低劑量氯胺酮對(duì)MPTP誘導(dǎo)帕金森病小鼠神經(jīng)功能及炎性因子的影響

宋俊杰，范軍朝，陳英，陳勇

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，神經(jīng)炎癥、遺傳以及持續(xù)激活的N-甲 基-D-天 冬 酰 胺（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被視為PD發(fā)病的主要病理機(jī)制［1-2］。氯胺酮（ketamine）是NMDA受體的非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑［3］。有研究認(rèn)為其對(duì)PD導(dǎo)致的抑郁、步態(tài)異常有一定改善作用［4］。氯胺酮對(duì)神經(jīng)功能的影響存在兩面性，大部分研究認(rèn)為氯胺酮暴露對(duì)神經(jīng)及記憶功能有一定損傷［5］。但也有研究提出氯胺酮可以通過多種途徑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，20~50 mg/kg的氯胺酮對(duì)腦損傷有一定神經(jīng)保護(hù)作用［6］。因此，推測(cè)其作用可能與用藥劑量及暴露次數(shù)有關(guān)，不同劑量氯胺酮對(duì)于PD的具體作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。在預(yù)實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，本研究分別采用25、50和75 mg/kg劑量的氯胺酮干預(yù)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的PD小鼠，初步探討不同劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)炎癥影響的差異和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量28~30 g，8~10周齡，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-001。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程依照動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。本研究經(jīng)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 CatWalk XT自動(dòng)步態(tài)分析系統(tǒng)購(gòu)自諾達(dá)思（北京）信息技術(shù)有限責(zé)任公司。鹽酸氯胺酮注射劑購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司，MPTP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，兔抗小鼠Toll樣受體4（TLR4）、兔抗小鼠核因 子（NF）-κB p65、兔抗小 鼠髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和β-actin抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）一抗及羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模和給藥 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為NC組、PD組、PD+Keta-L組、PD+Keta-M組、PD+Keta-H組，每組10只。氯胺酮用生理鹽水稀釋至1 g/L，給藥時(shí)調(diào)整體積至1 mL，PD+Keta-L、PD+Keta-M、PD+Keta-H組小鼠分別腹腔注射25、50和75 mg/kg氯胺酮，每天1次，共2 d，NC組和PD組同時(shí)間注射等體積生理鹽水；MPTP用生理鹽水稀釋至1 g/L，給藥時(shí)調(diào)整體積至1 mL，氯胺酮給藥結(jié)束20 min后，對(duì)PD組、PD+Keta-L、PD+Keta-M、PD+Keta-H組小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg，每天1次，連續(xù)20 d，建立亞急性PD模型［7-8］，NC組相同時(shí)間注射同體積生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 末次MPTP給藥結(jié)束2 h后，采用CatWalk自動(dòng)步態(tài)分析系統(tǒng)獲取各組小鼠步態(tài)數(shù)據(jù)，包括步長(zhǎng)、步頻和步行速度變化率；采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，MNSS）系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，包括運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估（0~6分）、感覺功能評(píng)估（0~2分）、平衡功能評(píng)估（0~6分）和反射功能評(píng)估（0~4分）4部分?？傇u(píng)分為0~18分，評(píng)分越高說明MPTP所致神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.3.3 HE染色 神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試完成后（末次給藥結(jié)束后24 h），使用過量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠后迅速斷頭，于冰下取腦，-80℃凍存。取皮層腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，透明劑二甲苯進(jìn)行透明，石蠟包埋成蠟塊，最后于切片機(jī)上切成6μm厚的切片。將切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，蘇木精染色5 min，1%鹽酸分化30 s，流水沖洗15 min，伊紅染色2 min，脫水透明后，中性樹脂封固，光鏡下（×400）觀察結(jié)果。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)TH表達(dá) 取腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，3%H2O2孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，抗原修復(fù)后用5%的胎牛血清封閉30 min，兔抗小鼠TH單克隆抗體（1∶300）4℃孵育過夜，PBS漂洗，羊抗兔二抗（1∶500）孵育40 min，PBS漂洗，蛋白酶K溶液37℃孵育15 min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察TH陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。每張切片隨機(jī)讀取3個(gè)高倍鏡（×100）視野，計(jì)算黑質(zhì)致密部TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及比例，取平均值。

1.3.5 原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 腦組織切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min，充分脫蠟，梯度乙醇浸洗3次，每次5 min，而后采用含3%H2O2的甲醇浸洗10 min，含蛋白酶K的Tris溶液中室溫孵育20 min。采用ApopTag?（Chemicon，美國(guó)）原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 ELISA檢測(cè)炎性因子水平 將腦組織進(jìn)行勻漿裂解，14 000 r/min離心30 min，收集上清。上清包被于ELISA板中，4℃孵育過夜；棄去上清液后PBST洗3次，加入10%BSA于37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，加入兔抗小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β一抗37℃孵育2 h；PBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育2 h；PBST洗滌3次后，加入TMB底物顯色，結(jié)果用酶標(biāo)儀讀數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將腦組織進(jìn)行勻漿裂解，14 000 r/min離心30 min，收集上清。采用核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（碧云天，上海）提取蛋白。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；分別加入TLR4、MyD88、NF-κB p65一抗，4℃孵育過夜；PBS洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育2 h，使用ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，上海）進(jìn)行免疫印跡顯像，使用Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，PD組步長(zhǎng)、步頻降低，速度變化率顯著升高，且MNSS評(píng)分顯著升高，PD小鼠腳步細(xì)密，步態(tài)紊亂，符合PD的行走特征，且出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損，提示建模成功；與PD組相比，PD+Keta-L組步長(zhǎng)、步頻增加，速度變化率下降，且MNSS評(píng)分顯著降低（P＜0.05），而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組間各神經(jīng)行為學(xué)參數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological behavior scores between five groups表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of neurological behavior scores between five groups表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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2.2 氯胺酮對(duì)PD小鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響 HE染色顯示，與NC組相比，PD組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，腦內(nèi)黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，形態(tài)由均勻橢圓形轉(zhuǎn)化為不規(guī)則形，核仁染色明顯，胞漿染色變深，呈凋亡樣改變；PD+Keta-L組和PD+Keta-M組腦組織紊亂結(jié)構(gòu)得到改善，且異常形態(tài)細(xì)胞比例顯著降低；而PD+Keta-H組相較于PD組無(wú)明顯改善，見圖1。

2.3 氯胺酮對(duì)PD小鼠神經(jīng)細(xì)胞TH陽(yáng)性表達(dá)的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，與NC組相比，PD組TH陽(yáng)性細(xì)胞比例及陽(yáng)性著色強(qiáng)度均顯著降低（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組染色強(qiáng)度增高，TH陽(yáng)性細(xì)胞比例增多（P＜0.05），而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表2。

2.4 氯胺酮對(duì)PD小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與NC組相比，PD組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組細(xì)胞凋亡率降低，而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表2。

2.5 氯胺酮對(duì)PD小鼠腦組織炎癥因子水平的影響 與NC組相比，PD組TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組各指標(biāo)顯著下降，但PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

Fig.1 The brain tissues of mice in each group observed by HE staining(×400)圖1 HE染色觀察各組小鼠腦組織（×400）

Fig.2 TH expressions in nerve cells of each group detected by immunohistochemistry(×100)圖2 免疫組化檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞中TH表達(dá)（×100）

Fig.3 The apoptosis rate of nerve cells in each group detected by TUNEL(×400)圖3 TUNEL檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（×400）

Tab.2 Comparison of the proportion of TH positive cells and cell apoptosis rate between the five groups表2 各組TH陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率比較（n=10，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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Tab.3 Comparison of inflammation factor levels between five groups表3 各組炎癥因子水平比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of inflammation factor levels between five groups表3 各組炎癥因子水平比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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2.6 氯胺酮對(duì)小鼠腦組織TLR4相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，PD組TLR4、NF-κB p65和MyD88的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組中TLR4、NF-κB p65和MyD88蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），PD+Keta-M組TLR4及MyD88表達(dá)低于PD組（P＜0.05），NF-κB p65表達(dá)與PD組比較無(wú)明顯改變；PD+Keta-H組與PD組間各蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 expression levels between five groups圖4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

PD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確且無(wú)理想治愈方案。目前臨床已有許多治療方法可以改善PD患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙、認(rèn)知功能低下等癥狀。有研究報(bào)道，經(jīng)顱電刺激［9］、干細(xì)胞［10］等可以有效改善PD神經(jīng)行為學(xué)變化和保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，但針對(duì)PD的新型治療方案、藥物的開發(fā)以及療效的提升仍需要深入研究。氯胺酮作為臨床常用的麻醉劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有重要影響。綜合現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮對(duì)神經(jīng)功能的影響與使用劑量有關(guān)，不同劑量的氯胺酮效果存在顯著差異。Meng等［11］研究顯示，大鼠6 h內(nèi)腹腔分次注射共100 mg/kg的氯胺酮可引起明顯的認(rèn)知損傷和記憶力下降。李建立等［12］研究顯示，75 mg/kg氯胺酮可以下調(diào)G蛋白偶聯(lián)受體30表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)發(fā)育期SD大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。屈瀚等［13］研究顯示，70 mg/kg氯胺酮可以顯著損害7日齡大鼠的神經(jīng)細(xì)胞和認(rèn)知功能，其機(jī)制為促進(jìn)Caspase-3上調(diào)、Tau磷酸化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。徐世霞等［14］采用100 mg/kg氯胺酮對(duì)SD大鼠麻醉后行脾切除術(shù)，結(jié)果顯示氯胺酮麻醉會(huì)損害幼年大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，但其效果是暫時(shí)的。武長(zhǎng)君等［15］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（60 mg/kg）和中劑量（30 mg/kg）氯胺酮長(zhǎng)期使用會(huì)影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和引起神經(jīng)元凋亡，而低劑量對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)t無(wú)明顯影響。因此，氯胺酮對(duì)神經(jīng)的損害與使用劑量有關(guān)，但不同研究結(jié)論并不一致。低劑量或亞麻醉劑量的氯胺酮具有神經(jīng)保護(hù)作用，如Fan等［7］研究顯示，亞麻醉劑量（8 mg/kg）的氯胺酮對(duì)PD小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用；而Chen等［16］給予難治性抑郁癥患者單次低劑量（0.5 mg/kg）氯胺酮，結(jié)果顯示療效良好且可以改善患者的注意力持續(xù)性和反應(yīng)控制能力。目前關(guān)于氯胺酮對(duì)PD影響的研究尚少。王丹丹等［17］發(fā)現(xiàn)，25 mg/kg氯胺酮可以抑制PD小鼠黑質(zhì)中α-突觸核蛋白的異常表達(dá)，從而改善PD小鼠癥狀。Vecchia等［4］也認(rèn)為，適當(dāng)劑量的氯胺酮可以顯著改善PD的抑郁癥狀和步態(tài)異常。部分研究認(rèn)為，氯胺酮改善神經(jīng)組織損傷的主要機(jī)制在于對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制，進(jìn)而抑制其導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡［18］，因此氯胺酮常用于創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)的治療。MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型病理機(jī)制在于連續(xù)給藥過程中造成的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)和黑質(zhì)紋狀體變性、細(xì)胞死亡，與大部分神經(jīng)損傷病理機(jī)制類似。本研究發(fā)現(xiàn)，25 mg/kg氯胺酮干預(yù)小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分相對(duì)于PD組顯著下降，步態(tài)異常也得到一定程度的改善。此外，TH是多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)催化左旋多巴形成多巴胺的特異性蛋白，其表達(dá)降低和活性下降是PD發(fā)病的典型病理學(xué)表現(xiàn)［19］。本研究結(jié)果顯示，低劑量氯胺酮處理后可以在一定程度上改善MPTP造成的腦組織損傷，提高TH陽(yáng)性表達(dá)比例，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而中劑量和高劑量氯胺酮?jiǎng)t無(wú)明顯效果，與其他研究結(jié)論基本一致［6-7，19］。

Tab.4 Comparison of expression levels of TLR4,MyD88,NF-κB p65 between the five groups表4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of TLR4,MyD88,NF-κB p65 between the five groups表4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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TLR家族是研究較為深入的模式識(shí)別受體家族，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)免疫中發(fā)揮重要作用，其中TLR4主要表達(dá)于神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，而小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥介質(zhì)釋放在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。神經(jīng)炎癥是PD病理過程中的重要環(huán)節(jié)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD患者腦內(nèi)多個(gè)區(qū)域有神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并且表現(xiàn)為IL-1β等炎性因子水平明顯升高［20］。PD神經(jīng)炎癥與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)，可能是神經(jīng)元損傷的普遍原因［21］。TLR4/NF-κB是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路之一，已被證實(shí)其參與PD黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)炎癥［22］。Zhang等［23］研究發(fā)現(xiàn)，PD小鼠內(nèi)存在小膠質(zhì)細(xì)胞活化和NF-κB核移位，促使TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和PD病情的進(jìn)展。TLR4是病原體識(shí)別受體之一，其配體脂多糖（LPS）可以激活下游MyD88、TIRAP、TRIF等因子及NF-κB信號(hào)通路，是誘導(dǎo)包括TNF-α、IL-1β、IL-6在內(nèi)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的主要原因，從而調(diào)控刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生［24］。部分研究已經(jīng)探討了氯胺酮對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。徐昕等［25］研究顯示，氯胺酮可以顯著降低腰椎間盤突出根性痛大鼠的炎癥因子水平，并可以抑制c-JNK/CXCL1信號(hào)通路的激活。Zou等［26］研究顯示，氯胺酮對(duì)氣道炎癥反應(yīng)有一定保護(hù)作用，其機(jī)制與mTOR介導(dǎo)的自噬通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PD組中TNF-α、IL-6、IL-1β水平及TLR4、NF-κB、MyD88表達(dá)較NC組顯著升高，提示PD腦組織中炎癥反應(yīng)水平較高；低劑量氯胺酮處理后各炎性因子水平相對(duì)于PD組均有所下降，提示低劑量氯胺酮對(duì)PD神經(jīng)炎癥反應(yīng)存在一定抑制作用，與其他研究基本一致［25-26］。值得注意的是，高劑量氯胺酮對(duì)PD神經(jīng)炎性無(wú)明顯作用，而中劑量氯胺酮輕微降低了TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)水平，提示氯胺酮對(duì)神經(jīng)炎性的影響與劑量關(guān)系密切，最佳劑量仍需進(jìn)一步研究確定。

綜上，低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、NF-κB表達(dá)水平及由此導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制和TH上調(diào)有關(guān)，而高劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用。