼猴桃自身的果香，滋味酸甜適中。經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后的獼猴桃汁具有豐富的揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中含量較高的風味物質(zhì)具有柑橘、獼猴桃等清涼感。