靈芝多糖對阿霉素所致心肌損傷的作用及機制研究*

徐繁，李瀟，肖旭，姜海軍，李青山，張圣林，張立廣

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.腫瘤科，2.放射科，3.臨床藥學(xué)部，4.血管疝外科，河北 承德067000）

阿霉素（又稱多柔比星）是一線抗腫瘤化療藥物，但對心臟有毒性作用，限制其臨床應(yīng)用[1]。研究證實，多柔比星與心臟組織的高親和力可導(dǎo)致劑量依賴的不可逆轉(zhuǎn)的心肌損害和慢性心力衰竭[2]。右雷佐生是被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)唯一的臨床應(yīng)用的心臟保護劑，需要通過靜脈注射給藥，且該藥物尚未在國內(nèi)批準(zhǔn)上市。我國臨床中應(yīng)用右丙亞胺，輔酶Q10，維生素C、E等預(yù)防阿霉素所致心臟損傷，但效果欠佳。目前，還沒有公認有效的抗阿霉素心臟毒性的口服藥物，尋找一個方便有效的藥物對抗其心臟毒性具有臨床意義。

靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，具有抗氧化、抗癌等保健作用[3]。本研究觀察靈芝多糖對阿霉素誘導(dǎo)后大鼠血清及各組織中抗氧化指標(biāo)的影響，為探討其抗氧化作用提供依據(jù)。靈芝多糖還具有很強的抗炎作用[4]。阿霉素致心肌損傷的機制可能與促炎癥細胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）及白細胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）是常見的細胞因子，本研究擬通過動物實驗和體外實驗探討靈芝多糖對阿霉素所致心臟毒性的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

鹽酸阿霉素注射液、靈芝多糖（純度99%）、DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱苷肽（GSH）試劑盒、TNF-α、IL-6及IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購于北京康泰合元生物技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒均由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科提供。

1.2 動物分組及模型復(fù)制

75只雄性SD大鼠（體重220～250 g），由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK京2012-0001。將大鼠隨機分為對照組、靈芝多糖高劑量組、阿霉素組、靈芝多糖低劑量+阿霉素組及靈芝多糖高劑量+阿霉素組，每組15只。參考文獻[5]的方法復(fù)制模型：注射用水5 ml溶解阿霉素，加入0.9%生理鹽水，配置為1 ml生理鹽水含有阿霉素0.8 mg，避光低溫存放備用。阿霉素組、靈芝多糖低劑量+阿霉素組和靈芝多糖高劑量+阿霉素組從實驗第2天開始以2.5 mg/kg腹腔注射阿霉素，隔天1次，共6次；對照組和靈芝多糖高劑量組同時注射等劑量生理鹽水。對照組和阿霉素組從實驗第1天起以4 ml/d生理鹽水灌胃，連續(xù)16 d；靈芝多糖高劑量組和靈芝多糖高劑量+阿霉素組從實驗第1天起以100 mg/kg的靈芝多糖溶于4 ml生理鹽水中灌胃，連續(xù)16 d；靈芝多糖低劑量+阿霉素組從實驗第1天起以50 mg/kg的靈芝多糖溶于4 ml生理鹽水中灌胃，連續(xù)16 d。末次灌胃后10 d，處死大鼠，腹主動脈取血，檢測AST、LDH、CK水平。稱大鼠體重；解剖取心臟并測量重量，心臟重量指數(shù)=心臟重量/體重；將大鼠心臟置于4%多聚甲醛中固定48 h后脫水、透明、浸石蠟，包埋，HE染色，觀察心肌組織病理學(xué)變化。取心肌組織200 mg，在含50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1%Triton X-100和1%蛋白酶抑制劑的裂解液中勻漿。將勻漿物離心15 min，取上清液，按試劑盒按說明書測定SOD（TBA法）、CAT（鉬酸銨法）、GSH（比色法）活性。

1.3 大鼠H9C2心肌細胞培養(yǎng)及分組處理

將大鼠H9C2心肌細胞（由中國科學(xué)院細胞庫提供）接種于96孔板，每孔細胞量約為1×104個，隨機分為對照組（只加培養(yǎng)基）、靈芝多糖高劑量組（100 μg/ml）、阿霉素組（1 μmol）、靈芝多糖低劑量（50 μg/ml）+阿霉素組（1 μmol）、靈芝多糖高劑量（100 μg/ml）+阿霉素組（1 μmol）。靈芝多糖預(yù)處理8 h后再與阿霉素共培養(yǎng)24 h，反復(fù)漂洗，收集各組細胞，用CCK-8法在波長450 nm處測定光密度（OD）值。細胞存活率（%）=（給藥組OD值/對照組OD值）×100%。將收集的細胞離心，1 000 r/min，離心5 min，取離心后的細胞上清液，按試劑盒說明書測定SOD（TBA法）、CAT（鉬酸銨法）、GSH（比色法）活性。

1.4 TNF-α、IL-6及IL-10檢測

將心臟組織及大鼠H9C2心肌細胞按ELISA試劑盒說明書操作，加入終止液的5～30 min內(nèi)均在450 nm處檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-6、IL-10的質(zhì)量濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

對照組及靈芝多糖高劑量組大鼠在整個實驗過程中均表現(xiàn)正常，精神狀態(tài)佳，較活躍，體重增加，皮膚色澤紅潤，皮下脂肪增厚，飲食、飲水量正常，大小便無異常，對外界燈光、聲響等刺激能保持高度警惕。其余3組大鼠在給予阿霉素后出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，表現(xiàn)為精神差，飲食、飲水量減少，體重下降，嘔吐，毛發(fā)稀疏、脫落，喜蜷曲，活動少，對外界刺激反應(yīng)遲緩。嚴(yán)重程度：阿霉素組＞靈芝多糖低劑量+阿霉素組＞靈芝多糖高劑量+阿霉素組。最終阿霉素組3只大鼠死亡，靈芝多糖低劑量+阿霉素組1只大鼠死亡。

2.2 阿霉素對大鼠心功能的影響

5組大鼠心臟重量指數(shù)及心肌酶各項指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：靈芝多糖高劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；阿霉素組與對照組比較，心肌酶各項指標(biāo)均上升（P＜0.05），心臟重量指數(shù)降低（P＜0.05）；靈芝多糖低劑量+阿霉素組、靈芝多糖高劑量+阿霉素組與阿霉素組比較，心肌酶各項指標(biāo)均下降（P＜0.05），心臟重量指數(shù)增加（P＜0.05）。見表1。

表1 5組大鼠心臟重量指數(shù)及心肌酶各指標(biāo)比較（xˉ±s）

2.3 靈芝多糖對阿霉素誘導(dǎo)后大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

5組大鼠心肌組織的免疫組織化學(xué)HE染色結(jié)果見圖1。對照組及靈芝多糖高劑量組：心肌細胞無變性壞死，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見炎癥細胞浸潤，組織學(xué)正常。阿霉素組：心肌細胞內(nèi)大量空泡變性，心肌細胞間隙明顯增寬，伴大量炎癥細胞浸潤，提示模型復(fù)制成功。靈芝多糖低劑量+阿霉素組：部分心肌細胞內(nèi)可見空泡變性及炎癥細胞浸潤。靈芝多糖高劑量+阿霉素組：心肌細胞內(nèi)少量空泡變性，伴有少量炎癥細胞浸潤。

圖1 5組大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)（HE染色×400）

2.4 靈芝多糖對阿霉素誘導(dǎo)后H9C2心肌細胞存活率的影響

對照組、靈芝多糖高劑量組、阿霉素組、靈芝多糖低劑量+阿霉素組和靈芝多糖高劑量+阿霉素組H9C2心肌細胞的存活率分別為（100.169±4.071）%、（102.965±5.277）%、（44.610±6.238）%、（51.209±7.791）%及（78.241±7.213）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=278.411，P=0.000）；進一步兩兩比較結(jié)果：靈芝多糖高劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；阿霉素組較對照組降低（P＜0.05）；靈芝多糖低劑量+阿霉素組較阿霉素組升高（P＜0.05）；靈芝多糖高劑量+阿霉素組較阿霉素組升高（P＜0.05）。

2.5 靈芝多糖對阿霉素誘導(dǎo)后心肌組織及心肌細胞中抗氧化酶水平的影響

5組大鼠心肌組織及心肌細胞SOD、GSH、CAT水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較結(jié)果：靈芝多糖高劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；阿霉素組SOD、GSH、CAT水平較對照組降低（P＜0.05）；靈芝多糖低劑量+阿霉素組和靈芝多糖高劑量+阿霉素組的SOD、GSH、CAT水平較阿霉素組升高，且呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。見表2、3。

表2 5組大鼠心肌組織中抗氧化酶水平的比較（xˉ±s）

2.6 靈芝多糖對阿霉素誘導(dǎo)后心肌組織及心肌細胞中炎癥因子水平的影響

5組大鼠心肌組織及心肌細胞中的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較結(jié)果：靈芝多糖高劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；阿霉素組與對照組比較，TNF-α、IL-6升高（P＜0.05）、IL-10下降（P＜0.05）；靈芝多糖低劑量+阿霉素組、靈芝多糖高劑量+阿霉素組與阿霉素組比較，TNF-α、IL-6下降（P＜0.05）、IL-10升高（P＜0.05）。見表4、5。

表3 各組大鼠H9C2心肌細胞中抗氧化酶水平的比較（±s）

表3 各組大鼠H9C2心肌細胞中抗氧化酶水平的比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與阿霉素組比較，P＜0.05。

組別對照組靈芝多糖高劑量組阿霉素組靈芝多糖低劑量+阿霉素組靈芝多糖高劑量+阿霉素組F值P值CAT/（u/mg protein）152.519±9.207 154.545±7.616 121.358±13.648①132.951±10.221②138.789±14.051②22.792 0.000 n 15 15 12 14 15 SOD/（u/mg protein）34.472±3.941 36.051±5.113 19.671±4.412①24.991±6.075②31.031±7.571②22.521 0.000 GSH/（u/mg protein）196.368±11.75 202.453±16.772 128.553±9.312①138.754±11.512②150.431±22.161②76.376 0.000

表4 5組大鼠心肌組織中炎癥因子水平的比較（pg/ml，±s）

表4 5組大鼠心肌組織中炎癥因子水平的比較（pg/ml，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與阿霉素組比較，P＜0.05。

組別對照組靈芝多糖高劑量組阿霉素組靈芝多糖低劑量+阿霉素組靈芝多糖高劑量+阿霉素組F值P值IL-10 253.433±23.999 264.843±17.797 128.845±12.082①146.143±15.42②194.526±18.458②174.191 0.000 n 15 15 12 14 15 TNF-α 117.975±12.831 110.895±12.912 441.519±26.594①401.968±33.584②234.761±35.975②520.864 0.000 IL-6 151.537±6.852 146.738±7.441 508.458±20.208①485.651±17.495②277.619±17.483②2054.310 0.000

表5 5組大鼠H9C2心肌細胞中炎癥因子水平的比較（pg/ml，±s）

表5 5組大鼠H9C2心肌細胞中炎癥因子水平的比較（pg/ml，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與阿霉素組比較，P＜0.05。

組別對照組靈芝多糖高劑量組阿霉素組靈芝多糖低劑量+阿霉素組靈芝多糖高劑量+阿霉素組F值P值IL-10 122.109±12.255 125.829±13.441 66.672±14.813①79.051±12.713②83.697±13.034②61.000 0.000 n 15 15 12 14 15 TNF-α 67.501±15.605 64.556±17.364 203.928±11.412①186.460±14.505②79.469±18.216②291.587 0.000 IL-6 79.472±13.987 72.759±11.877 316.243±51.03①255.939±38.875②153.959±19.734②180.161 0.000

3 討論

臨床常用的蒽環(huán)類藥物是一種抗腫瘤抗生素，代表藥物為表柔比星、多柔比星、吡柔比星，該類藥物可抑制RNA和DNA的合成，廣泛應(yīng)用于實體瘤及血液系統(tǒng)疾病的治療，主要毒副反應(yīng)為骨髓抑制、脫發(fā)、心臟毒性，如果為了減少心臟毒性而減少阿霉素（多柔比星）的用量，將嚴(yán)重降低對癌癥的治療效果[6]。

目前血清心肌酶指標(biāo)活力的測定已廣泛用于診斷和研究心肌損害性疾病，其中AST、LDH、CK較為特異性地反映心肌細胞的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可導(dǎo)致大鼠AST、LDH、CK水平升高、心肌組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變，但經(jīng)過靈芝多糖處理后的大鼠心肌酶指標(biāo)水平降低，證實靈芝多糖具有保護心肌作用。

GSH可以把體內(nèi)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變成無害物質(zhì)排出體外，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑[7]；SOD屬于一種源于生命體的重要活性成分，可消除有害物質(zhì)，維持良好的新陳代謝狀態(tài)，其水平降低意味著機體抗氧化損傷能力的減弱[8]，是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。CAT可以清除體內(nèi)的過氧化氫，是體內(nèi)抗氧化的關(guān)鍵酶之一[9]。本研究的體內(nèi)、體外實驗均證實經(jīng)阿霉素處理后的心肌組織及大鼠H9C2心肌細胞的SOD、GSH及CAT活性受抑制，提示阿霉素損傷心肌的機制可能為氧化應(yīng)激，而經(jīng)靈芝多糖預(yù)處理后SOD、GSH及CAT活性均有一定的提高，說明靈芝多糖可以清除體內(nèi)部分氧自由基，起到抗氧化作用。

TNF-α、IL-6及IL-10是心肌損傷預(yù)后的主要指標(biāo)[10]。TNF-α可引起組織損傷并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[11]，在凋亡途徑發(fā)揮重要作用。IL-6主要參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和自身免疫病[12]。IL-10通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用，可通過抑制NF-κB的活化，抑制炎癥細胞因子及趨化因子的表達；另外IL-10可抑制多種淋巴細胞的活化，從而減少TNF-α、IL-6的生成[13]。本研究中，阿霉素處理后的大鼠心肌組織及大鼠H9C2心肌細胞TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度升高，提示阿霉素可誘導(dǎo)促炎癥細胞因子的產(chǎn)生；靈芝多糖預(yù)處理后的大鼠心肌組織及大鼠H9C2心肌細胞中TNF-α、IL-6表達下降、IL-10升高。本研究的體內(nèi)與體外實驗得到相同的結(jié)果，靈芝多糖能夠抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的生成，增加抗炎癥因子產(chǎn)生，起保護心肌的作用。

本研究通過體內(nèi)及體外實驗證實靈芝多糖可清除體內(nèi)氧自由基及減少促炎因子產(chǎn)生，從而對抗阿霉素對心肌的損傷，為臨床研究提供理論依據(jù)。