響應(yīng)面優(yōu)化釀酒酵母與窖泥酯化細(xì)菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)丁酸乙酯和己酸乙酯

郭 燕，鄧 杰,，任志強(qiáng)，黃治國,，衛(wèi)春會,,*，黃明才

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 643000；2.水富古渡酒業(yè)有限公司專家工作站，云南 水富 657800）

乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯是濃香型白酒的主體香微量成分，約占總酯含量的90%[1]。其中，己酸乙酯對濃香型白酒的貢獻(xiàn)最大。己酸是合成己酸乙酯的前體物，因此通過提高濃香型白酒發(fā)酵過程中己酸產(chǎn)量來提升濃香型白酒的品質(zhì)成為了當(dāng)前研究熱點[2-4]。據(jù)報道，白酒釀造過程中酯類物質(zhì)主要由以下2 種途徑合成：一種是微生物在自身胞內(nèi)酶的作用下合成酯類物質(zhì)[5-7]；而作用最為廣泛的是另一種途徑，即酯類物質(zhì)通過微生物分泌的胞外酶將周圍環(huán)境中的有機(jī)酸和醇類物質(zhì)催化合成[8-11]。此外，酒體中酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)在自然條件下也能發(fā)生酯化作用，但速率及產(chǎn)量遠(yuǎn)不如上述2 種途徑[12-13]。

能將酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)進(jìn)行酯化的微生物統(tǒng)稱為酯化菌。目前，參與白酒發(fā)酵過程中的酵母菌、細(xì)菌和霉菌中均有酯化菌的相關(guān)報道，但主要集中在酒曲和酒醅環(huán)境中[14-16]。同時，對于這些具有產(chǎn)酯化酶或酯化能力菌株的研究均是在脫離發(fā)酵糟醅情況下開展，與生產(chǎn)實際差異較大[17]。而泥窖是我國濃香型白酒特有的發(fā)酵容器，且窖泥中微生物的代謝特征及其代謝產(chǎn)物對濃香型白酒質(zhì)量有重要影響[18-20]。此外，在窖池中，固態(tài)發(fā)酵結(jié)果的再現(xiàn)性比液態(tài)發(fā)酵好[21]。因此，本研究采用固態(tài)發(fā)酵法，以窖泥中分離出來的3 株酯化細(xì)菌與釀酒酵母為菌種，優(yōu)化其發(fā)酵生產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的工藝，以期為提高濃香型白酒質(zhì)量提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、廣西梭菌（C. guangxiense）、煎盤梭菌（C. sartagoforme）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由釀酒微生物技術(shù)與應(yīng)用四川省重點實驗室分別從窖泥和大曲中分離得到。

高粱、糠殼，馬鈴薯 市售；酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、葡萄糖、丁酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（分析純） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；MSE瓊脂培養(yǎng)基（mayeux，sandine and elliker agar，MSE）粉、L-半胱氨酸鹽酸鹽 北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶（1×104U/g）、糖化酶（1×105U/g）江蘇博立生物制品有限公司；乙酸正丁酯、丁酸乙酯、己酸乙酯（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；疊氮化鈉、檸檬酸鈉、明膠、蔗糖（分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

MSE培養(yǎng)基：酵母提取物5.00 g/L、葡萄糖5.00 g/L、疊氮化鈉75.00 mg/L、檸檬酸鈉1.00 g/L、胰蛋白胨10.00 g/L、明膠2.50 g/L、蔗糖100 g/L、pH 6.90、瓊脂粉15.00 g/L、MSE粉 0.50 g/L。

酯化菌種子培養(yǎng)基：MSE粉0.50 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g/L、乙酸鈉1.00 g/L、磷酸二氫鉀0.50 g/L、氯化鈉1.00 g/L、碳酸氫鈉0.30 g/L、硫酸鈉0.50 g/L、CaCl2·2H2O 0.15 g/L、MgCl2·6H2O 0.40 g/L、酵母浸粉1.00 g/L、蛋白胨1.50 g/L、葡萄糖3.00 g/L、丁酸鈉2.00 g/L，用5 mol/L NaOH溶液將酯化菌種子培養(yǎng)的pH值調(diào)到5.50。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200.00 g/L，葡萄糖20.00 g/L，自然pH值。

高粱發(fā)酵培養(yǎng)基：將高粱粉碎至4～6 瓣，配入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的糠殼混勻，加入少許水潤濕并蒸至有高粱香，冷卻后置于水浴鍋中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%α-淀粉酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%糖化酶，水分調(diào)節(jié)至培養(yǎng)基發(fā)酵前初始物量料質(zhì)量分?jǐn)?shù)的75%，酸度調(diào)至2.40 mmol/100 g。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；HT300A固相微萃取儀 意大利HTA公司；AW200SG厭氧工作站 金壇市科技分析儀器有限公司；CI54DS立式壓力蒸汽滅菌鍋 廈門儀器有限公司；50/30 μm二乙烯丙基/碳分子篩/聚二甲基烷氧基（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將拜氏梭菌、廣西梭菌和煎盤梭菌劃線接種于酯化菌種子固體培養(yǎng)基上，于34 ℃，厭氧培養(yǎng)5 d；將酵母菌劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)3 d。

1.3.2 種子液的制備

將活化后的拜氏梭菌、廣西梭菌和煎盤梭菌各挑取一環(huán)分別接于100 mL酯化菌液體種子培養(yǎng)基中，于34 ℃，厭氧條件下將活細(xì)胞分別培養(yǎng)至3.70×106、1.35×106、4.35×106CFU/mL，按體積比1∶1∶1進(jìn)行混合制得酯化菌種子液；將活化后的酵母菌挑取一環(huán)接入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，100 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為1.5。

1.3.3 協(xié)同發(fā)酵實驗

在厭氧條件下，按5%接種量將酵母菌種子液接于35 g滅菌后的高粱發(fā)酵培養(yǎng)基中，34 ℃培養(yǎng)2 d后，再接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%酯化菌種子液，于34 ℃發(fā)酵12 d后測定己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量。以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%無水乙醇代替質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%酵母菌種子液，發(fā)酵過程只添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%酵母菌種子液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%酯化菌種子液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%無水乙醇，以及空白培養(yǎng)基為對照組。

1.3.4 酯化菌種子液接種時間的確定

為保證酯化菌的厭氧發(fā)酵環(huán)境，高粱發(fā)酵培養(yǎng)基在釀酒酵母接種2 d后，每間隔6 h接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的酯化菌種子液，共設(shè)置6 個時間梯度為48、52、56、60、64、68 h，分別置于34 ℃厭氧環(huán)境中發(fā)酵12 d，以己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量為指標(biāo)，確定酯化菌種子液的最佳接種時間。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇酯化菌種子液的接種量分別為1.00%、3.00%、5.00%、7.00%、9.00%、11.00%；高粱發(fā)酵培養(yǎng)基的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為65.00%、70.00%、75.00%、80.00%、85.00%、90.00%；高粱發(fā)酵培養(yǎng)基的酸度分別為2.00、2.20、2.40、2.60、2.80、3.00 mmol/100 g；發(fā)酵溫度分別為24、28、32、36、40、44 ℃，在厭氧條件下發(fā)酵12 d，以己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量為指標(biāo)，確定各因素的最佳發(fā)酵條件。

1.3.5.2 優(yōu)化發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，運用Design Expert 8.0.6軟件對高粱發(fā)酵培養(yǎng)基的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度、發(fā)酵溫度、酯化菌種子液接種量進(jìn)行試驗設(shè)計，以己酸乙酯和丁酸乙酯的Y為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面試驗（表1），以確定3 株酯化菌和釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的最優(yōu)發(fā)酵條件。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.6 己酸乙酯和丁酸乙酯定性和定量分析

1.3.6.1 固相微萃取條件

稱取3.00 g發(fā)酵完成的樣品和50.00 μL質(zhì)量濃度為20.00 mg/100 mL的乙酸正丁酯裝入15 mL頂空瓶中，超聲振蕩10 min混勻后于55 ℃先平衡15 min，再萃取30 min，隨后進(jìn)行手動進(jìn)樣。

1.3.6.2 氣相色譜條件

毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX（60.00 mm×0.25 mm，0.25 μm）；不分流；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；程序升溫；45 ℃保持1 min，以6 ℃/min升溫至160 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min；載氣：99.999%氦氣，流速為1 mL/min。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

電子離子源；電子能量：70 eV；采集模式：全掃描，質(zhì)量掃描范圍20～550 u，溶劑延遲3 min；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃，接口溫度：230 ℃。

1.3.6.4 定性方法

將萃取完成后的進(jìn)樣針于230 ℃進(jìn)樣口中解吸5 min，通過所測得質(zhì)譜圖與NIST05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫（美國Agilent公司提供）比對，選擇匹配度大于或等于80%（最大值為100%）的物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖確認(rèn)結(jié)果的正確性。

1.3.6.5 定量方法

采用內(nèi)標(biāo)法。以20.00 mg/100 mL的乙酸正丁酯為標(biāo)準(zhǔn)物，根據(jù)式（1）可得出丁酸乙酯和己酸乙酯的產(chǎn)量。

式中：fm為質(zhì)量校正因子，其中fm（己酸乙酯）為1.18，fm（丁酸乙酯）為1.01；Ai為待測物峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)物峰面積；ms為標(biāo)準(zhǔn)物含量/（mg/100 g）；mi為待測物含量/（mg/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在響應(yīng)面分析中，將己酸乙酯和丁酸乙酯的檢測指標(biāo)采用Hassan方法歸一化為0～1之間的值[22]，計算公式按式（2）所示：

式中：di為每組實驗所測得的真實值；dmax為實驗組中的最高值；dmin為實驗組中的最低值?？紤]到己酸乙酯是濃香白酒中的主體香，而丁酸乙酯在濃香型白酒中的量少，但起輔助和烘托作用。因此，將己酸乙酯和丁酸乙酯生的權(quán)重分別設(shè)為0.8和0.2，根據(jù)式（3）計算包含己酸乙酯和丁酸乙酯的Y：

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方式對發(fā)酵結(jié)果的影響

由表2可知，高粱發(fā)酵培養(yǎng)基在質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同接種方式得到的發(fā)酵產(chǎn)物有所不同。只添加5.00%釀酒酵母和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.00%無水乙醇的高粱發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵完成后既沒有丁酸乙酯生成，也沒有己酸乙酯生成。只接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.00%酯化菌種子液的高粱發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)生了0.25 mg/100 g丁酸乙酯和0.58 mg/100 g己酸乙酯。在報道中，C. beijerinckii可代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇、丁醇和異丙醇[23]；C. sartagoforme可產(chǎn)生丁酸和少量酯類物質(zhì)[24]；C. guangxiense在無乙醇添加的情況下可產(chǎn)生己酸、丁酸及少量的己酸乙酯和丁酸乙酯[25]。結(jié)合空白對照組和乙醇發(fā)酵實驗，進(jìn)一步證實了3 株酯化細(xì)菌可通過自身或者協(xié)同作用產(chǎn)生己酸乙酯和丁酸乙酯。在組合接種方式中，釀酒酵母與酯化細(xì)菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯的能力顯著高于無水乙醇和酯化細(xì)菌之間的作用（P＜0.05），而在丁酸乙酯的合成上差異不顯著（P＞0.05）。與只接種酯化細(xì)菌相比，乙醇的添加可顯著促進(jìn)己酸乙酯和丁酸乙酯的合成（P＜0.05），并且添加釀酒酵母比直接添加無水乙醇效果更好（P＜0.05），這說明一定量的乙醇不但可以為酯類物質(zhì)的合成提供底物，還可能為梭菌合成己酸提供碳源[26]，使其進(jìn)一步合成己酸乙酯。同時，這也闡明了釀酒酵母除了為酯化細(xì)菌提供乙醇環(huán)境之外，還可能存在酶作用以促進(jìn)己酸乙酯和丁酸乙酯的合成[27]。

表2 釀酒酵母和3 株酯化菌協(xié)同發(fā)酵結(jié)果Table 2 Effect of single and mixed culture fermentation of S. cerevisiae and three strains of esterifying bacteria on the production of ethyl hexanoate and ethyl butyrate mg/100 g

2.2 酯化菌種子液的最佳接種時間

圖1 接種時間對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of inoculation time on the yields of ethyl hexanoate and ethyl butyrate

如圖1所示，隨著接種時間的延長，己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量均呈先增后降的變化趨勢。其中，在第56小時，己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量均達(dá)最高值，分別為3.86 mg/100 g和0.96 mg/100 g，顯著高于其他接種時間（P＜0.05），這可能是由于釀酒酵母在56 h左右生長達(dá)到穩(wěn)定，而此時培養(yǎng)基中的氧氣已被消耗殆盡，并且酵母菌厭氧發(fā)酵積累了一定量的乙醇，從而促進(jìn)了酯化菌與酵母菌合成己酸乙酯和丁酸乙酯的協(xié)同作用。而隨著接種時間的繼續(xù)延長，酵母菌的生長代謝不僅會持續(xù)消耗培養(yǎng)基中的底物，過量的乙醇和其他代謝物還可能會抑制酯化菌的生長以及與釀酒酵母的協(xié)同發(fā)酵作用[28]，使得己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量降低。因此，選擇56 h為酯化菌種子液的最佳接種時間。

2.3 協(xié)同發(fā)酵接種量對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響

接種量決定了菌種在發(fā)酵過程中的生長繁殖速率，并且直接影響發(fā)酵周期[29]。由圖2可知，隨著酯化菌種子液接種量的增加，己酸乙酯的產(chǎn)量呈先上升后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，且在接種量為5.00%時，己酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)最大，為3.35 mg/100 g，顯著高于其他接種量（P＜0.05）。當(dāng)酯化菌種子液的接種量大于5.00%時，己酸乙酯的產(chǎn)量差異不顯著（P＞0.05）。丁酸乙酯的產(chǎn)量則是隨著酯化菌種子液的增加呈先上升后下降的變化趨勢，且在接種量為5.00%時，丁酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)最大，為0.83 mg/100 g，顯著高于其他接種量（P＜0.05）。這說明當(dāng)酯化菌種子液接種量為5.00%時，酯化細(xì)菌活力旺盛，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠使己酸乙酯和丁酸乙酯的發(fā)酵體系發(fā)揮最大作用。因此，確定酯化菌種子液的最佳接種量為5.00%。

圖2 接種量對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculum quantity on the yields of ethyl caproate and ethyl butyrate

2.4 協(xié)同發(fā)酵溫度對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響

溫度通過改變蛋白質(zhì)、酶和核酸的結(jié)構(gòu)和活性來影響微生物的生長和體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)[30-31]。由圖3所示，隨著發(fā)酵溫度的升高，丁酸乙酯和己酸乙酯的產(chǎn)量均呈先升后降的變化趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，丁酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)最高，為1.02 mg/100 g，顯著高于其他發(fā)酵溫度（P＜0.05）。而當(dāng)溫度為32 ℃時，己酸乙酯產(chǎn)量達(dá)到最高，為3.56 mg/100 g，顯著高于其他發(fā)酵溫度（P＜0.05）。濃香型白酒糟醅的發(fā)酵溫度一般不高于35 ℃，而略微偏高的溫度對發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和產(chǎn)酯有積極作用[32]，這說明該結(jié)果符合實際生產(chǎn)的需求。由于己酸乙酯為濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)，且在32 ℃時丁酸乙酯和己酸乙酯的產(chǎn)量之和高于28 ℃時的產(chǎn)量。因此，選擇32 ℃為最佳為發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the yields of ethyl caproate and ethyl butyrate

2.5 協(xié)同發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響

在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，酒醅中的水主要來源于配料時“打量水”，且入窖池時的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般控制在56.00%左右[33]。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的生長與代謝會產(chǎn)生大量的游離水。因此，在發(fā)酵中期即酯化生香期，酒醅的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約在60.00%～90.00%之間，中下層在70.00%～90.00%之間[34]。由圖4所示，隨著水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，丁酸乙酯和己酸乙酯的產(chǎn)量均呈先上升后下降的變化趨勢，且當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.00%時，丁酸乙酯和己酸乙酯的產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為0.86 mg/100 g和3.91 mg/100 g，顯著高于其他水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的產(chǎn)量（P＜0.05）。因此，確定最佳水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%。

圖4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of moisture content on the yields of ethyl caproate and ethyl butyrate

2.6 協(xié)同發(fā)酵酸度對產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響

相較于pH值，酸度更能準(zhǔn)確地反映酒醅中的酸堿性[35]。在酒醅中，將100.00 g糟醅中的酸消耗1.00 mmol NaOH定義為1 度酸度[36]。在實際生產(chǎn)中，濃香型白酒酒醅的入池酸度大約在1.50～2.20 mmol/100 g，但隨著酒醅發(fā)酵的進(jìn)行，各種有機(jī)酸的不斷產(chǎn)生和積累，酒醅的酸度會發(fā)生變化[37]。如圖5所示，隨著酸度的升高，己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量均呈先升后降的變化趨勢。其中，在酸度為2.60 mmol/100 g時，丁酸乙酯和己酸乙酯產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為1.03 mg/100 g和3.91 mg/100 g，顯著高于其他酸度（P＜0.05）。這說明適當(dāng)增高酸度有助于釀酒酵母與酯化細(xì)菌之間的產(chǎn)酯作用，但酸度過高可能會抑制釀酒酵母或者酯化菌的生長，使其發(fā)酵能力減弱。因此，選擇發(fā)酵起始的最佳酸度值為2.60 mmol/100 g。

圖5 酸度對己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of acidity on the yields of ethyl caproate and ethyl butyrate

2.7 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.7.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行建模的響應(yīng)面分析法不僅可以從多因素中確定起主要作用的自變量，并確定各變量之間的相互作用，還能以允許的期望值選擇變量的最佳條件[38-40]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Box-Behnken試驗設(shè)計原理對溫度（A）、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、酸度（C）和接種量（D）設(shè)計4因素3水平共29 組試驗（表3）。其中，析因部分試驗24 次，中心點重復(fù)試驗5 次。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with response variables

2.7.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

根據(jù)表3的試驗結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6軟件對Y和各因素進(jìn)行多元回歸分析，同時擬得多元二次回歸方程為：Y=0.95+0.15B+0.10C-0.13D+0.11AB+0.19AC+0.16AD+0.03CD-0.34A2-0.17B2-0.32C2-0.24D2，其中A、B、C、D分別表示溫度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度、接種量。方程決定系數(shù)R2為0.981 7，說明該回歸方程的擬合度較好，可通過回歸方程對實際試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4可知，二次回歸模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平；決定系數(shù)R2為0.981 7，說明該模型能解釋98%響應(yīng)值的變化，表明預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果有著較好的一致性；模型的復(fù)合相關(guān)系數(shù)為0.963 4，表明試驗結(jié)果有96.34%受試驗因素的影響；變異失擬項P值不顯著（0.087 3＞0.05），說明試驗無失擬因素存在，回歸模型能充分反映實際情況。

方差分析中的顯著性檢驗可以判斷自變量對因變量的影響。由表4可知，B、C和D對Y的影響極顯著（P＜0.01），而A影響不顯著（P＞0.05）；模型中的交互項AC和AD對Y的影響極顯著（P＜0.01），AB影響顯著（P＜0.05），而BC、BD和CD影響不顯著（P＞0.05）；模型中的二次項A2、B2、C2和D2對Y的影響均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。由此可知，B、C、D對Y的影響均大于A，即水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種量和酸度對Y的影響均大于溫度。

2.7.3 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

為了直觀反映溫度（A）、水分（B）、酸度（C）和接種量（D）共4 個影響因素之間的交互作用對Y的影響，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制了各因素與響應(yīng)值之間的三維曲面圖和等高線分析圖，見圖6。曲面越陡峭、傾斜度越高說明各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響越大；等高線的疏密程度及呈現(xiàn)的形狀可以反映各因素之間的交互作用的顯著性[41-42]。圖6a1、a2、b1、b2、c1、c2相較于其他圖，等高線分布密集，且呈橢圓形，對應(yīng)的曲面較為陡峭，說明溫度分別與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度和接種量之間的交互作用明顯，且對響應(yīng)值的影響較為顯著，與表4中的數(shù)據(jù)有著較好的一致性。

圖6 溫度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度、接種量響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing the effect of interaction of temperature, moisture content, acidity and inoculum quantity

2.7.4 驗證實驗

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析得出，當(dāng)Y的期望值為1.00且己酸乙酯的量為最大時，釀酒酵母與3 株酯化菌協(xié)同發(fā)酵條件為溫度31.61 ℃、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)77.74%、酸度2.62 mmol/100 g、接種量4.59%，此時己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量分別為9.64 mg/100 g和1.85 mg/100 g。為了滿足實際操作的需求，將最佳發(fā)酵條件調(diào)整為溫度32 ℃、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.00%、酸度2.60 mmol/100 g、接種量4.60%。同時，為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，以4因素3水平試驗組中Y最高組的工藝條件作為優(yōu)化后的對照組，其發(fā)酵條件為溫度為32 ℃、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.00%、酸度為2.60 mmol/100 g、接種量為5.00%，此時的己酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量分別為9.60 mg/100 g和1.83 mg/100g，在相同條件下分別重復(fù)進(jìn)行5 次實驗，結(jié)果如圖7所示。

圖7 驗證實驗結(jié)果Fig.7 Yields of ethyl caproate and ethyl butyrate under unoptimized and optimized fermentation conditions

由圖7可知，在模型預(yù)測的工藝條件下，3 株酯化細(xì)菌與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯的量為9.55 mg/100 g，顯著高于對照組己酸乙酯的產(chǎn)量9.30 mg/100 g（P＜0.05）；而丁酸乙酯的產(chǎn)量為1.87 mg/100 g，與對照組丁酸乙酯的產(chǎn)量1.78 mg/100 g差異不顯著（P＞0.05）。優(yōu)化條件后的己酸乙酯產(chǎn)量達(dá)預(yù)期值的99.07%，丁酸乙酯產(chǎn)量達(dá)預(yù)期值的100%，預(yù)測值與實際值的擬合性較好，優(yōu)化工藝具有一定可行性。

3 結(jié) 論

本實驗通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化分析得出，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度和接種量對己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），而溫度影響不顯著（P＞0.05），但溫度與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度和接種量之間的交互作用影響顯著（P＜0.05）。釀酒酵母與3 株酯化細(xì)菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的最佳生產(chǎn)工藝為溫度32 ℃、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.00%、酸度2.60 mmol/100 g、接種量4.60%。在最佳條件下，己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量分別為9.55 mg/100 g和1.87 mg/100 g。相較于初始條件，響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件使己酸乙酯和丁酸乙酯的產(chǎn)量分別增加了1.68 倍和1.38 倍。

目前，基于不同種群間的相互作用和以高粱為基質(zhì)的純種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的方法鮮見報道，但這對功能微生物在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用有著重要意義。濃香型白酒的釀造不僅僅是一個復(fù)雜群落相互作用的過程，還與生產(chǎn)原料、環(huán)境等息息相關(guān)。解析白酒發(fā)酵過程中功能微生物的相互作用與風(fēng)味物質(zhì)生成之間的聯(lián)系一直成為業(yè)界難題。從純種微生物出發(fā)，采用固態(tài)發(fā)酵模型，由單一微生物的作用延伸至多種微生物的共同作用可能成為該研究的突破點。