一株高產(chǎn)乙偶姻芽孢桿菌菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

張玲玲，羅惠波，黃丹，張倩，鄭升海，童文華

（四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

曲為酒之骨，酒曲質(zhì)量的好壞直接影響著白酒的質(zhì)量、產(chǎn)量和風(fēng)格。中高溫大曲是釀造濃香型白酒的糖化發(fā)酵劑，含有酵母、霉菌、細(xì)菌等多種微生物，這些微生物在濃香型白酒的釀造過(guò)程中共酵生成復(fù)雜的白酒成分，賦予了濃香型白酒獨(dú)特的風(fēng)格特征[1,2]。中高溫大曲在制曲培菌過(guò)程中最高品溫可達(dá)62 ℃，由于芽孢桿菌存在利用芽孢應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境的特性，因此在大曲制備的高溫條件下芽孢桿菌成為其中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌之一。芽孢桿菌不但能夠代謝產(chǎn)生ACT、2,3-丁二醇以及吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)作為濃香型白酒的主要呈香物質(zhì)，還可以代謝產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等多種酶類，推動(dòng)大曲及白酒釀造過(guò)程中的各種生化反應(yīng)進(jìn)行[3,4]。ACT學(xué)名3-羥基-2-丁酮（3-Hydroxy-2-butanone），是一種具有特殊奶油香味的揮發(fā)性化合物，有類似蜂蜜的甜味，是酒類調(diào)香中一個(gè)極其重要的物質(zhì)，也是白酒風(fēng)味物質(zhì)中的重要香味成分，在名優(yōu)酒中含量尤為突出[5]。ACT同時(shí)也是一種重要的高附加值化學(xué)品，廣泛用于食品，煙草，化妝品，洗滌劑，化學(xué)合成，植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑和生物害蟲防治中[3,6,7]。

近些年ACT合成方式的研究越來(lái)越受關(guān)注，ACT生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法[8]、酶轉(zhuǎn)化法[9]和微生物合成法[10-12]。由于化石資源日益枯竭、溫室效應(yīng)、污染排放等因素的制約，化學(xué)合成法逐步被微生物合成法取代。微生物合成法是根據(jù)微生物的生理特性和其自身的代謝特點(diǎn)，以廉價(jià)碳源為底物，在一定條件下通過(guò)發(fā)酵獲得ACT的一種良好方法，具有安全、經(jīng)濟(jì)、綠色、高效、可持續(xù)的特點(diǎn)，越來(lái)越受到各國(guó)研究者的關(guān)注。在微生物發(fā)酵法中，篩選更高效、穩(wěn)定的ACT生產(chǎn)菌株，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，對(duì)提高ACT產(chǎn)量有至關(guān)重要的作用[13,14]。

自然界中能夠自然合成ACT的微生物有很多。TIAN等[15]從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisSF4-3），使用優(yōu)化的培養(yǎng)基后ACT產(chǎn)量達(dá)到46.2 g/L；TEIXEIRA等[16]對(duì)有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）的搖瓶發(fā)酵條件（葡萄糖濃度、溫度、pH）進(jìn)行優(yōu)化，使得最終ACT產(chǎn)量達(dá)到365 mg/L；ZHENG等[17]將哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensisM1）應(yīng)用于豆?jié){發(fā)酵，使其風(fēng)味明顯改善，經(jīng)GC/MS分析2,3-丁二醇與ACT豐度顯著增加；SUN等[12]采用輔因子工程提高了粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensH32）的ACT產(chǎn)量，結(jié)合補(bǔ)料分批發(fā)酵使ACT產(chǎn)量達(dá)到75.2 g/L；LIU等[18]將NADH/NAD+再生系統(tǒng)引入多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxaCJX518），從而調(diào)節(jié)ACT和2,3-丁二醇之間的分布，使ACT最大產(chǎn)量為57.20 g/L。近年來(lái)對(duì)ACT的研究更多集中于天然高產(chǎn)ACT菌株的選育、代謝通路改造與工程菌的構(gòu)建。本研究以濃香型大曲為菌株來(lái)源，以四川某酒廠大曲為樣品，經(jīng)肌酸比色法獲得高產(chǎn)ACT的菌株，為天然高產(chǎn)ACT的微生物添加新菌株，并利用單因素法和響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)ACT的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了菌株發(fā)酵生產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

大曲樣品取自四川某酒廠。

葡萄糖、酵母粉、瓊脂、蛋白胨、七水硫酸鎂，上海生工生物工程股份有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸銨，成都市科隆化學(xué)品有限公司；肌酸，上海麥克林生化科技有限公司；1-萘酚，天津市光復(fù)精細(xì)化學(xué)試劑研究所。

液體富集培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%、酒醅浸提液，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

分離、純化培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%、瓊脂1.50%，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8%、蛋白胨1%、酵母粉1%、氯化鈉0.05%、七水硫酸鎂0.03%、二水氯化鈣0.10%、磷酸二氫鉀0.03%、硫酸銨0.03%，pH 6.0，在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-l201生化培養(yǎng)箱，美國(guó)Fisher Scientific公司；ST2100 pH計(jì)，奧豪斯儀器（常州）有限公司；UV-1200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-D240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；XSP-C生物顯微鏡，北京瑞宏誠(chéng)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)ACT芽孢桿菌的篩選

1.3.1.1 芽孢桿菌菌株的分離篩選

樣品處理：稱取大曲1 g，放入盛有99 mL無(wú)菌水且含有無(wú)菌玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩使大曲分散均勻，制備樣品懸浮液。懸浮液在85 ℃水浴加熱10 min，淘汰非芽孢細(xì)菌，再吸取1 mL懸浮液于富集培養(yǎng)基中，過(guò)夜富集培養(yǎng)。

分離純化：在超凈工作臺(tái)中將富集液梯度稀釋成10-3～10-8的菌液，吸取0.2 mL菌液滴于分離培養(yǎng)基平板中央，用涂布棒將菌懸液在培養(yǎng)基上涂抹均勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h。根據(jù)芽孢桿菌菌落形態(tài)特征，選取菌落形態(tài)不一致的菌落，用無(wú)菌接種環(huán)分別于分離培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單個(gè)菌落，再挑選單菌落進(jìn)行不斷純化培養(yǎng)。

1.3.1.2 高產(chǎn)ACT菌株的篩選

初篩：采用肌酸顯色法來(lái)篩選能合成ACT的菌株。方法為將1 g 1-萘酚，0.1 g肌酸與4 g NaOH配成100 mL肌酸混合液，將從大曲中篩選得到的芽孢桿菌菌株，輕刮一環(huán)菌于盛有1 mL混合液的試管中，能產(chǎn)ACT的菌株能使混合液快速變?yōu)榧t色。

復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，再以5%的接種量接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后12000 r/min離心2 min，取上清液，以比色法測(cè)定發(fā)酵液的OD522nm值，從而獲得ACT產(chǎn)量較高的菌株。將50%甘油與菌液按1:1混合均勻，-70 ℃保藏。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

挑取一環(huán)新鮮的斜面菌種，接入50 mL種子培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)12 h，以5%接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)22 h，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h時(shí)取出對(duì)應(yīng)三角瓶，測(cè)定OD600nm值，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.3 目的菌株的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)觀察及理化鑒定

細(xì)菌的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)該菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢有無(wú)運(yùn)動(dòng)性、酪蛋白水解、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、甲基紅試驗(yàn)等生理生化鑒定，細(xì)菌大小利用電子顯微鏡觀察。

1.3.3.2 菌株的耐受性研究

菌株對(duì)酸度的耐受性：將種子液以5%接種量轉(zhuǎn)接到pH分別為3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)定OD600nm，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

菌株對(duì)乙醇的耐受性：將種子液以5%接種量轉(zhuǎn)接到乙醇含量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)定OD600nm，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.3.3 16S rRNA序列分析測(cè)定

細(xì)菌染色體提取方法用改良CTAB法[19]。以提取的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F：AGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTG TTACGACTTPCR，擴(kuò)增16S rRNA基因。反應(yīng)體系：10×Taq buffer 5 μL，dNTP（Mix）2 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各2 μL，雙蒸水補(bǔ)至總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)獲得鑒定結(jié)果，并利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 高產(chǎn)ACT菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速和溫度等因素[13,16]影響著菌體的生長(zhǎng)和代謝，因此選取pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、溫度（31、34、37、40、43 ℃）、接種量（3%、5%、7%、9%、11%）、轉(zhuǎn)速（120、150、180、210、240 r/min）、裝液量（30、40、50、60、70 mL/250 mL）等5個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)L18(73)正交試驗(yàn)，考察不同因素對(duì)ACT產(chǎn)量影響的大小。對(duì)pH、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量和接種量5個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)考察因3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以pH，溫度，裝液量作為變量，以ACT產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.5 檢測(cè)方法

1.3.5.1 ACT的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L ACT標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入4.5 mL肌酸混合液，振蕩混勻，在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，測(cè)定OD522nm值。每個(gè)濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并準(zhǔn)備一個(gè)作為空白對(duì)照。

1.3.5.2 發(fā)酵液中ACT含量的測(cè)定

吸取1 mL發(fā)酵液于離心管中，4 ℃、12000 r/min離心2 min，上清液適當(dāng)稀釋后，取0.1 mL于試管中再加入4.5 mL肌酸混合液，振蕩混勻，30 ℃下反應(yīng)30 min，測(cè)定OD522nm值，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。最后根據(jù)ACT標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算出ACT產(chǎn)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，采用Origin進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選結(jié)果

2.1.1 樣品初篩

將分離純化得到的30株芽孢桿菌分別輕刮一環(huán)菌于含有1 mL肌酸混合液的試管中，能產(chǎn)ACT的菌株使混合液2 min內(nèi)迅速變?yōu)榧t色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有20株芽孢桿菌可使肌酸混合液變紅，其中有5株芽孢桿菌（A2、A9、A18、A19、A21）代謝物與肌酸混合液快速反應(yīng)且呈現(xiàn)深紅色（圖1）。但此法不能準(zhǔn)確判斷菌株產(chǎn)ACT的能力強(qiáng)弱，需進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 菌株初篩結(jié)果Fig.1 Strain screening results

2.1.2 ACT標(biāo)準(zhǔn)曲線

以ACT濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制ACT標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為 y=5.3989x-0.0444，相關(guān)系數(shù) R2=0.9991，表明兩者之間線性關(guān)系良好。

圖2 ACT標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of acetoin

2.1.3 樣品復(fù)篩

對(duì)初篩獲得的5株芽孢桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液，將其與肌酸混合液反應(yīng)后測(cè)吸光值，結(jié)果見(jiàn)表1，篩選得到一株高產(chǎn)ACT的菌株A21。

表1 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Strain rescreening results

2.2 菌株A21的生長(zhǎng)曲線

在搖瓶培養(yǎng)的過(guò)程中，每隔2 h取樣測(cè)OD600nm值，由圖2可知，菌株A21在0～4 h為生長(zhǎng)延滯期，菌數(shù)增長(zhǎng)緩慢；6～12 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)快速升高；12～18 h處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌群總數(shù)保持穩(wěn)定；18 h后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。

圖3 菌株A21生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain A21

2.3 菌株A21的耐受性特征

由圖4a可知，當(dāng)pH為3.5時(shí)，OD600nm值為0.1，表明該菌株具有較強(qiáng)的耐酸性能，最低酸耐受pH為3.5，隨著pH的增大，OD600nm值先增大后降低，表明菌株A21生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH 5～8時(shí)生長(zhǎng)良好，其最適生長(zhǎng)pH為5.0。由圖4b可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，OD600nm值逐漸降低，表明隨著酒精度的不斷增加，菌株A21生長(zhǎng)逐漸受到影響，菌株A21適合在酒精度較低的條件下生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)酒精度達(dá)到6%時(shí)，OD600nm值趨于零，表明菌株A21的生長(zhǎng)完全受到抑制，乙醇最大耐受5%。

2.4 菌株A21的鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察

菌株A21革蘭氏染色后呈紫色（圖5a）；芽孢染色實(shí)驗(yàn)表明該菌株含有芽孢（圖5b），染色后芽孢呈綠色，菌體呈紅色；由電鏡照片可知，此菌株大小，寬0.40 μm～0.80 μm，長(zhǎng)2 μm～3.80 μm（圖5c）。由此判斷該菌株為革蘭氏陽(yáng)性短桿狀芽孢桿菌。

圖4 菌株A21對(duì)酸度和乙醇的耐受性Fig.4 Acidity and ethanol tolerance of strain A21

圖5 菌株A21的形態(tài)學(xué)特征Fig.5 Morphological characteristics of strain A21

2.4.2 生理生化試驗(yàn)

菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。菌株A21兼性厭氧，能產(chǎn)酸，有運(yùn)動(dòng)性，產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、明膠酶，還可使硝酸鹽還原，糖利用實(shí)驗(yàn)表明菌株A21可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉，不能產(chǎn)氣，甲基紅試驗(yàn)為陰性，對(duì)照細(xì)菌手冊(cè)可知菌株A21類似于解淀粉芽孢桿菌。

表2 菌株A21生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of strain A21

2.4.3 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，再利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，菌株A21與Bacillus velezensisFZB42在同一分支上（如圖6），且相對(duì)置信度為90，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)與理化鑒定結(jié)果，確定菌株A21為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），將其命名為Bacillus velezensisDQA21。在《國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)》中曾一度認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌植物亞種與貝萊斯芽孢桿菌是同物異名，但近年來(lái)有研究人員[20]陸續(xù)利用全基因組比較對(duì)貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌植物亞種的分類地位進(jìn)行研究，結(jié)果認(rèn)定貝萊斯芽孢桿菌不是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，使其獲得在細(xì)菌命名法中的地位。

圖6 菌株A21系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果Fig.6 Results of phylogenetic tree construction of strain A21

2.5 Bacillus velezensis DQA21產(chǎn)ACT發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn)發(fā)酵條件優(yōu)化

由圖7a可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5.5時(shí)ACT的產(chǎn)量達(dá)到最大值25.06 g/L，隨著pH的增加產(chǎn)量快速下降。外界pH的變化會(huì)改變菌體細(xì)胞內(nèi)的pH值，從而影響細(xì)菌的代謝反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物量[20]。B.velezensisDQA21在pH 5～7范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，且在酸性條件下，ACT合成途徑中關(guān)鍵酶α-乙酰乳酸合成酶活力較強(qiáng)[22]，能積累大量丙酮酸，乳酸脫氫酶活力較低[23]，催化較少的丙酮酸形成乳酸，從而相對(duì)多的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為ACT。ZHANG[24]釆取了分段控制pH的策略，發(fā)酵前48 h，pH控制在6.5，此時(shí)乙偶姻還原酶、2,3-丁二醇脫氫酶催化反應(yīng)向生成ACT和2,3-丁二醇的方向進(jìn)行；郝飛[21]在發(fā)酵前期(0～16 h)控制pH 5.5，發(fā)酵中后期(16～72 h)控制pH 4.5，證明酸性條件下更有利于細(xì)胞合成ACT。

圖7 B.velezensis DQA21發(fā)酵產(chǎn)ACT的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Single-factor experimental results of ACT production by B.velezensis DQA21

由圖7b可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從31 ℃升至37 ℃時(shí)ACT產(chǎn)量隨之增加，37 ℃時(shí)ACT的產(chǎn)量達(dá)到最大值，可能是由于B.velezensisDQA21在37 ℃時(shí)最適合其生長(zhǎng)繁殖且其關(guān)鍵酶活性亦隨之提高。隨后ACT產(chǎn)量又隨溫度升高而降低，推測(cè)高溫下B.velezensisDQA21代謝酶受到抑制，同時(shí)ACT在高溫下會(huì)與氨反應(yīng)生成四甲基吡嗪,造成ACT濃度下降[25]。由圖7c可知，ACT產(chǎn)量隨菌株接種量的增大而增加，在5%時(shí)達(dá)到最大，隨后有所下降，這是由于接種量過(guò)大引起發(fā)酵初期比較高的細(xì)胞濃度，進(jìn)而底物大量消耗，造成產(chǎn)物合成階段營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足。由圖7d可知，ACT產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)ACT產(chǎn)量達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始下降。ACT的積累需要大量氧氣，低轉(zhuǎn)速條件下溶氧較低不利于菌體生長(zhǎng)繁殖，但轉(zhuǎn)速過(guò)高產(chǎn)生的剪切力會(huì)加速菌體衰亡，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物2,3-丁二醇、四甲基吡嗪會(huì)加速生成[26]。由圖7e可知，ACT產(chǎn)量隨裝液量增加而增大，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)ACT產(chǎn)量達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始下降，這是由于裝液量也與溶氧有關(guān)，裝液量過(guò)少時(shí)，溶氧雖然增加，但發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)不足，不利于ACT積累。

2.5.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)B.velezensisDQA21的ACT產(chǎn)量影響的大小。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3，由極差分析可知，各因素對(duì)ACT產(chǎn)量的影響大小依次為pH＞溫度＞裝液量＞接種量＞轉(zhuǎn)速。選取對(duì)ACT產(chǎn)量影響前3的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，其余各因素選取最優(yōu)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)速210 r/min，接種量5%。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，pH和溫度p＜0.01，裝液量p＜0.05，接種量和轉(zhuǎn)速p＞0.05，說(shuō)明pH和溫度對(duì)ACT產(chǎn)量具有極顯著影響，裝液量對(duì)ACT產(chǎn)量具有顯著性影響，接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)ACT產(chǎn)量無(wú)顯著性影響。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal test

2.5.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)pH、溫度、裝液量做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)多元二次回歸擬合后，建立了ACT發(fā)酵條件優(yōu)化模型，回歸方程為：Y=25.42-0.72A+0.40B-0.38C-0.33AB+0.23AC+0.17BC-5.57A2-2.07B2-2.02C2。

由回歸模型方差分析（表6）可知，模型p＜0.01，達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常吻合。失擬項(xiàng)p為0.32＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，證明模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型中一次項(xiàng)A、B、C對(duì)ACT產(chǎn)量的影響極顯著，一次項(xiàng)影響因子的主次順序?yàn)閜H＞溫度＞裝液量，這與正交試驗(yàn)的結(jié)果吻合。二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)ACT產(chǎn)量的影響極顯著。交互項(xiàng)AB對(duì)ACT產(chǎn)量的影響極顯著，AC對(duì)ACT產(chǎn)量影響顯著，BC對(duì)ACT產(chǎn)量影響不顯著。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test

表6 回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance (ANOVA) for response surface model

2.5.3.2 各因子交互作用對(duì)ACT產(chǎn)量影響的分析

響應(yīng)面圖可以直觀的反映出試驗(yàn)因素對(duì)ACT產(chǎn)量的影響，響應(yīng)面坡度越陡峭，說(shuō)明響應(yīng)面值對(duì)操作條件的改變?cè)矫舾?。溫度和pH（圖8a）、裝液量和pH（8b）交互作用的響應(yīng)曲面坡度均較為陡峭且等高線密集，呈橢圓形，表明交互作用顯著；裝液量和溫度（圖8c）交互作用的響應(yīng)曲面坡度均較為平緩，等高線稀疏，接近圓形，表明交互作用不顯著，該結(jié)果與表6方差分析結(jié)果一致。

2.5.3.3 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件ACT產(chǎn)量及驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)回歸方程模型的分析，B.velezensisDQA21產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件為：pH 5.46，溫度37.3 ℃，裝液量49.2 mL，此時(shí)ACT產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為25.45 g/L。在此條件下，重復(fù)5次搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到ACT平均產(chǎn)量為25.60±0.33 g/L，該結(jié)果與預(yù)測(cè)值十分接近，證明試驗(yàn)得到的模型可以較好的預(yù)測(cè)B.velezensisDQA21發(fā)酵后ACT產(chǎn)量。

圖7 響應(yīng)面分析因素間交互作用對(duì)ACT產(chǎn)量的影響Fig.7 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on ACT yield

3 討論

3.1 本研究從濃香型大曲中分離出30株芽孢桿菌，通過(guò)肌酸比色法快速判斷出其中20株菌株可產(chǎn)ACT，有5株產(chǎn)ACT能力較強(qiáng)，將這5株菌搖瓶發(fā)酵后測(cè)吸光值，利用ACT標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ACT產(chǎn)量，得到一株高產(chǎn)ACT的菌株A21。經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定，A21為一株貝萊斯芽孢桿菌，其pH耐受范圍為3.5～9、乙醇最大耐受值為5%。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗(yàn)，由極差分析可知，各因素對(duì)ACT產(chǎn)量的影響大小依次為pH＞溫度＞裝液量＞接種量＞轉(zhuǎn)速。對(duì)前3因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，由方差分析可知：pH、溫度、裝液量對(duì)ACT產(chǎn)量的影響極顯著。B.velezensisDQA21產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件為：pH 5.46，溫度37.3 ℃，裝液量49.2 mL，轉(zhuǎn)速210 r/min，接種量5%，此時(shí)ACT產(chǎn)量為25.60 g/L，比優(yōu)化前菌株產(chǎn)率18.37 g/L提高了39.13%。

3.2 趙洪源[13]利用氣相色譜法從涼州熏醋中篩選出一株高產(chǎn)ACT的醋酸桿菌，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度31.31 ℃、接種量8.27%、pH 6.55、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min，最適條件下ACT達(dá)到19.04 g/L，比原始發(fā)酵產(chǎn)量高35.80%；郝飛[23]通過(guò)兩階段控制pH：發(fā)酵前期（0～16 h），控制pH 5.5，發(fā)酵中后期（16～72 h），控制pH 4.5，使菌株合成ACT的能力得到進(jìn)一步提高，ACT的產(chǎn)量為32.70 g/L。本研究所得貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵條件與他們有明顯差異，證明不同來(lái)源的菌株發(fā)酵水平不同。劉延波[27]、王志山[28]從大曲中分離篩選出的貝萊斯芽孢桿菌具有高產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的特征；楊斌[29]從大曲中獲得一株具有高發(fā)酵力的貝萊斯芽孢桿菌，但都未對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的其余特性進(jìn)一步探究?，F(xiàn)有產(chǎn)ACT芽孢桿菌的研究多為枯草芽孢桿菌[30]、解淀粉芽孢桿菌[31]，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)ACT的報(bào)道較少，且多應(yīng)用于生物防治[32]，未見(jiàn)對(duì)大曲中高產(chǎn)ACT貝萊斯芽孢桿菌菌株的報(bào)道。

3.3 由于B.velezensisDQA21來(lái)源于大曲，對(duì)溫度有較大的耐受性，且在耐酸、耐乙醇等方面表現(xiàn)出較好的特性，非常利于后期通過(guò)代謝工程的手段，使其ACT產(chǎn)量大幅提升，為ACT微生物合成的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。B.velezensisDQA21可作為強(qiáng)化曲[33]投入發(fā)酵，也可制成窖泥養(yǎng)護(hù)液，使其定植于窖泥中，改善窖泥風(fēng)味，對(duì)提高濃香型大曲酒的風(fēng)味具有潛在價(jià)值，同時(shí)ACT作為健康功能因子四甲基吡嗪的前體物質(zhì)，也表明該功能菌株在健康營(yíng)養(yǎng)白酒生產(chǎn)中有非常重要的應(yīng)用前景[34]。本研究主要采用搖瓶發(fā)酵的方法，很多因素（如pH、溶氧、補(bǔ)糖等）難以在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行有效控制，不能充分發(fā)掘該菌發(fā)酵生產(chǎn)ACT的潛力，對(duì)于該菌廉價(jià)原料的尋找、ACT發(fā)酵規(guī)模的放大及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，也待進(jìn)一步研究。