藍莓酵素中復合菌種添加比例的確定及發(fā)酵工藝優(yōu)化

白琳，茹先古麗·買買提依明，丁帥杰，許俊鋒，徐兵潔，鄭霞，艾合買提江·艾海提，劉軍

（新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆烏魯木齊 830046）

藍莓（Vaccinium spp.）又名越橘、篤斯、都柿等，屬杜鵑花科越橘屬多年灌木果樹。原產(chǎn)于北美洲與東亞，主要分布于朝鮮、日本等國家，在我國主要分布在黑龍江、安徽懷寧縣、吉林長白山等地區(qū)[1,2]。藍莓果實呈小而圓的顆粒狀，果皮為藍紫色，果味酸甜可口，香味獨特。果實中富含花青素、SOD（超氧化物歧化酶）活力、各種維生素、蛋白質(zhì)以及糖類等[3,4]。

中華人民共和國輕工行業(yè)標準QB/T 5323-2018對植物酵素的定義是指可以用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的用于種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、土壤改良的酵素產(chǎn)品[5]。傳統(tǒng)的發(fā)酵食品多種多樣，例如泡菜[6]、奶制品[7,8]、果酒[9]、豆腐乳[10]等都與人們的生活息息相關。近年來，隨著發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)展，酵素產(chǎn)品也逐漸走進了人們的生活，引起人們的重視。李國英等人[11]用酵母菌制備了木瓜酵素，王領等人[12]用酵母菌制備了火龍果酵素，郭艷萍等人[13]用酵母菌制備了葡萄酵素，李飛等人[14]由多種有益菌制備了蘋果酵素，蔣增良等人[15]通過自然發(fā)酵得到具有天然微生物酵素的功能性產(chǎn)品。酵素中含有SOD（超氧化物歧化酶）活力，它是一種以超氧陰離子為底物的酶[16]，具有抗氧化、抗衰老[17]功效。發(fā)酵液中的糖和酸的含量是判斷菌種的發(fā)酵速度及感官評價的重要指標。不同的菌種在發(fā)酵過程中對發(fā)酵液的影響不同。植物乳桿菌可以為發(fā)酵液提供獨特的酸味[18]，乳酸片球菌能維持腸道微生態(tài)平衡、提高機體生長性能、輔助增強機體免疫力[19]，嗜酸乳桿菌具有抗菌性能[20]，報道稱副干酪乳桿菌可以提高藍莓的抗氧化活性[21]，鼠李糖乳桿菌具有耐膽汁鹽、耐酸和耐抗生素生物學特性，能夠很好地耐受宿主消化道環(huán)境，幫助宿主調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[22]。

植物酵素多種多樣，學者們對發(fā)酵過程中工藝參數(shù)的優(yōu)化研究頗多[23,24]，但對于藍莓酵素的研究非常少，并且很少有多種菌種發(fā)酵藍莓果汁的研究。本文利用五種不同的菌種發(fā)酵藍莓果汁，以超氧化物歧化酶（SOD）活力、可溶性固形物含量（TSS）、pH值為指標，首先通過均勻設計確定發(fā)酵菌種接種體積比例，然后設計不同的發(fā)酵時間、溫度、發(fā)酵液初始菌密度以及初始可溶性固形物含量的單因素實驗，最后通過響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期發(fā)酵出SOD活性高且使消費者滿意的藍莓酵素產(chǎn)品。通過對藍莓進行發(fā)酵，對充分利用藍莓資源、發(fā)展特色經(jīng)濟具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓，購自安徽懷寧縣；SOD試劑盒，南京建成有限公司；冰乙酸、碳酸鈉（均屬于分析純），天津市盛奧化學試劑；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；果膠酶（500 u/mg）、纖維素酶（50 u/mg）、半纖維素酶（20 u/mg），諾維信有限公司；植物乳桿菌bio-52467、乳酸片球菌bio-56623、嗜酸乳桿菌bio-53058、副干酪乳桿菌bio-03644、鼠李糖乳桿菌bio-52962，中國微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

高端破碎料理機MD-767，中山市韓菱電器有限公司；分析天平FA 1004，上海越平科學儀器有限公司；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；721G可見分光光度計、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司；酸度計PHS-3C，上海杲森儀器設備有限公司；高精度手持式色差儀3 nh，致芯電子五金工具。

1.3 指標測定方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng)

將購買得到的菌種在無菌操作臺上倒入裝有30 mL的無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下活化16～24 h，保證培養(yǎng)基中的細胞密度達到 8.00～9.00 log(CFU/mL)（利用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)）。培養(yǎng)至2～3代用于接種。

1.3.2 藍莓酵素制備過程

將藍莓解凍后用高端破碎料理機破碎（藍莓果汁的初始TSS含量為9 °Brix），然后在55 ℃下加酶酶解3 h。果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶的總添加量（質(zhì)量）為0.8%，添加比例為2:1:1。酶解后在85 ℃下滅菌15 min。待溫度冷卻至37 ℃，將菌種接入藍莓果汁中。最后用棉花將瓶口塞緊后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜態(tài)發(fā)酵。

1.3.3 菌種中細胞密度計數(shù)

發(fā)酵液中的菌密度利用血球計數(shù)板進行計數(shù)。計數(shù)后，將細胞密度以CFU/mL表示。所有操作均重復三次。計算公式如下：

表1 均勻設計因素水平表Table 1 Uniform design factor level table

表2 均勻設計試驗方案Table 2 Uniform design table of the experiment

1.3.4 pH值的測定

利用臺式酸度計進行pH值的檢測。檢測前，將酸度計用pH4.00、6.86、9.10的標準緩沖液在25 ℃下進行校準。參照GB 10468-1989方法進行檢測[25]。所有操作均重復三次。

1.3.5 總可溶性固形物（TSS）含量的測定

利用手持糖度計來檢測總可溶性固形物（TSS）含量，檢測前將糖度計用蒸餾水調(diào)零。所有操作均重復三次。

1.3.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性的檢測

根據(jù)試劑盒檢測方法，將藍莓汁發(fā)酵液在4000 r/min下離心15 min，取上清液進行測定。將取得的上清液用0.1 mol/L pH 7.0～7.4的磷酸緩沖液稀釋成不同濃度進行最佳取樣量的摸索。最后按照操作表進行試驗。所有操作均重復三次。

1.4 均勻設計確定接種體積比例

均勻設計具有使所有實驗點均勻分散，沒有整齊可比的特點。它使得試驗次數(shù)最小化，試驗簡單化。本試驗根據(jù)吉夢雯[26]的研究方法進行略微的修改進行了五因素十水平（U11(1110)）的實驗設計。均勻設計中，以SOD活性、pH值、TSS含量為響應值，以五種菌種（包括植物乳桿菌、乳酸片球菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）的接種體積比例為因素。在37 ℃下，將初始TSS含量調(diào)整為11 °Brix，以下面十種不同菌種比例進行試驗，發(fā)酵36 h。均勻設計因素水平表如表1所示。根據(jù)均勻設計因素水平表得出十組均勻設計試驗方案如表2所示。

1.5 單因素試驗

1.5.1 發(fā)酵時間對藍莓酵素指標的影響

將藍莓發(fā)酵液在37 ℃、初始菌密度為106CFU/mL（接種體積比例為植物乳桿菌22.45%、乳酸片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌14.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%）以及初始可溶性固形物含量控制在11 °Brix，分別發(fā)酵24、28、32、36、40 h，測定每組發(fā)酵液的SOD活力、pH值、TSS含量。

1.5.2 發(fā)酵溫度對藍莓酵素指標的影響

將藍莓發(fā)酵液初始菌密度控制在106CFU/mL（接種體積比例為植物乳桿菌22.45%、乳酸片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌14.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%）、初始可溶性固形物含量為11 °Brix，將藍莓發(fā)酵液在23、30、37、44、51 ℃下發(fā)酵36 h，測定每組發(fā)酵液的SOD活力、pH值、TSS含量。

1.5.3 發(fā)酵液中初始菌密度對藍莓酵素指標的影響

將藍莓發(fā)酵液初始可溶性固形物含量控制為11 °Brix，將藍莓發(fā)酵液的初始菌密度分別控制為5×105、106、5×106、107、5×107CFU/mL（接種體積比例為植物乳桿菌22.45%、乳酸片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌14.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%），在37 ℃下發(fā)酵36 h，測定每組發(fā)酵液的SOD活力、pH值、TSS含量。

1.5.4 初始可溶性固形物含量對藍莓酵素指標的影響

將藍莓發(fā)酵液的初始菌密度控制為106CFU/mL（接種體積比例為植物乳桿菌22.45%、乳酸片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌14.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%）。初始可溶性固形物含量為9°Brix，在此基礎上將發(fā)酵液初始TSS含量調(diào)整為9、11、13、15、17 °Brix，在37 ℃下發(fā)酵36 h，測定每組發(fā)酵液的SOD活力、pH值、TSS含量。

1.6 響應面法優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝

以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始菌密度、初始可溶性固形物含量為因素，SOD活力為響應值利用Design-Expert.V8.0.6軟件依據(jù)Box-Behnken的原理進行四因素三水平的響應面試驗設計。響應面實驗的因素水平表如表3所示。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels of the experiment

1.7 色差測定

色差的測定根據(jù)苗文娟等人[27]的描述稍作修改。首先在50 mL離心管中放入試管2/3體積左右發(fā)酵液，用離心機在4000 r/min下離心20 min。然后取上清液用色差儀測定發(fā)酵液的L*、a*、b*值，用下列公式計算：

其中，L代表明暗度，a代表紅綠色，b代表黃藍色，ΔE值越大，代表發(fā)酵液在發(fā)酵前后生物顏色變化越大。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert.V8.0.6進行響應面分析，利用Origin 2019b 64Bit版本和Excel 2016軟件進行作圖。使用SPSS 24.0進行二次多項式回歸分析，確定p＜0.05的統(tǒng)計學上的顯著性差異。所有數(shù)據(jù)分析均重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設計確定菌種比例結(jié)果與分析

表4 均勻設計實驗結(jié)果Table 4 Results of uniform design experiments

由于在十組試驗中，每組試驗的pH值基本不變，TSS含量同樣也基本保持不變，故以SOD活力為響應值運用SPSS 24軟件進行二次多項式逐步回歸方程分析，建立回歸方程如下所示：

回歸方程中R2=0.99，F(xiàn)=99.85，P=0.08＜0.1（由于樣本量小，達到了邊緣性顯著），證明方程可以較準確的預測出最佳條件。綜上，預測出藍莓酵素的最佳接種體積比例分別為植物乳桿菌22.45%、戊糖片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌14.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%，此時SOD活力達到89 U/g。根據(jù)預測出的最佳條件進行驗證試驗，得出藍莓酵素發(fā)酵后的SOD活力為82 U/g。

2.2 響應面法優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

圖1 發(fā)酵時間、溫度、初始菌密度及初始TSS含量對藍莓酵素SOD活力、pH值及TSS含量的影響Fig.1 The influence of fermentation time, temperature, initial bacterial density and initial soluble solid content on the SOD activity, pH value and TSS content of blueberry juice

發(fā)酵時間、溫度、初始菌密度及初始TSS含量對藍莓酵素SOD活力、pH值及TSS含量的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，在不同的發(fā)酵條件下，pH值與TSS含量基本保持不變。圖1d的TSS含量變化幅度大，這是因為初始TSS含量的不同。因而，將SOD活力作為主要指標進行單因素實驗。由圖1a所知，發(fā)酵到36 h時，SOD活力達到最高為86.67 U/g。當發(fā)酵時間小于36 h時，菌種的發(fā)酵速度正在加快，SOD活力未達到最大值。當發(fā)酵時間超過36 h時，由于發(fā)酵液中的菌種所利用的碳水化合物減少，使得發(fā)酵速度減慢，因而SOD活力下降。綜上所述，當發(fā)酵到36 h時可以停止發(fā)酵。由圖1b所示，當發(fā)酵溫度為37 ℃時，SOD活性達到最高為86.44 U/g。當發(fā)酵溫度低于或者高于37 ℃時，都不利于菌種的生長，使得SOD活力下降，因而37 ℃最適合發(fā)酵藍莓酵素，這與梁貴秋等人[28]的研究結(jié)果（發(fā)酵最適溫度為35～40 ℃）基本一致。由圖1c可以看出，當發(fā)酵液中菌密度為5×106CFU/mL時，SOD活性最高達到81.64 U/g。當初始接種量低于5×106CFU/mL時，菌種不能充分利用發(fā)酵液中的碳源等營養(yǎng)物質(zhì)使得SOD活力未達到最高值。當高于5×106CFU/mL時，菌密度因過飽和快速發(fā)酵，產(chǎn)大量的有機酸使得SOD活力下降[20]。因而可以將發(fā)酵液中的初始菌密度調(diào)整為為5×106CFU/mL。由圖1d可以看出，當發(fā)酵液的初始可溶性固形物含量為11 °Brix時，SOD活性達到最高為85.49 U/g，當TSS含量低于11 °Brix時，菌種所需要利用的碳源不夠，發(fā)酵速度下降因而使得SOD活力降低，當高于11 °Brix時，發(fā)酵液中糖量過高抑制了菌種的生長和代謝，使得SOD活力降低。因而將發(fā)酵液中的初始TSS含量調(diào)為11 °Brix。

表5 響應面優(yōu)化藍莓酵素發(fā)酵工藝實驗次數(shù)及結(jié)果Table 5 The experiments and results of response surface optimization of blueberry jiaosu fermentation process

表6 藍莓酵素SOD活力的多項式模型的方差分析Table 6 Analysis of variance to blueberry jiaosu of SOD activity

注：**具有高度顯著性（p＜0.01）；*具有顯著性（p＜0.05）；（*）較顯著（0.05＜p＜0.1）；R2=0.9815，RAdj=0.9630。

圖2 因素相互作用對藍莓酵素SOD活力的影響Fig.2 The influence of the interaction of factors on the SOD activity of blueberry juice

2.2.2 響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，可以看出各個單因素對藍莓酵素的pH值及TSS含量影響基本一致，因而在進行響應面設計時，將SOD活力選擇為響應值進行響應面實驗設計。本研究設計了四因素三水平共29次試驗的響應面分析，采用Box-Behnken原理對試驗結(jié)果進行分析[29]，得到藍莓酵素SOD活力的二次回歸方程為：

由方差分析圖（表5）可以看出，模型的p＜0.0001，具有高度顯著性，證明該模型能很好的預測及優(yōu)化發(fā)酵工藝。而失擬項的P值為0.4568（p＞0.05），證明該模型對試驗擬合度好。從表中還可以看出，發(fā)酵時間和接種量對藍莓酵素SOD活力的影響具有高度顯著性（p＜0.01），發(fā)酵溫度對SOD活力影響具有顯著性（p＜0.05），而糖添加量對藍莓酵素SOD的影響不具有顯著性（P=0.6853）。從表5及圖2可以看出當某兩個因素保持不變時，另外兩個因素相互作用時對藍莓酵素SOD活力的影響?？梢钥闯?，A因素與C因素、B因素與D因素、C因素與D因素之間的相互作用曲線變化趨勢比較明顯，這說明這幾個因素的相互作用對藍莓酵素SOD活力的影響具有顯著性（p＜0.05）。根據(jù)響應面結(jié)果預測出藍莓酵素的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間36.22 h，發(fā)酵溫度37.52 ℃，初始接種量調(diào)整為5.82×106CFU/mL，初始可溶性固形物含量調(diào)整為11.01 °Brix，在此工藝條件下，藍莓酵素的SOD活力最終可以達到88.29 U/g。為了驗證響應面法優(yōu)化的結(jié)果的準確性，本研究用優(yōu)化出的工藝條件進行了5次試驗。試驗過程中為了方便操作，將藍莓酵素的發(fā)酵工藝調(diào)整為發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始接種量為5.5×106CFU/mL，初始可溶性固形物含量為11 °Brix，發(fā)酵后藍莓酵素的SOD活力平均達87.45 U/g，與預測值很接近，由此證明，該模型可以很好的預測藍莓酵素的發(fā)酵工藝。劉鑫[2]等人用植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵藍莓酵素，發(fā)酵出的酵素中SOD活力達到81.27 U/g＜87.45 U/g，由此說明，多菌種發(fā)酵可以提高藍莓酵素的SOD活力。除此之外，實驗得出藍莓果實的SOD活力為59.05 U/g＜87.45 U/g，增加了48%，這說明發(fā)酵有效增加了藍莓果實的SOD活性。

2.3 藍莓酵素色差分析

表7 藍莓酵素在發(fā)酵前后的顏色特性的變化Table 7 Changes in the color characteristics of blueberry jiaosu before and after fermentation

表7展示了藍莓酵素在發(fā)酵前后的顏色特性的變化，包括L*（亮度）、a*（紅綠色）、b*（黃藍色）、H*（透明度）、C*（色彩角）、ΔE（色差）。藍莓酵素顏色的變化與花青素的含量相關[30]。從表中可以看出，發(fā)酵后，藍莓酵素的L*、b*值下降，這與花青素含量密切相關。而a*值也呈現(xiàn)了輕微的下降趨勢，這可能是由于在發(fā)酵過程中的滅菌過程對花青素的分子結(jié)構(gòu)造成了破壞，使得花青素含量下降從而導致a*值降低，但發(fā)酵后的果汁總體呈現(xiàn)暗紅色[31]。然而，ΔE值只有1.25，這表明在發(fā)酵前后藍莓酵素的顏色改變并不明顯。

3 結(jié)論

五種不同的菌種被用于發(fā)酵藍莓酵素，以SOD活性、pH值、TSS含量為指標，首先通過均勻設計確定每種菌種接種體積比例為植物乳桿菌22.45%、乳酸片球菌42.86%、嗜酸乳桿菌24.29%、副干酪乳桿菌16.33%、鼠李糖乳桿菌4.1%。接著通過響應面法優(yōu)化出最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始接種量為5.5×106CFU/mL，初始可溶性固形物含量調(diào)整為為11 °Brix，發(fā)酵后藍莓酵素的SOD活力最終達到87.45 U/g。通過對藍莓進行發(fā)酵，不僅提高了藍莓產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，而且對于藍莓的營養(yǎng)價值有一定的提高。適合于發(fā)酵藍莓酵素的有益菌種多種多樣，本研究僅挑選了五種菌種，還有大量的菌種等待我們?nèi)ヌ剿餮芯俊?/p>