在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉和雞蛋中5 種抗病毒類藥物殘留量

馬俊美，何亮娜，孫 磊，王 東，張雷雷，張 巖,*，康文藝

（1.河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050227；3.河南大學(xué) 國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開封 475004）

病毒感染是威脅人類及動(dòng)物生命健康的主要問題之一[1]，為解決流感問題，人們研發(fā)了多種抗病毒類藥物，如金剛烷胺[2]、金剛乙胺[3]、美金剛、奧司他韋和阿比多爾等。歷史上爆發(fā)的多次流感事件造成大量畜禽死亡[4]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，為降低畜禽發(fā)病率，不少養(yǎng)殖戶將人用抗病毒類藥物添加至畜禽飼料中[5]。金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋、阿比多爾等抗病毒藥物作為人類治療病毒性疾病的專用藥，移作獸用缺乏科學(xué)依據(jù)，且長(zhǎng)期使用會(huì)造成動(dòng)物中毒、藥物殘留、病毒抑制或變異[6-7]等，進(jìn)而影響人類的身體健康。2005年我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了560號(hào)公告，規(guī)定禁止將金剛烷胺等人類抗病毒類藥物用于禽類飼養(yǎng)過程中[8]，但目前我國(guó)禽類飼養(yǎng)過程中濫用抗病毒類藥物現(xiàn)象嚴(yán)重，禽類產(chǎn)品中的抗病毒類藥物高效率檢測(cè)方法較少。因此，建立禽類產(chǎn)品中高效、準(zhǔn)確的抗病毒類藥物多殘留檢測(cè)方法[9]，對(duì)于有效監(jiān)控抗病毒藥物的使用、保障我國(guó)動(dòng)物源性食品安全具有重要意義[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MCX在線固相萃取小柱（10 mm×1 mm） 美國(guó)Waters公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷（均為色譜純）美國(guó)Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、乙酸（均為分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑廠；超純水 廣州屈臣氏公司；阿比多爾、金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)品德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Symbiosis（Pico）在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)荷蘭Spark Holland公司；Triple Quad 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)SCIEX公司；3K15高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；Elmasonic P300H超聲波清洗儀 德國(guó)Elma公司；MS3-旋渦混合器 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取5.00 g攪碎的雞肉和雞蛋樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)混合中間溶液和10 mL 1.0%甲酸-乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲提取20 min，9 500 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm聚醚砜微孔濾膜，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取適量的阿比多爾、金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存，有效期6 個(gè)月。量取適量的阿比多爾、金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和金剛烷胺-D6、美金剛-D6內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成1.00 μg/mL的5 種抗病毒藥物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和2 種內(nèi)標(biāo)混合中間溶液，于-20 ℃保存，有效期3 個(gè)月。

1.3.2 色譜條件

MCX在線固相萃取柱（10 mm×1 mm）；色譜分析柱：XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B為乙腈；柱溫40 ℃，進(jìn)樣量50 μL；經(jīng)過在線固相萃取凈化的樣品直接注入色譜分析柱進(jìn)行色譜分離。色譜分離程序見表1，在線凈化程序見表2。

表1 色譜分離程序Table 1 Procedures of chromatographic separation

表2 在線固相萃取程序Table 2 Procedures of on-line SPE

1.3.3 質(zhì)譜條件

（1）將配置好的黑色橡膠混合料運(yùn)至攤鋪區(qū)域，開始人工攤鋪，控制好攤鋪速度，以確保塑膠面層的密實(shí)度和平整度，將攪拌好的黑色橡膠顆粒用送料車送到鋪設(shè)地點(diǎn)，用刮尺攤鋪，均勻攤平。

掃描模式：電噴霧離子源正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)；離子噴霧電壓5 500 V；霧化器壓力55 psi；輔助氣壓力60 psi；氣簾氣壓力30 psi；碰撞氣壓力9 psi；離子源溫度500 ℃；駐留時(shí)間50 ms?？共《绢愃幬镔|(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表3。

表3 抗病毒類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 MS parameters for antiviral drugs

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵以5 μL/min的流速向質(zhì)譜儀中注入500 ng/mL的5 種抗病毒類化合物及2 種內(nèi)標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)母離子掃描，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)物在正離子模式下的靈敏度遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式，這是由于抗病毒類化合物均含有胺基基團(tuán)，容易被質(zhì)子化，帶正電荷。故確定目標(biāo)化合物以[M+H]+作為母離子，對(duì)母離子進(jìn)行子離子全掃描，確定其定性和定量離子。優(yōu)化離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)?？共《绢愃幬锏馁|(zhì)譜參數(shù)見表3，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 抗病毒類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of antiviral drugs

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

在線固相萃取過程中的洗脫液為5%氨水-甲醇溶液，洗脫液直接注入色譜分析柱，為使洗脫液中的目標(biāo)化合物在色譜分析柱入口聚集，不發(fā)生擴(kuò)散，色譜分離的初始流動(dòng)相要保持高比例水相。實(shí)驗(yàn)比較了初始流動(dòng)相中水相比例為90%、95%、97%和98%時(shí)，目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留情況，結(jié)果顯示：水相比例為90%、95%時(shí)，目標(biāo)化合物有擴(kuò)散現(xiàn)象，峰形較差；水相比例增加至97%、98%時(shí)，目標(biāo)化合物無擴(kuò)散現(xiàn)象，峰形較好，考慮到水相比例為98%時(shí)，系統(tǒng)壓力較高，故選取水相比例為97%。此外，在線固相萃取過程的洗脫流速為100 μL/min，為使整個(gè)系統(tǒng)流速之和保持不變，避免系統(tǒng)壓力波動(dòng)較大，出峰異常，需改變液相洗脫流速（0.6 mL/min→0.5 mL/min）。

實(shí)驗(yàn)考察不同流動(dòng)相體系：水-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸-甲醇對(duì)目標(biāo)化合物的色譜響應(yīng)和峰形的影響。在電噴霧離子源正離子模式下，加入適量的甲酸能夠提供更多的H+，有助于增強(qiáng)目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度。流動(dòng)相體系中有機(jī)相為甲醇和乙腈時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜響應(yīng)和峰形差別不大，但甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，需要較長(zhǎng)的平衡時(shí)間，且系統(tǒng)壓力波動(dòng)較大。故選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相。

2.3 在線固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 洗脫流速

在線固相萃取過程中的洗脫流速直接影響洗脫效果。實(shí)驗(yàn)考察洗脫流速分別為100、150、200、250 μL/min對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果。如圖2所示，洗脫流速為100 μL/min時(shí)，目標(biāo)化合物的峰面積最高，色譜峰峰形良好；洗脫流速繼續(xù)增大時(shí)，目標(biāo)化合物的峰面積下降，這是由于洗脫流速過大，洗脫液與填料接觸不充分導(dǎo)致洗脫不完全，故確定洗脫流速為100 μL/min。

圖2 洗脫流速對(duì)5 種抗病毒類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of eluent flow rate on the recoveries of five antiviral drugs

2.3.2 洗脫體積

圖3 洗脫體積對(duì)5 種抗病毒類化合物回收率的影響Fig.3 Effect of elution volume on the recoveries of five antiviral drugs

實(shí)驗(yàn)考察洗脫體積分別為100、150、200、250 μL對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果。如圖3所示，洗脫體積為100 μL時(shí)，目標(biāo)化合物峰面積為零；洗脫體積為150 μL時(shí)，洗脫液對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫不充分；洗脫體積為200 μL時(shí)，目標(biāo)化合物的峰面積最大，峰形良好；洗脫體積250 μL時(shí)，目標(biāo)化合物的峰面積保持不變，故確定洗脫體積為200 μL。

2.4 提取溶劑的選擇

2.4.1 提取溶劑種類

圖4 5種抗病毒藥物在不同提取溶劑下的回收率Fig.4 Recoveries of five antiviral drugs extracted using various neat solvents

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋和阿比多爾均含有極性基團(tuán)，易溶解于極性有機(jī)溶劑中，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，抗病毒類藥物殘留檢測(cè)常用的提取溶劑為甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷[28-31]等，實(shí)驗(yàn)考察上述有機(jī)溶劑對(duì)5 種抗病毒類藥物的提取效果。如圖4所示，乙腈作為提取溶劑時(shí)的提取效果較好，且乙腈可有效去除雞肉和雞蛋基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，故乙腈可作為提取雞肉和雞蛋中5 種抗病毒類藥物的首選溶劑。

2.4.2 提取溶劑配比

圖5 5種抗病毒藥物在不同提取溶劑下的回收率Fig.5 Recoveries of five antiviral drugs extracted using mixed solvent systems

此外，考慮到雞肉基體雜質(zhì)多，蛋白質(zhì)、油脂含量較高，考察不同比例的甲酸、乙酸、鹽酸與乙腈的提取效果。如圖5所示，1.0%甲酸-乙腈溶液對(duì)5 種抗病毒藥物的提取效果最好，回收率在89.75%～99.46%之間。這是因?yàn)橘|(zhì)子化結(jié)構(gòu)與酸根離子形成離子對(duì)后中和了目標(biāo)化合物的電荷，促進(jìn)了目標(biāo)化合物向有機(jī)相遷移[32]，且酸性提取有助于目標(biāo)化合物離子化的形成，便于后續(xù)采用離子交換機(jī)理的在線固相萃取小柱凈化[33]。故選用1.0%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑。

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

準(zhǔn)確吸取5 種抗病毒藥物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和2 種內(nèi)標(biāo)混合中間溶液，用乙腈配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL，美金剛-D6作為美金剛、金剛乙胺的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，金剛烷胺-D6作為其余3 種抗病毒藥物的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法確定方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），RSN≥3和RSN≥10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別作為L(zhǎng)OD和LOQ。由表4可知，金剛烷胺在0.10～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；金剛乙胺、美金剛、奧司他韋、阿比多爾在0.05～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。金剛烷胺的LOD為0.10 μg/kg，LOQ為0.20 μg/kg；金剛乙胺、美金剛、奧司他韋、阿比多爾的LOD為0.05 μg/kg，LOQ為0.10 μg/kg，遠(yuǎn)低于我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4253—2015《出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[34]中抗病毒類藥物的檢測(cè)低限（1.0 μg/kg）和食藥監(jiān)食監(jiān)三便函[2014]73號(hào)中金剛烷胺的檢測(cè)低限（5.0 μg/kg）。

表4 5種抗病毒類藥物的線性關(guān)系、LOD和LOQTable 4 Calibration equations, LOD and LOQ of five antiviral drugs

2.6 加標(biāo)回收率結(jié)果

=6）Table 5 Recoveries and RSD of five antiviral drugs in spiked chicken meat and eggs (n= 6)表 5 雞肉和雞蛋中5 種抗病毒類藥物的回收率和精密度（n

在空白雞肉和雞蛋基質(zhì)中添加5 種抗病毒類藥物進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，共添加3 個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)6 次。如表5所示，5 種抗病毒類藥物在雞肉基質(zhì)中加標(biāo)回收率在80.03%～93.61%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.2%～8.8%之間，在雞蛋基質(zhì)中加標(biāo)回收率在80.82%～93.96%之間，RSD在0.7%～9.2%之間，回收率和精密度符合殘留分析方法的要求。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法，對(duì)市售20 份雞肉和20 份雞蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中2 份雞蛋樣品檢出金剛烷胺，含量為1 402 μg/kg和1 103 μg/kg。對(duì)于陽(yáng)性樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 4253—2015[34]再次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果基本一致。但本方法在檢測(cè)效率、檢測(cè)成本、靈敏度等方面優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法，SN/T 4253—2015中樣品經(jīng)提取后，采用離線固相萃取方法凈化，凈化步驟用時(shí)約2 h，步驟繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，容易引入人為誤差，且固相萃取柱不能反復(fù)使用。本研究采用的在線固相萃取技術(shù)從凈化到完成分析所用時(shí)間小于25 min，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，同一根固相萃取柱反復(fù)進(jìn)樣5 次，重復(fù)性和靈敏度仍然良好，有效降低了檢測(cè)成本。儀器可自行更換固相萃取柱，過程中流量、流速可控，自動(dòng)化和簡(jiǎn)便化的操作更好的提高了方法的回收率和準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

本研究建立雞肉和雞蛋中5 種抗病毒類藥物的全自動(dòng)分析方法。樣品經(jīng)1.0%甲酸-乙腈溶液提取，采用在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)完成凈化與分離，串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，為雞肉和雞蛋中金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、奧司他韋和阿比多爾的批量檢測(cè)提供技術(shù)支持，也可為其他基質(zhì)中其他抗病毒類藥物的快速檢測(cè)提供方法參考。