電針對IBS-C模型大鼠血清及結(jié)腸中CGRP和5-HT表達(dá)的影響

武小利，高 紡，吳生兵，陳幸生

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研中心，安徽 合肥230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病四科，安徽 合肥230061）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種慢性胃腸功能性疾病，患者人數(shù)占胃腸病患者的30%～50%，其主要表現(xiàn)為腹部脹痛、排便異常。我國人群總患病率達(dá)6.5%［1］，全球近1/5人群有IBS的臨床癥狀，IBS嚴(yán)重影響著人群健康［2］。便秘型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with constipation，IBS-C）是其亞型之一，其病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，各種原因引起的腸道敏感性和腸道動(dòng)力異常均能導(dǎo)致發(fā)病。西醫(yī)依靠藥物治療IBS-C，但存在不良反應(yīng)大、且易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)。相比而言，中醫(yī)傳統(tǒng)療法有傷害性小、療效穩(wěn)定的特點(diǎn)，優(yōu)勢明顯；其中，電針可通過調(diào)節(jié)機(jī)體氣血、陰陽和臟腑起到治療腸易激綜合征的目的［3］。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)穴位間具有協(xié)同作用且針刺四單穴組方對改善IBS-C模型便秘癥狀的效果最佳［4］。研究表明CGRP和5-HT參與了中樞與胃腸互相作用過程［5］。CGRP在胃腸道廣泛分布，能調(diào)節(jié)胃腸分泌及運(yùn)動(dòng)［6］。5-HT是與腸道動(dòng)力和敏感性密切相關(guān)的遞質(zhì)，與多種胃腸道疾病有關(guān)［7，8］。因此，本研究通過建立IBS-C大鼠模型，探討電針對IBS-C模型大鼠血清和結(jié)腸中降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

選取3個(gè)月齡SD大鼠50只，重量220～280 g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（皖）2017-001。大鼠放置在獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±1）℃，相對濕度（55±5）%，自然光照，自取食水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法，選取10只作為正常對照組，其余40只進(jìn)行IBS-C模型的復(fù)制，模型復(fù)制過程中死亡10只，將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分組，分別為電針?biāo)膯窝ńM、模型組、非經(jīng)非穴組，每組10只。模型復(fù)制不成功的大鼠未列入實(shí)驗(yàn)分析對象。

1.2 儀器

超純水機(jī)（美國密理博Milli-Q Reference）；程序控制電針治療儀（PCE-A型）；包埋機(jī)（湖北泰微TB-718E）；超薄切片機(jī)（德國徠卡EMUC7）；顯微鏡（日本OLYMPUS）；顯微圖像分析（江蘇捷達(dá)）。

1.3 模型制備與評定

參照改良寒冷-束縛-饑飽失常綜合法復(fù)制IBS-C模型［9］，使大鼠處于長期應(yīng)激狀態(tài)。（1）束縛敷冰法：將冰棒束于大鼠腹部，融化后及時(shí)更換，持續(xù)1 h，期間密切觀察大鼠狀態(tài)。（2）冰水灌胃法：取冰水混合物，按10 mL/kg的劑量灌胃。（3）冰水游泳法：把大鼠置于0℃冰水中游泳，并進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，以防大鼠疲倦淹死。（4）饑飽失常法：每逢單日對大鼠進(jìn)行饑餓處理，正常飲水。以上4種方法，饑飽失常法每天使用，其他3種方法每天使用兩種，如此交替循環(huán)。持續(xù)18 d，若見大鼠糞便變干、變硬、變小，情緒易激惹，毛發(fā)凌亂失去光澤，則說明造模成功［10］。

1.4 治療方法

在前期研究基礎(chǔ)上，選取四單穴：“曲池”、“天樞”、“大腸俞”和“上巨虛”。取穴標(biāo)準(zhǔn)參照常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位［11］?！疤鞓小保耗氈袃蓚?cè)旁開約5 mm處；“大腸俞”：第4腰椎下兩側(cè)旁開7 mm處；“上巨虛”：小腿背外側(cè)上2/5折點(diǎn)處；“曲池”：肘關(guān)節(jié)外側(cè)前部凹陷中。針刺方法：雙側(cè)穴位左右交替針刺。針刺時(shí)大鼠頭尾及四肢使固定，選用1寸毫針，直刺5 mm，并連至PCE-A型程控電針治療儀。電針參數(shù)：電流（IP-P）為1.5 mA，頻率為2 Hz，連續(xù)電針20 min，1日1次。造模成功后連續(xù)3 d電針。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 內(nèi)臟敏感性 內(nèi)臟感覺狀態(tài)可以用腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）的壓力閾值反映。采用無傷害性結(jié)直腸球囊擴(kuò)張實(shí)驗(yàn)測定引起大鼠AWR的最小容量閾值。在測試開始前12 h，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食不禁水，先用少量異氟烷在密閉玻璃罐中輕度麻醉大鼠，然后潤滑8F導(dǎo)尿管，將導(dǎo)管經(jīng)肛門將插入直腸，球囊末端距肛門約為1 cm，將導(dǎo)管綁在鼠尾根部，固定在合適位置，防其脫出。之后將大鼠置于透明固定器內(nèi)，使其在固定器內(nèi)只能進(jìn)行小范圍前后活動(dòng)，大鼠清醒后在籠內(nèi)適應(yīng)20 min，然后用注射器將26～28℃生理鹽水緩慢注入球囊內(nèi)，球囊擴(kuò)張腸道，誘導(dǎo)結(jié)腸收縮膨脹。當(dāng)觀察到腹壁收縮反射時(shí)，記下注射的生理鹽水量，即為該鼠AWR最小容量閾值。間隔15 min重復(fù)操作3次得出平均值。若模型組大鼠AWR最小容量閾值與正常對照組相比明顯降低，說明造模成功。

1.5.2 各組大鼠血清中5-HT、CGRP含量測定 電針干預(yù)后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開大鼠腹腔，從腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液，分裝后-80℃保存［12］。所取血清應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測血清中5-HT、CGRP水平。

1.5.3 各組大鼠結(jié)腸中5-HT、CGRP含量測定 經(jīng)電針干預(yù)后，打開大鼠腹腔，在游離遠(yuǎn)端結(jié)腸組織取樣品1 cm，置于甲醛中保存。用免疫組化檢測，記錄吸光度值并進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述連續(xù)型變量。進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較符合正態(tài)性采用方差分析；方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)Dunnett′T 3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

正常組大鼠狀態(tài)良好。模型組大鼠情緒易激惹，毛發(fā)發(fā)黃且凌亂，食量減少，糞便數(shù)量減少，質(zhì)地變硬，顏色灰白。電針組大鼠糞便質(zhì)地、性狀明顯改善，數(shù)量增多，毛發(fā)變軟，情緒穩(wěn)定。非經(jīng)非穴組電針后無明顯變化。

2.2 AWR最小容量閾值

與正常對照組比較，模型組AWR最小容量閾值降低（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńMAWR最小容量閾值升高（P＜0.05），非經(jīng)非穴組AWR最小容量閾值無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

2.3 電針對各組大鼠血清5-HT及CGRP的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清5-HT及CGRP水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńM大鼠血清5-HT及CGRP水平均降低（P＜0.05），非經(jīng)非穴組血清中5-HT及CGRP水平無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

2.4 電針對各組大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńM大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP水平明顯降低（P＜0.05），非經(jīng)非穴組結(jié)腸5-HT及CGRP水平無明顯變化（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠AWR最小容量閾值（xˉ±s）Tab 1 Minimum AWR volume threshold of rats in each group（xˉ±s）

表2 各組大鼠血清5-HT及CGRP水平比較（n=10，xˉ±s）Tab 2 Serum 5-HT and CGRP concentrations in rats of each group（n=10，xˉ±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸中5-HT及CGRP水平比較（n=10，xˉ±s）Tab 3 Comparison of expression level of 5-HT and CGRP in the colon of rats in each group（n=10，xˉ±s）

2.5 免疫組化結(jié)果分析

大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT、CGRP主要表達(dá)于黏膜層及黏膜下層，著色細(xì)胞呈棕黃色，胞核無色染。與正常組比較，模型組結(jié)腸5-HT、CGRP陽性表達(dá)率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電針?biāo)膯窝ńM結(jié)腸中5-HT、CGRP陽性率表達(dá)均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非經(jīng)非穴組結(jié)腸中5-HT、CGRP陽性表達(dá)率與模型組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖1。

圖1各組大鼠結(jié)腸5-HT、CGRP陽性細(xì)胞的表達(dá)（×400）Fig 1 Expression of 5-HT and CGRP positive cells in the colon of rats in each group（×400）

3 討論

根據(jù)便秘型腸易激綜合征臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“便秘”、“腹痛”的范疇，與飲食不節(jié)、外邪侵襲、情志內(nèi)傷等關(guān)系密切，病位在腸，與肝、脾、胃、腎等臟腑相關(guān)。因其發(fā)病機(jī)制不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療只能緩解癥狀。作為中醫(yī)傳統(tǒng)特色療法之一，針刺治療IBS效果顯著。本研究采取天樞、曲池、上巨虛、大腸俞為治療穴位，并加以電針刺激進(jìn)行觀察。

《針灸甲乙經(jīng)》曰，“…大腸脹者，天樞主之…”。天樞與大腸俞分別為大腸經(jīng)的募穴、背俞穴，為大腸經(jīng)氣輸注及臟腑經(jīng)氣匯聚之處，因此二穴均可調(diào)節(jié)胃腸功能。《靈樞·衛(wèi)氣》曰“……氣在胸者，止之膺與背俞。氣在腹者，止之背俞……”，俞募配穴亦可發(fā)揮協(xié)同作用?！夺樉募滓医?jīng)》記載“…大腸又熱，腸鳴腹?jié)M，俠臍痛，食不化，……巨虛上廉主之……”。上巨虛是大腸之下合穴，發(fā)于足陽明脈氣，可通調(diào)腸腑、理氣和胃。曲池為大腸經(jīng)之合穴，“合”者匯合，該處氣血充盛，且“經(jīng)脈所過，主治所及”，故曲池可以治療大腸疾病。以上諸穴合用，效果更佳。

5-HT是一種重要的調(diào)節(jié)消化道功能的神經(jīng)遞質(zhì)，與腸道內(nèi)的受體結(jié)合后會刺激胃腸蠕動(dòng)，引發(fā)腸道分泌、運(yùn)動(dòng)等，并與內(nèi)臟的高敏感性聯(lián)系緊密［13］。CGRP是具有神經(jīng)遞質(zhì)等多重功能的神經(jīng)肽，可對胃腸道黏膜的分泌以及運(yùn)動(dòng)等功能進(jìn)行有效調(diào)節(jié)［14］。據(jù)研究，CGRP通過作用于腸段肌肉以及刺激相關(guān)神經(jīng)元釋放抑制型遞質(zhì)從而對胃腸道運(yùn)動(dòng)起抑制作用［15-17］。生理狀態(tài)下，5-HT、CGRP合理地參與胃腸功能，使胃腸代謝處于穩(wěn)定的狀態(tài)。而水平異常升高的5-HT和CGRP，不僅會使胃腸功能的調(diào)控能力受損，還會造成了內(nèi)臟高度敏感［18］。內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是IBS標(biāo)志性特點(diǎn)，在炎癥、應(yīng)激等持續(xù)狀態(tài)下，胃腸相關(guān)神經(jīng)末梢被過度刺激，功能也持續(xù)敏感，5-HT、CGRP都參與了這個(gè)高敏化進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠AWR最小容量閾值明顯低于正常組，說明IBS-C模型復(fù)制成功，而與模型組相比，電針?biāo)膯窝ńMAWR最小容量閾值顯著升高。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組血清5-HT、CGRP水平與正常組相比明顯增高，電針?biāo)膯窝ńM與模型組相比血清5-HT、CGRP水平顯著下降。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，電針?biāo)膯窝ńM結(jié)腸5-HT、CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)顯著降低。說明電針?biāo)膯窝軌蝻@著降低IBS-C模型結(jié)腸和血清中5-HT、CGRP的水平，增強(qiáng)相應(yīng)受體及重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，改善內(nèi)臟敏感狀態(tài)［19］。

本研究關(guān)于電針作用機(jī)制探討還不夠深入，因此，針刺干預(yù)便秘型腸易激綜合征大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)作用機(jī)制研究將成為今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容。