基于α-突觸核蛋白的帕金森病動(dòng)物模型研究進(jìn)展

杜可晨，鄒春林△

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二常見神經(jīng)退行性疾?。?］。目前，PD的病因及確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其主要臨床癥狀包括運(yùn)動(dòng)癥狀（運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常等）和非運(yùn)動(dòng)癥狀（自主神經(jīng)功能障礙、嗅覺障礙、便秘和快速眼動(dòng)期睡眠行為障礙等）。PD的主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的變性丟失及路易小體（Lewy bodies，LBs）形成。而α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是LBs的主要組成成分，且α-syn的基因點(diǎn)突變（A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T）與家族性PD的發(fā)病密切相關(guān)，α-syn參與了PD的發(fā)病。近年來，已有大量研究利用α-syn的異位表達(dá)、過表達(dá)或腦內(nèi)注射等方法來建立PD動(dòng)物模型，這些模型與傳統(tǒng)化學(xué)毒素模型相比，能夠更好地復(fù)制PD患者的特征性病理改變。本文基于α-syn的PD動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 α-syn概述

1.1 α-syn的基本結(jié)構(gòu) α-syn是由140個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，并且是一種具有多種構(gòu)象的蛋白，包括單體、寡聚體、多聚體、原纖維、不溶性原纖維等。有研究表明，α-syn各組分間存在動(dòng)態(tài)平衡，正常情況下不具有聚集傾向，當(dāng)寡聚體與單體比例失調(diào)時(shí)會(huì)引起聚集，形成的原纖維可損害神經(jīng)元并導(dǎo)致疾病進(jìn)展［2］。α-syn由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端與脂質(zhì)結(jié)合的α螺旋結(jié)構(gòu)域、非淀粉樣β蛋白結(jié)構(gòu)域、非結(jié)構(gòu)化C端。N端在膜上起結(jié)合的作用，含有7個(gè)重復(fù)序列，每個(gè)序列包含11個(gè)氨基酸，而非結(jié)構(gòu)化C端含有大量帶電殘基，這些殘基有助于抑制原纖維的形成，是重要的翻譯后修飾結(jié)構(gòu)。

1.2 α-syn的生理功能 α-syn的生理功能尚未被完全揭示。已有研究證明α-syn能抑制胞吐融合孔的關(guān)閉，促進(jìn)胞吐作用［3］。同時(shí)α-syn可調(diào)節(jié)多巴胺（dopamine，DA）轉(zhuǎn)運(yùn)體，影響神經(jīng)末梢攝取DA的效率。α-syn的C端與α-晶體蛋白部分結(jié)構(gòu)相似，具有保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白免受溫度變化和氧化應(yīng)激影響的作用。α-syn作為腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成的生理調(diào)節(jié)因子，能在線粒體中影響ATP合成的效率［4］，同時(shí)也參與正常的脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)移及代謝；且能控制神經(jīng)遞質(zhì)釋放［5］。Bi等［6］發(fā)現(xiàn)α-syn能誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶激活Ser131磷酸化的Parkin基因，使E3泛素連接酶失活，并進(jìn)一步降低二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（divalent metal transporter 1，DMT1）的泛素化水平。DMT1穩(wěn)定性的改變和細(xì)胞對(duì)鐵攝取的改變能影響腦中鐵穩(wěn)態(tài)，因此α-syn可能在黑質(zhì)（Substantia nigra，SN）中參與PD相關(guān)的鐵沉積以及鐵代謝功能障礙。

1.3 α-syn的病理功能 Logan等［3］發(fā)現(xiàn)外源性或過表達(dá)α-syn可以促進(jìn)胞吐融合孔的擴(kuò)張，促進(jìn)胞吐作用。異常聚集的α-syn能增強(qiáng)細(xì)胞核周圍和樹突中線粒體的氧化應(yīng)激。α-syn低聚物會(huì)導(dǎo)致線粒體破碎，產(chǎn)生的碎片又進(jìn)一步引起更多線粒體發(fā)生功能障礙與死亡。α-syn以劑量依賴性方式抑制囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，使囊泡在質(zhì)膜附近堆積成囊泡簇。免疫熒光顯示囊泡簇與α-syn及不同的囊泡標(biāo)志物相關(guān)，表明α-syn能影響囊泡運(yùn)輸?shù)牟襟E。α-syn的錯(cuò)誤折疊會(huì)形成毒性淀粉樣蛋白聚集體，這些聚集體在神經(jīng)元中沉積并引發(fā)神經(jīng)元功能障礙，最終過表達(dá)的α-syn與其他蛋白形成LBs并沉積在神經(jīng)突中，阻礙DA代謝和神經(jīng)元的正常功能，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。

正常情況下，過表達(dá)或錯(cuò)誤折疊的α-syn會(huì)通過自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）降解。ALP是對(duì)胞漿內(nèi)大分子蛋白和細(xì)胞器等進(jìn)行降解的一種途徑，可以通過溶酶體清除多種α-syn聚集體。因此，ALP受損會(huì)導(dǎo)致α-syn在細(xì)胞中過表達(dá)及異常聚集而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。異常聚集的α-syn又能阻斷葡萄糖腦苷酶1等水解酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，降低溶酶體的降解能力，進(jìn)一步引發(fā)溶酶體清除過表達(dá)或錯(cuò)誤折疊的α-syn的能力下降［7］。因此ALP受損與病理性α-syn聚集可能共同加速了神經(jīng)元受損，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)元病變。

2 基于α-syn的PD動(dòng)物模型

研究人員已建立了多種PD動(dòng)物模型，包括秀麗隱桿線蟲、果蠅、斑馬魚等低等動(dòng)物，小型豬、狗、嚙齒類和非人靈長類（non-human primates，NHPs）等高等哺乳動(dòng)物。嚙齒類動(dòng)物體型較小、易于飼養(yǎng)，解剖結(jié)構(gòu)與人類相近，因此成為PD研究中最經(jīng)典的動(dòng)物模型之一，常用嚙齒類動(dòng)物有小鼠與大鼠。NHPs是與人類最為接近的動(dòng)物，能夠更好地復(fù)制PD患者的特征性病理改變，但因飼養(yǎng)難度大且成本較高，目前研究數(shù)量相對(duì)較少。低等動(dòng)物雖然結(jié)構(gòu)簡單，但能與高等動(dòng)物模型形成互補(bǔ)，如秀麗隱桿線蟲體壁透明可用于追蹤顯示熒光蛋白，彌補(bǔ)高等動(dòng)物模型中難以體內(nèi)示蹤的缺陷。

基于α-syn的PD動(dòng)物模型與其他藥物構(gòu)建的PD模型存在一定區(qū)別。神經(jīng)毒素類（6-羥基多巴胺、1,4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶、殺蟲劑等）模型造模速度快，但僅能模擬PD癥狀，不能很好地模擬PD特征性的病理改變；而基于α-syn的PD動(dòng)物模型雖然造模速度較慢，但可造成PD特征性的病理改變并引起PD癥狀，相比神經(jīng)毒素模型能更好地模擬PD患者的病程發(fā)展。以下主要討論基于α-syn的嚙齒類及NHPs的PD模型的研究進(jìn)展。

2.1 基于α-syn的嚙齒類動(dòng)物PD模型

2.1.1 轉(zhuǎn)基因模型 嚙齒類動(dòng)物是目前最常用的實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物。已有研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在嚙齒類動(dòng)物腦中過表達(dá)野生型（Wild Type，WT）、A53T、A30P或E46K突變型α-syn，可部分引起紋狀體DA含量減少、黑質(zhì)神經(jīng)元變性和運(yùn)動(dòng)功能障礙等一系列特征性的PD生化、病理和行為學(xué)改變。Masliah等［8］首先成功建立了過表達(dá)WTα-syn轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并在該模型中觀察到部分PD特征性病理改變，如在新皮質(zhì)、海馬及黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)形成α-syn陽性包涵體和泛素陽性包涵體；此外，基底節(jié)內(nèi)也可見紋狀體多巴胺能神經(jīng)元末梢丟失，但黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元無明顯減少，且未見典型的LBs形成，行為學(xué)異常也僅在高表達(dá)α-syn的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到。van der Putten等［9］建立了Thy1調(diào)控序列作用下過表達(dá)A53T突變型的人源性α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該轉(zhuǎn)基因小鼠的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺乏A53T突變型的人源性α-syn表達(dá)，但在黑質(zhì)之外的腦區(qū)卻具有與Lewy體病患者大腦相似的α-突觸核蛋白病病理改變；此外，該模型可表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙，表明此模型可作為研究α-突觸核蛋白病的一個(gè)較好的小鼠模型。雖然上述轉(zhuǎn)基因小鼠模型能出現(xiàn)PD的一些特征性病理改變（如神經(jīng)元內(nèi)α-syn的聚集和α-syn包涵體形成等）以及運(yùn)動(dòng)障礙，但這些模型大多缺乏特異性的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷和丟失，因此與PD患者的臨床病理改變?nèi)杂忻黠@區(qū)別。

2.1.2 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）模型 由于AAV具有體積小、感染效率高、很少整合到宿主基因組中，并能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)，近年來許多研究者開始通過AAV介導(dǎo)WT或突變型α-syn在中腦黑質(zhì)中過表達(dá)，從而導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，以期建立能夠更好模擬PD特征性病理改變的動(dòng)物模型。van der Perren等［10］將編碼A53T突變型α-syn的重組腺相關(guān)病毒載 體 2/7（recombination adeno-associated virus，rAAV）通過腦立體定位，定向注射到大鼠黑質(zhì)部位，模型鼠在注射3周后出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，注射4周后對(duì)側(cè)前爪使用率減少50%，且使用左旋多巴治療可使前爪功能完全恢復(fù)；注射29 d后，大鼠黑質(zhì)內(nèi)80%的酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）陽性神經(jīng)元死亡；注射32 d后，通過影像學(xué)發(fā)現(xiàn)尾殼核內(nèi)DA轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合率降低了85%；此外，在黑質(zhì)中出現(xiàn)了α-syn異常聚集體，且17 d后在黑質(zhì)中可見硫代黃素S染色呈陽性的α-syn異常聚集體。以上結(jié)果表明通過rAAV介導(dǎo)，在黑質(zhì)部位過表達(dá)A53T突變型α-syn可高效建立具有特征性病理和行為學(xué)改變的PD動(dòng)物模型。Ip等［11］將編碼A53T突變型α-syn的AAV 1/2立體定向注射到小鼠黑質(zhì)部位，10周后整個(gè)黑質(zhì)與紋狀體中均發(fā)現(xiàn)A53T突變型α-syn，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)TH陽性神經(jīng)元與A53T突變型αsyn存在共定位，TH陽性神經(jīng)元密度降低了20%，且紋狀體中DA水平減少約40%，通過放射自顯影分析，DA轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合率降低了29%；同時(shí)可觀察到小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生LBs樣結(jié)構(gòu)以及營養(yǎng)不良性神經(jīng)突起，行為學(xué)檢測(cè)可見小鼠左前爪使用率下降。該研究在小鼠中誘導(dǎo)出了PD樣的病理及行為學(xué)改變，成功構(gòu)建了基于α-syn的PD小鼠模型。由于在PD前驅(qū)階段藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元的退行性改變可引起一系列非運(yùn)動(dòng)癥狀（抑郁癥、焦慮和睡眠障礙等），因此Henrich等［12］建立了第一個(gè)小鼠藍(lán)斑中過表達(dá)α-syn的動(dòng)物模型，該研究將編碼A53T突變型α-syn的AAV1/2注射到小鼠藍(lán)斑中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射3周后藍(lán)斑中TH陽性細(xì)胞減少約15.86%，6周后減少約34.84%，9周后減少約56.25%；該研究還發(fā)現(xiàn)藍(lán)斑神經(jīng)元中出現(xiàn)磷酸化的α-syn聚集以及反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；但該研究未發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元明顯減少，這可能與實(shí)驗(yàn)周期短有關(guān)。

與其他AAV相比，AAV2/DJ在體外有更高的轉(zhuǎn)染效率。von Hovel等［13］首次利用AAV2/DJ作為載體在大鼠黑質(zhì)過表達(dá)WTα-syn與E46K突變型αsyn，結(jié)果顯示黑質(zhì)神經(jīng)元中均產(chǎn)生了具有蛋白酶K抗性的不溶性磷酸化α-syn，并出現(xiàn)LBs樣病理改變；黑質(zhì)紋狀體TH免疫組化染色結(jié)果顯示，在過表達(dá)WTα-syn的大鼠模型的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量呈進(jìn)行性減少，12周時(shí)減少達(dá)40%，并且紋狀體中TH陽性神經(jīng)纖維也呈現(xiàn)相似的改變；而在過表達(dá)E46K突變型α-syn大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的數(shù)量在注射4周后不再減少；行為學(xué)方面，2個(gè)模型均出現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的改變，但在圓筒實(shí)驗(yàn)中，僅過表達(dá)WTα-syn的大鼠出現(xiàn)明顯變化，TH陽性神經(jīng)纖維在第4周降低至67.0%，第8周進(jìn)一步降低至58.7%，第12周下降至44.1%，提示W(wǎng)Tα-syn大鼠神經(jīng)元正在持續(xù)退化，這些結(jié)果表明過表達(dá)E46K突變型α-syn的大鼠模型可作為前驅(qū)期PD模型，而過表達(dá)WTα-syn的大鼠模型可作為早期PD模型。

2.2 基于α-syn的NHPs的PD模型 NHPs動(dòng)物在神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)行為學(xué)方面與人類非常接近，因此作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型有著其他動(dòng)物所無法比擬的優(yōu)勢(shì)。Kirik等［14］通過向成年狨猴大腦的黑質(zhì)中注射編碼WT和A53T突變型α-syn的rAAV建立了第一個(gè)NHPsα-syn過表達(dá)模型；該研究發(fā)現(xiàn)在注射WT和A53T突變型α-syn-rAAV 16周后，狨猴均出現(xiàn)了明顯的PD樣病理改變，如αsyn陽性包涵體和顆粒狀沉積物以及產(chǎn)生營養(yǎng)不良性神經(jīng)突起，并且進(jìn)一步通過體視學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示在注射WT和A53T突變型α-syn-rAAV的黑質(zhì)中，TH陽性細(xì)胞數(shù)減少達(dá)32%~61%。Yang等［15］利用NHPs動(dòng)物評(píng)價(jià)了不同年齡對(duì)過表達(dá)α-syn毒性的影響，將編碼A53T突變型α-syn的慢病毒載體注射到不同年齡的恒河猴黑質(zhì)部位，8周后所有過表達(dá)A53T突變型α-syn的猴腦內(nèi)注射位點(diǎn)均可見路易神經(jīng)突，并且路易神經(jīng)突的密度隨年齡的增長而增加；此外，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也隨年齡增長而增加，并伴有明顯的神經(jīng)元軸突退行性病變；TH免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組猴相比，過表達(dá)A53T突變型α-syn的實(shí)驗(yàn)組猴黑質(zhì)DA神經(jīng)元明顯減少，這些結(jié)果表明老化可加速神經(jīng)元中α-syn聚集。Bourdenx等［16］也將編碼A53T突變型α-syn的AAV2/9病毒載體注射到青年和老年狨猴的黑質(zhì)部位，但與Yang等［15］研究結(jié)果不同，該研究結(jié)果顯示，青年狨猴與老年狨猴在黑質(zhì)紋狀體部位TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的丟失程度無明顯差異，說明老化并不會(huì)加劇過表達(dá)α-syn的神經(jīng)毒性。造成上述2個(gè)研究結(jié)果不同的原因可能是Yang等［15］用的是舊世界恒河猴，而Bourdenx等［16］用的是新世界狨猴，由于狨猴的α-syn天然帶有A53T突變，因此可能對(duì)外源性過表達(dá)A53T突變型α-syn的毒性作用具有一定的拮抗能力。Koprich等［17］通過注射編碼A53T突變型α-syn的AAV1/2病毒載體到食蟹猴黑質(zhì)部位，成功構(gòu)建了過表達(dá)A53Tα-syn的猴模型，研究顯示該模型黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失超過50%，紋狀體DA減少超過60%，進(jìn)一步表明在NHPs黑質(zhì)紋狀體過表達(dá)α-syn可建立用于研究PD特異性病理改變的NHPs動(dòng)物模型。與上述研究不同，Collier等［18］通過注射rAAV-α-syn-shRNA到綠猴黑質(zhì)部位，敲低內(nèi)源性α-syn表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射后3個(gè)月，黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元及紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維明顯減少，并且以黑質(zhì)腹側(cè)部TH陽性神經(jīng)元減少最為明顯；而在紋狀體部位，殼核內(nèi)TH陽性神經(jīng)纖維的減少比尾狀核更明顯；因此，研究人員推測(cè)α-syn喪失正常功能可能是PD的病因之一，在PD患者腦內(nèi)病理性α-syn聚集體可能通過吸附作用來阻止α-syn發(fā)揮正常的生理功能。

在α-syn轉(zhuǎn)基因猴研究方面，Niu等［19］將編碼A53T突變型α-syn的慢病毒載體注射到恒河猴卵母細(xì)胞中，并最終從75個(gè)胚胎中成功孕育出6只表達(dá)A53T突變型α-syn的轉(zhuǎn)基因猴，雖然這些轉(zhuǎn)基因猴沒有出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)癥狀，但出現(xiàn)了年齡依賴的PD非運(yùn)動(dòng)癥狀（如認(rèn)知缺陷和焦慮表型）。這些癥狀與PD患者早期出現(xiàn)的非運(yùn)動(dòng)癥狀相一致，因此這一轉(zhuǎn)基因猴模型對(duì)于今后研究PD的早期病理改變有著重要價(jià)值。

3 基于α-syn預(yù)制原纖維的PD動(dòng)物模型

3.1 嚙齒類動(dòng)物模型 正常情況下α-syn在細(xì)胞內(nèi)以可溶性單體形式存在，當(dāng)疾病狀態(tài)下體內(nèi)環(huán)境改變時(shí)，可溶性α-syn轉(zhuǎn)化為寡聚中間體，寡聚中間體再延伸轉(zhuǎn)化為不溶性的α-syn原纖維，然后進(jìn)一步聚集形成α-syn包涵體。這種不溶性α-syn原纖維是LBs的主要成分，為了便于研究α-syn原纖維的致病機(jī)制，研究人員在體外合成了與α-syn原纖維高度相似的α-syn預(yù)制原纖維（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-syn PFFs），并將其應(yīng)用于各種PD細(xì)胞和動(dòng)物模型的制作。Luk等［20］首次將α-syn PFFs添加到過表達(dá)α-syn的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，結(jié)果顯示α-syn PFFs可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性α-syn的聚集，并形成LBs樣細(xì)胞包涵體。Volpicelli-Daley等［21］在原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入α-syn PFFs，結(jié)果顯示α-syn PFFs可誘導(dǎo)形成不溶性的α-syn聚集體，并證實(shí)病理性α-syn聚集體能夠在神經(jīng)元之間傳播，最終導(dǎo)致神經(jīng)元缺失。上述細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了α-syn PFFs具有細(xì)胞毒性及在細(xì)胞間朊病毒樣傳播的特性。為了進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)α-syn PFFs的這些生物學(xué)特性和功能，Luk等［22］首次將α-syn PFFs應(yīng)用于PD小鼠模型的制作，結(jié)果顯示在小鼠紋狀體內(nèi)注射α-syn PFFs可導(dǎo)致病理性α-syn在注射部位的神經(jīng)元內(nèi)聚集以及在相連腦區(qū)播散，并導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)元發(fā)生退行性改變；其中黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的缺失直接導(dǎo)致了模型小鼠行為學(xué)改變，包括小鼠握力、平衡和協(xié)調(diào)能力下降，表明α-syn PFFs可用于制作PD動(dòng)物模型。Masuda-Suzukake等［23］除將α-syn PFFs注射到小鼠黑質(zhì)中外，還首次將路易體癡呆患者的腦組織提取物也注射到小鼠黑質(zhì)部位，結(jié)果同樣顯示病理性α-syn可在多個(gè)腦區(qū)間傳播，并導(dǎo)致神經(jīng)元慢性退行性改變。但Luk等［22］的研究結(jié)果不同，模型小鼠未出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，可能是注射劑量和注射部位不同所致。Paumier等［24］進(jìn)一步將α-syn PFFs注射到大鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)，也發(fā)現(xiàn)病理性αsyn出現(xiàn)廣泛的不同腦區(qū)間的傳播，并且可導(dǎo)致在注射部位同側(cè)黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)形成α-syn聚集體、雙側(cè)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元退行性改變以及雙側(cè)紋狀體神經(jīng)支配減少；行為學(xué)上，2個(gè)部位注射的大鼠模型中可見僅少數(shù)對(duì)側(cè)前肢運(yùn)動(dòng)障礙。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明α-syn PFFs可用僅于制作嚙齒類動(dòng)物PD模型。隨后多個(gè)研究又將α-syn PFFs分別注射到小鼠和大鼠的腦內(nèi)紋狀體或黑質(zhì)，建立了多種基于α-syn PFFs的PD模型，并探討了α-syn PFFs在PD模型腦內(nèi)的致病作用和相關(guān)致病機(jī)制［25-29］。

根據(jù)Braak假說，PD患者的α-syn病理改變可能起源于腸道神經(jīng)系統(tǒng)和嗅球這2個(gè)部位［30］。為了證實(shí)病理性α-syn可以從上述2個(gè)部位傳播到中腦黑質(zhì)部位，研究人員將α-syn PFFs分別注射到腸道肌層和嗅球，并觀察病理性α-syn在相關(guān)神經(jīng)通路的傳播及所引起的病理改變。Kim等［31］向小鼠十二指腸和幽門肌層注射α-syn PFFs，并在注射后1、3、7和10個(gè)月分別取相關(guān)神經(jīng)組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在注射1個(gè)月后病理性α-syn可通過迷走神經(jīng)擴(kuò)散至大腦底部的腦干部位，3個(gè)月時(shí)繼續(xù)向上擴(kuò)散至藍(lán)斑、黑質(zhì)、杏仁核、下丘腦和前額葉，7個(gè)月時(shí)可蔓延到海馬、紋狀體和嗅球，而在迷走神經(jīng)切斷的小鼠或α-syn敲除的小鼠體內(nèi)注射α-syn PFFs，病理性α-syn的傳播可被阻斷，說明病理性α-syn是通過迷走神經(jīng)從腸道神經(jīng)系統(tǒng)向腦內(nèi)傳播，并依賴內(nèi)源性α-syn；該研究還發(fā)現(xiàn)注射α-synPFFs 7個(gè)月后小鼠產(chǎn)生精細(xì)行為障礙和焦慮樣行為表現(xiàn)；因此研究結(jié)果顯示該模型可作為一種新的PD模型用于PD的發(fā)病機(jī)制和治療研究。此外，有研究證實(shí)腦內(nèi)病理性α-syn同樣會(huì)通過迷走神經(jīng)傳播到腸道神經(jīng)系統(tǒng)，并引起病理性α-syn聚集和腸道神經(jīng)元損傷［32］，提示病理性α-syn能通過迷走神經(jīng)在腦與腸道之間互相傳遞。另有研究者將α-syn PFFs注射到小鼠嗅球部位，幾個(gè)月后可見由該外源性α-syn PFFs誘導(dǎo)的內(nèi)源性α-syn在遠(yuǎn)離注射部位的不同腦區(qū)產(chǎn)生病理性聚集，并且這種病理性聚集可導(dǎo)致進(jìn)行性嗅覺功能缺失，這與臨床上PD患者早期癥狀相似，因此該模型可作為前驅(qū)期PD模型用于PD早期治療方法的研究［33-34］。

3.2 NHPs模型 為了進(jìn)一步研究α-syn PFFs在NHPs動(dòng)物模型中的致病作用，Shimozawa等［35］首次將α-syn PFFs注射到青年狨猴紋狀體內(nèi)，注射3個(gè)月后即可在多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元內(nèi)觀察到磷酸化α-syn陽性染色包涵體形成，表明注射外源性α-syn PFFs可誘導(dǎo)內(nèi)源性α-syn發(fā)生病理性聚集，并且在注射側(cè)黑質(zhì)內(nèi)能觀察到TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少以及神經(jīng)元內(nèi)LBs樣包涵體形成；此外，該研究發(fā)現(xiàn)從注射部位到新皮質(zhì)、黑質(zhì)、杏仁核、蒼白球和丘腦等腦區(qū)均觀察到病理性α-syn聚集，說明病理性α-syn可在神經(jīng)元間進(jìn)行逆行傳播；同時(shí)，他們還觀察到含有α-syn包涵體的神經(jīng)元可能通過小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用被清除。Chu等［36］在8只食蟹猴的殼核內(nèi)注射了α-syn PFFs，12~15個(gè)月后，免疫組化染色結(jié)果顯示在殼核注射區(qū)域可見大量磷酸化α-syn陽性染色的神經(jīng)元，在注射部位同側(cè)的黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)可見各種形狀的磷酸化α-syn陽性染色聚集體，其中包括LBs樣包涵體，同時(shí)DA能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，該研究再次證實(shí)了α-syn PFFs能夠誘導(dǎo)NHPs產(chǎn)生類PD樣的病理改變。但是，在上述2項(xiàng)研究中，模型猴均未出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，這可能與α-syn PFFs的注射劑量不足和觀測(cè)周期尚短有關(guān)。

4 小結(jié)

近20年來研究人員已建立了多種基于α-syn的PD動(dòng)物模型，雖然目前還沒有一種模型能夠完全復(fù)制PD的所有臨床癥狀和病理改變，但每種模型均能復(fù)制PD的部分疾病特征，因此應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x用相應(yīng)的動(dòng)物模型。如利用rAAV作為載體在黑質(zhì)部位過表達(dá)α-syn的動(dòng)物模型，可用于探索αsyn的致病作用和相關(guān)機(jī)制，而α-syn PFF體內(nèi)注射模型適用于病理性α-syn體內(nèi)傳播機(jī)制和阻斷治療的研究。因此，α-syn作為LBs的主要成分，在PD的發(fā)病中起著重要作用，其或可成為新的PD診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。