HNF-4α基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系

黃海燕，李毅，呂其軍，周芳，王濟(jì)紅，楊長(zhǎng)春，徐娟△

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）屬一種臨床病理綜合征，主要病理特征是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，甚至壞死、脂肪貯積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等［1-2］。NAFLD作為代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及與其有關(guān)的肝硬化或肝癌等均屬該病的疾病譜［3-4］。NAFLD可引起多種并發(fā)癥，如動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等［5］。其發(fā)病與環(huán)境、遺傳等多種因素有關(guān)。肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4，HNF-4α）可調(diào)節(jié)肝臟多個(gè)脂代謝的通路［6］，在NAFLD中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，但目前關(guān)于HNF-4α基因多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系鮮有報(bào)道。本文以NAFLD患者為研究對(duì)象，分析HNF-4α基因多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系，以期為探究NAFLD發(fā)病的遺傳學(xué)因素提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年10月—2019年4月勝利油田中心醫(yī)院收治的NAFLD患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《NAFLD診療指南（2010版）》相關(guān)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；年齡18~75歲；無大量或長(zhǎng)期飲酒史（飲酒換算乙醇量：女性＜70 g/周、男性＜140 g/周），均為非酒精性單純性脂肪肝；精神狀態(tài)尚可、意識(shí)清晰，可配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤；合并心、肺、腎等其他重要器官的功能損傷；伴有病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃缘?；伴發(fā)感染性疾病、傳染性疾病、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等；處于妊娠期或哺乳期；近3個(gè)月服用可影響內(nèi)分泌的藥物。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，共納入100例NAFLD患者作為觀察組。選擇同時(shí)期來本院查體的100例健康人作為對(duì)照組。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集研究對(duì)象的一般臨床資料，包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、腰圍、臀圍、腰臀比（WHR），以及肝功能［丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）］、血脂［三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）］、血糖（GLU）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、尿酸（UA）等生化指標(biāo)，檢測(cè)非酒精性單純性脂肪肝嚴(yán)重程度和HNF-4α的基因多態(tài)性。

1.3 檢測(cè)方法與分組（1）非酒精性單純性脂肪肝嚴(yán)重程度。行腹部CT，觀察病變程度，肝/脾CT比值≤0.5為重度病變，0.5＜肝/脾CT比值≤0.7為中度病變，0.7＜肝/脾CT比值＜1.0為輕度病變。據(jù)此，將觀察組分為輕度組（28例）、中度組（36例）和重度組（36例）。（2）HNF-4αrs4812829位點(diǎn)基因多態(tài)性。使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集研究對(duì)象的外周靜脈血5 mL，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取外周血內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA。HNF-4α基因上游引物為5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGC?GACTCTCCAAAACCCCT-3'，下游引 物為5'-TCCTTG?TAGTCCATACCGATAACTTCCTGCTTGGTGATG-3'，PCR的擴(kuò)增體系包含2 U熱啟動(dòng)混合Taq酶、200 ng DNA模板、正反向引物各5μL（10 mmol/L）、5μL dNTPs（200μmol/L）、5μL Tris-HCl（100 mmol/L）、5μL KCl（500 mmol/L）、5μL MgCl2（215 mmol/L），并加去離子水至體積為50μL。在熱循環(huán)儀上展開聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，條件及過程為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后，37℃條件下采用限制性內(nèi)切酶消化12 h，將16.5μL酶切產(chǎn)物放入含4%瓊脂糖凝膠內(nèi)，進(jìn)行電泳分離并明確基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)采用多因素Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與觀察組基線資料比較 2組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，觀察組SBP、DBP、BMI、WHR均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of general data between control group and observation group表1 對(duì)照組與觀察組基線資料比較（n=100）

2.2 對(duì)照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 對(duì)照組、輕度組、中度組、重度組的ALT、AST、γ-GT、TC、TG、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平大體呈現(xiàn)依次升高趨勢(shì)（P＜0.05），而HDL-C水平呈下降趨勢(shì)，見表2。

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 對(duì)照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 對(duì)照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與輕度組比較，c與中度組比較，P＜0.05

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2.3 對(duì)照組與觀察組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 HNF-4α基因rs4812829位點(diǎn)多態(tài)性在對(duì)照組與觀察組中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律（P＞0.05），2組均有較好群體代表性，且2組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 between control group and observation group表3 對(duì)照組與觀察組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 （n=100）

2.4 觀察組不同亞組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 觀察組不同亞組HNF-4α rs4812829等位基因及基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 in different subgroups of the observation group表4 觀察組中不同亞組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較

2.5 觀察組HNF-4αrs4812829位點(diǎn)不同等位基因攜帶者之間肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 觀察組AA、AG、GG型基因攜帶者之間ALT、AST、γ-GT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 觀察組HNF-4αrs4812829位點(diǎn)不同等位基因攜帶者肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 觀察組HNF-4αrs4812829位點(diǎn)不同等位基因攜帶者肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

均P＞0.05

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2.6 HNF-4αrs4812829基因位點(diǎn)與NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 以是否發(fā)生NAFLD（是=1，否=0）為因變量，以性別、年齡、rs4812829基因型（GG=0，AG=1，AA=2）等為自變量，對(duì)2組性別、年齡等因素校正后進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，與基因型為GG個(gè)體相比，基因型為AG、AA的個(gè)體發(fā)生NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)均未增加，見表6。

Tab.6 Correlation analysis of HNF-4αrs4812829 gene locus and the risk of NAFLD表6 HNF-4αrs4812829基因位點(diǎn)與NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

3 討論

3.1 NAFLD的臨床特征 NAFLD已成為我國(guó)第二大肝病，其發(fā)病率僅次于慢性病毒性肝炎［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，西方國(guó)家NAFLD發(fā)病率約30%，其發(fā)生與代謝功能障礙機(jī)制存在密切聯(lián)系［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著高脂血癥、2型糖尿病等代謝性疾病增多，該病發(fā)病率明顯升高［11］；且NAFLD易引發(fā)肝硬化、不良心血管事件等，具有較高的死亡率［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組SBP、DBP、BMI、WHR均明顯高于正常對(duì)照組，且肝功能、血脂、血糖、UA等指標(biāo)均明顯異于對(duì)照組，病情越重，上述代謝指標(biāo)越差。由此可見，NAFLD患者存在多種代謝紊亂，肝功能下降、血脂及血糖代謝異常。

3.2 HNF-4α在NAFLD發(fā)病中的作用 NAFLD發(fā)病機(jī)制未有明確定論，可能與環(huán)境因素、遺傳因素等相互作用相關(guān)［14］。近年來NAFLD發(fā)病的遺傳學(xué)研究較多，多種核受體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等參與其發(fā)病過程［15-16］。其中，HNF-4α作為鋅指蛋白的一種，屬于核受體超級(jí)家族的孤兒核受體，HNF-4α編碼基因位于20號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，以同源二聚體形式結(jié)合DNA，且其主要在肝臟表達(dá)，而在腎臟、胰腺等組織少量表達(dá)。HNF-4α參與葡萄糖、脂肪酸、膽固醇等物質(zhì)代謝過程，參與肝臟的糖異生激活、調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞分泌、調(diào)節(jié)脂蛋白等相關(guān)基因表達(dá)［17］。HNF-4α基因rs4812829（G＞A）位點(diǎn)是糖尿病的易感性位點(diǎn)，與遲發(fā)性糖尿病或2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)，在調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、膽汁酸合成等過程中，HNF-4α亦發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組HNF-4α rs4812829位點(diǎn)基因型AA、AG、GG的分布及等位基因A、G的占比均與對(duì)照組無明顯差異，且HNF-4α rs4812829位點(diǎn)各基因型及等位基因的分布在觀察組各亞組之間亦無明顯差異，對(duì)比觀察組HNF-4α rs4812829位點(diǎn)不同基因型攜帶者之間肝功能、血脂、血糖、UA水平亦均無明顯差異，可見HNF-4α rs4812829位點(diǎn)與NAFLD的發(fā)生無明顯關(guān)系。Logistic回歸進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與基因型為GG個(gè)體相比，基因型為AG、AA的個(gè)體發(fā)生NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)均未增加，推測(cè)HNF-4αrs4812829位點(diǎn)的基因多態(tài)性尚未增加NAFLD的患病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，HNF-4α基因rs4812829位點(diǎn)多態(tài)性及等位基因的分布與NAFLD發(fā)生無明顯相關(guān)。但本研究?jī)H對(duì)NAFLD患者進(jìn)行血生化指標(biāo)、CT影像學(xué)等檢查，且整體樣本量偏小，故而有待擴(kuò)大樣本深入研究HNF-4α基因多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系，為預(yù)防NAFLD發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。