基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討北沙參的抗炎機(jī)制

楊曉君，何洋,，沈秦可，周靜,，韓勝?gòu)?qiáng),，高繁，胡衛(wèi)成,，張跡

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.淮陰師范學(xué)院江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇淮安 223300)

炎癥是機(jī)體在各種致炎因子作用下，具有血管系統(tǒng)的組織對(duì)損傷因子所產(chǎn)生的，由單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞等吞噬細(xì)胞參與的復(fù)雜的防御反應(yīng)[1,2]。適度的炎癥有利于激活免疫系統(tǒng)清除病原體，同時(shí)促進(jìn)組織愈合，比如吞噬搬運(yùn)壞死組織，消除致病因子等。如果細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生過(guò)量，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，將導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥損傷，從而增加多種疾病的發(fā)病率和死亡率[3,4]。引起炎癥的因素很多，主要有細(xì)菌、病毒、支原體等病原微生物感染，此外還包括物理、化學(xué)、機(jī)械性刺激等[5]。細(xì)菌內(nèi)毒素性致病是一個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)十分復(fù)雜的病理過(guò)程，致病作用非常廣泛。內(nèi)毒素休克是臨床常見(jiàn)的危重病癥，常并發(fā)于感染、創(chuàng)傷、燒傷、放射損傷及失血性休克等，死亡率高達(dá)30%～60%[6]。

北沙參（Radix Glehniae）是傘形目傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralisFr.Schmidt exMiq.）的干燥根，為藥食兩用植物，具有滋陰清肺，祛痰止咳，生津養(yǎng)胃的功效，中醫(yī)臨床常用滋陰藥，用于治療肺燥干咳、熱病傷津、口渴等癥狀[7]。咳與痰均與炎癥密切相關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究表明，北沙參具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗炎、抗氧化等多方面活性[8]。北沙參的化學(xué)成分復(fù)雜，主要為香豆素類、木脂素類、苯丙素類、黃酮類、揮發(fā)油以及多糖等[9-11]。近年來(lái)，針對(duì)北沙參抗炎的研究不斷深入，但利用大數(shù)據(jù)系統(tǒng)深度挖掘和揭示北沙參抗炎作用機(jī)制的研究甚少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)、疾病網(wǎng)絡(luò)，可以將植物多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜藥理學(xué)作用機(jī)制轉(zhuǎn)化成直觀的圖像模型。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所具有的整體性、系統(tǒng)性及強(qiáng)調(diào)疾病發(fā)展的長(zhǎng)期性與復(fù)雜性，注重藥物、靶點(diǎn)、疾病三者之間互相協(xié)同、互相作用的特點(diǎn)。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法對(duì)北沙參成分進(jìn)行研究，分析其抗炎活性作用的主要通路，為科學(xué)研究活性成分、開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化功能性食品提供參考依據(jù)。

表1 本文所用數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址Table 1 Database URL used in this article

1 資料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究以借助網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)為主，本文所用數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 北沙參中目標(biāo)化合物篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索北沙參所含有的化學(xué)成分，再以化合物的藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)中口服藥物利用度（OB）≥30，類藥性（DL）≥0.18為限制條件，篩選出北沙參中主要的有效活性成分。將活性成分輸入PubChem搜索平臺(tái)，檢索并分析其對(duì)應(yīng)信息。

1.2.2 北沙參活性成分作用靶點(diǎn)收集

通過(guò)TCMSP內(nèi)置的成分信息，檢索獲得北沙參活性成分對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)。將每種成分對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)以表格形式保存至EXCEL中，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一定的處理，讓數(shù)據(jù)更有條理性，以便下一步的操作。

1.2.3 北沙參活性成分作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因收集

利用UniProt知識(shí)庫(kù)，搜索獲得北沙參活性成分的蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因，選擇分類為Human/Homo（人類）的基因，保存至相應(yīng)蛋白靶點(diǎn)之后。若有部分搜索不到或數(shù)據(jù)過(guò)于繁冗的成分，則可在PubChem平臺(tái)搜索該成分對(duì)應(yīng)的SMILES，將對(duì)應(yīng)SMILES復(fù)制至Similarity ensemble approach（SEA），以獲得該蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因。

1.2.4 人體抗炎相關(guān)基因檢索

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（一個(gè)可搜索的包括基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)等綜合數(shù)據(jù)庫(kù)）搜索關(guān)鍵詞抗炎（Anti-inflammatory）。下載搜索結(jié)果并保存為EXCEL格式，即完成人體所有的抗炎相關(guān)基因數(shù)據(jù)收集。

1.2.5 北沙參抗炎作用的基因靶點(diǎn)篩選

將北沙參活性成分作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因集復(fù)制粘貼至新的EXCEL中，剔除重復(fù)項(xiàng)。然后通過(guò)查重公式將處理后的靶點(diǎn)基因集與人體抗炎相關(guān)基因集進(jìn)行對(duì)比，篩選出北沙參抗炎作用的基因靶點(diǎn)。最后通過(guò)活性成分-基因靶點(diǎn)的對(duì)比，列出基因靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分。

1.2.6 北沙參抗炎作用對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)關(guān)系分析

通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)（一個(gè)搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)），選擇 “ Multiple Proteins ” 選項(xiàng)，輸入北沙參抗炎作用的基因靶點(diǎn)， “ Organism ” 選項(xiàng)選擇 “Homo Sapiens” ，獲得基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系圖。如果一個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)之間的連線越多，就說(shuō)明這個(gè)靶點(diǎn)越重要，是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。保存String數(shù)據(jù)庫(kù)中的關(guān)系圖。將獲得的靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)成分導(dǎo)入Cytoscape version 3.7.0專業(yè)繪圖軟件，繪制活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。

1.2.7 北沙參抗炎作用靶點(diǎn)基因GO和KEGG通路富集分析

借助Omicshare云平臺(tái) “ 動(dòng)態(tài)GO富集分析 ” 和 “ 動(dòng)態(tài)KEGG富集分析 ” 在線工具對(duì)北沙參抗炎作用對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因集進(jìn)行GO和KEGG富集分析。將靶點(diǎn)基因集分別導(dǎo)入 “ 動(dòng)態(tài)GO富集分析 ” 和 “ 動(dòng)態(tài)KEGG富集分析 ” 在線工具進(jìn)行富集分析，并設(shè)置Pvalue＜0.01，繪制GO和KEGG富集數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖。選取前20條通路繪制KEGG通路富集顯著性氣泡圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 北沙參中含有的目標(biāo)化合物

依據(jù)北沙參中目標(biāo)化合物的篩選條件，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）中篩選到8種有效化合物，具體信息見(jiàn)表2。其中槲皮素和異歐前胡素具有較高的口服利用度，β-谷甾醇和豆甾醇具有較高的類藥性。

表2 北沙參中含有的活性藥物成分Table 2 Active pharmaceutical ingredients in Radix glehniae

表3 北沙參活性成分對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)Table 3 Anti-inflammatory targets corresponding to active components of Radix glehniae

2.2 北沙參抗炎靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得274個(gè)北沙參活性成分作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)后，將其與人體抗炎相關(guān)基因集進(jìn)行交叉比對(duì)，獲得交叉重復(fù)靶點(diǎn)共92個(gè)（表3）。如表3所示，其中槲皮素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有50個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的18.25%；β-谷甾醇對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有28個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的10.22%；豆甾醇對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有22個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的8.03%；別異歐前胡素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有7個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的2.55%；歐前胡素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有6個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的2.19%；異歐前胡素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有1個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的0.36%；佛手柑素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有5個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的1.83%；異珊瑚菜素對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)有10個(gè)，占總靶點(diǎn)數(shù)量的3.65%。

2.3 北沙參活性成分-抗炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

沙參富含多種具有藥理活性的化學(xué)成分，是其發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。于亮[12]等人歸納發(fā)現(xiàn)北沙參抗炎活性突出。運(yùn)用Cytoscape version 3.7.0軟件將北沙參8個(gè)化合物和92個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建北沙參抗炎作用中活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖1）?；诨钚猿煞?作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，可以進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯銬egree值越大的化合物，在生理生化作用中越重要，即越可能是北沙參抗炎作用的主要作用成分。如圖1所示，其中槲皮素的Degree值遠(yuǎn)超其他7種活性化合物?？寡资情纹に氐暮诵乃幚碜饔弥籟13]，槲皮素可以通過(guò)調(diào)控IL-6、IL-10、IKK、STAT3等炎癥因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用[14,15]，可以通過(guò)PI3K/AKT/NF-κB等信號(hào)通路[16]以及AMPK/Sirt1通路[17]發(fā)揮抗炎作用。β-谷甾醇[18]和豆甾醇[19]是常見(jiàn)的植物甾醇，具有優(yōu)良的抗炎、抗氧化等藥理活性。馮思敏等[20]研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇和β-谷甾醇可抑制炎癥因子和相關(guān)酶的過(guò)表達(dá)，對(duì)小鼠結(jié)腸炎均有顯著的治療作用。歐前胡素、異歐前胡素、別異歐前胡素、異珊瑚菜素、佛手柑素等活性物質(zhì)均為北沙參中富含的香豆素類化合物[12]，香豆素類化合物是一大類重要的天然化合物，具有顯著的抗炎、抗菌等多方面藥理活性[21,22]。基于此，我們預(yù)測(cè)北沙參可以通過(guò)這8種活性物質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的抗炎靶點(diǎn)起到抗炎作用。

圖1 北沙參抗炎作用中活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of active ingredient-target network in anti-inflammatory effect of Radix glehniae

2.4 北沙參抗炎靶點(diǎn)蛋白間的相互作用（PPI）

為進(jìn)一步研究北沙參通過(guò)相應(yīng)靶點(diǎn)抗炎的作用機(jī)制，將北沙參抗炎靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其蛋白間的相互作用關(guān)系（PPI）。如圖2所示，北沙參92個(gè)抗炎靶點(diǎn)蛋白之間具有復(fù)雜的相互作用關(guān)系，其中絕大多數(shù)靶點(diǎn)蛋白之間皆有一至多條互作關(guān)系。同一蛋白上的連線越多，則這一靶點(diǎn)蛋白等級(jí)越高。靶點(diǎn)蛋白之間的連線越多，則說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白之間的結(jié)合度越高。將String關(guān)系圖簡(jiǎn)化之后，更能直觀的體現(xiàn)這種關(guān)系，等級(jí)越高的靶點(diǎn)蛋白圖示顏色越深。結(jié)合度較高的蛋白有：JUN、CASP3、EGFR、AKT1、HSP90AA1、TGFB1、PGR、MET、PLAU、PIM1、PIK3R1等共11個(gè)，推測(cè)這11個(gè)蛋白是北沙參活性成分抗炎作用的主要靶點(diǎn)蛋白，在抗炎作用中起重要作用。

2.5 北沙參抗炎靶點(diǎn)GO功能分析

借助Omicshare云平臺(tái)在線工具對(duì)北沙參抗炎靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集，獲得了北沙參抗炎靶點(diǎn)的GO功能注釋。如圖3所示，北沙參抗炎靶點(diǎn)被功能注釋到生物過(guò)程GO-BP（Biological Process），分子功能GO-MF（Molecular Function）和細(xì)胞組成GO-CC（Cellular Component）等三個(gè)方面。其中在GO-BP中，北沙參抗炎靶點(diǎn)主要被富集注釋于細(xì)胞過(guò)程（cellular process），應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus），生物調(diào)控（biological regulation），生物過(guò)程調(diào)控（regulation of biological process），代謝過(guò)程（metabolic process），定位（localization），信號(hào)傳導(dǎo)（signaling），生物過(guò)程正向調(diào)控（positive regulation of biological process）等26個(gè)生物過(guò)程；在GO-MF中，北沙參抗炎靶點(diǎn)基因主要富集在結(jié)合（binding），催化（catalytic activity），分子轉(zhuǎn)導(dǎo)（molecular transducer activity），分子功能調(diào)控（molecular function regulator），轉(zhuǎn)運(yùn)（transporter activity），轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（transcription regulator activity），分子操縱功能（hijacked molecular function），抗氧化（antioxidant activity）和結(jié)構(gòu)分子（structural molecule activity）等9個(gè)分子功能。GO-CC的富集注釋結(jié)果包括細(xì)胞組分（cell part），細(xì)胞（cell），細(xì)胞器（organelle），細(xì)胞膜（membrane），細(xì)胞器組分（organelle part），細(xì)胞膜組分（membrane part），膜封閉腔（membraneenclosed lumen），蛋白復(fù)合物（protein-containing complex），胞外區(qū)（extracellular region），胞外區(qū)組分（extracellular region part），神經(jīng)突觸（synapse），神經(jīng)突觸組分（synapse part），細(xì)胞連接（cell junction），超分子復(fù)合物（supramolecular complex）等。

圖2 北沙參抗炎靶點(diǎn)蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）Fig.2 Protein-protein interaction network diagram of Radix glehniae anti-inflammatory target (PPI)

圖3 北沙參抗炎靶點(diǎn)GO功能富集圖Fig.3 The enrichment map of GO function of anti-inflammatory target of Radix glehniae

圖4 北沙參抗炎靶點(diǎn)基因KEGG通路富集Fig.4 Enrichment of the anti-inflammatory target gene KEGG pathway of Radix glehniae

2.6 KEGG通路富集分析

利用Omicshare在線云平臺(tái)動(dòng)態(tài)KEGG富集分析工具對(duì)北沙參抗炎靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。如圖4a所示，北沙參抗炎靶點(diǎn)基因富集于人類疾?。℉uman Diseases），生物體系統(tǒng)（Organismal Systems），新陳代謝（Metabolism），環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing），細(xì)胞過(guò)程（Cellular Processes），遺傳信息處理（Genetic Information Processing）等6大類信號(hào)通路。選取KEGG富集顯著性統(tǒng)計(jì)前20條通路繪制氣泡圖（圖4b）。KEGG通路富集分析顯示北沙參抗炎靶點(diǎn)涉及多條與炎癥密切相關(guān)的信號(hào)通路，如雌激素信號(hào)通路，IL-17信號(hào)通路，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，AGE-RAGE信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路等，推測(cè)北沙參主要通過(guò)這些途徑起到抗炎作用[23-25]。

3 結(jié)論

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)北沙參活性成分及其對(duì)應(yīng)抗炎靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和分析，構(gòu)建北沙參抗炎的 “ 成分-靶點(diǎn)-通路 ” 作用機(jī)制。結(jié)果表明，北沙參主要是以槲皮素等8種活性成分為物質(zhì)基礎(chǔ)，以JUN、

CASP3、EGFR、AKT1、HSP90AA1、TGFB1、PGR、MET、PLAU、PIM1、PIK3R1等11個(gè)蛋白作為主要作用靶點(diǎn)，經(jīng)由雌激素信號(hào)通路，IL-17信號(hào)通路，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，AGE-RAGE信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路等抗炎相關(guān)通路起到抗炎作用。本文預(yù)測(cè)的北沙參這一 “ 多成分-多靶點(diǎn)-多通路 ” 的作用機(jī)制，可為進(jìn)一步深入開(kāi)展北沙參抗炎作用機(jī)制研究提供新的路徑和方向。