榴蓮核黃酮的提取及其對(duì)秀麗隱桿線蟲 氧化和衰老的影響

王 鳳，肖楚翔，劉淑珍，王鳳舞*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

人口老齡化已成為全球最為關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一，有報(bào)道稱預(yù)計(jì)再過30 年全球?qū)?huì)迎來21億老年人口，因此“衰老”和“抗衰老”成為多數(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。 β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是老年斑的重要組分，其過度產(chǎn)生和聚集會(huì)誘使氧化穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生大量的自由基和過氧化物，使得機(jī)體表現(xiàn)出氧化和衰老癥狀。天然產(chǎn)物可從調(diào)控衰老基因、抗氧化、減少蛋白質(zhì)沉積等方面抗衰老及治療衰老相關(guān)疾病[2]，如有學(xué)者確定了半枝蓮的黃酮類物質(zhì)可上調(diào)抗氧化基因mRNA表達(dá)水平，從而達(dá)到抗衰老的效果[3]；有學(xué)者確定了地黃花通過提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性來加強(qiáng)抗氧化作用，從而延緩衰老[4]；還有學(xué)者確定了六味地黃丸乙醇提取物能夠通過減少Aβ沉積緩解氧化、延緩衰老[5]等。

榴蓮風(fēng)味獨(dú)特，被稱為“南洋水果之王”，其具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，經(jīng)常食用可以強(qiáng)身健體、健脾補(bǔ)氣、補(bǔ)腎壯陽、活血散寒[6]。目前對(duì)榴蓮的研究主要集中在果肉和果殼上，已有研究者在榴蓮果殼中提取得到了總黃酮[7-9]。黃酮類化合物種類和數(shù)量眾多，其中黃酮和黃酮醇最為常見，含量最多的槲皮素對(duì)氧化衰老具有較強(qiáng)的生物活性。目前對(duì)榴蓮核的研究鮮見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)榴蓮核進(jìn)行了黃酮類物質(zhì)的提取和延緩衰老效果的初探，以期對(duì)榴蓮的全面開發(fā)和藥用價(jià)值的利用提供參考。

秀麗隱桿線蟲又稱秀麗線蟲，是一種身體通透、非寄生、全長約1 mm、結(jié)構(gòu)簡單、繁殖力強(qiáng)、以細(xì)菌為食且培養(yǎng)成本低的模式生物[10]；其生命周期短，卵在常溫下發(fā)育為成蟲只需3～4 d[11]；其生命力強(qiáng)，逆境條件下可進(jìn)入Dauer狀態(tài)，待外界條件滿足生存需求時(shí)便可直接從Dauer期進(jìn)入到L4期；其遺傳背景清晰，是第一個(gè)被闡明全部基因組序列的真核多細(xì)胞生物[12]；且已被鑒定出有60%～80%的基因同人類基因同源[13-14]。由于秀麗隱桿線蟲具有以上多種優(yōu)勢(shì)，其作為模式生物已被廣泛應(yīng)用于人類復(fù)雜疾病的研究并發(fā)展成為藥物開發(fā)的工具。

本實(shí)驗(yàn)通過研究最佳提取工藝條件下榴蓮核黃酮提取物的體外抗氧化性以及體內(nèi)對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響，探討榴蓮核黃酮抗氧化衰老的作用效果，以期為活性物質(zhì)的篩選研究提供依據(jù)，也為榴蓮的全面認(rèn)識(shí)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榴蓮購于青島城區(qū)大潤發(fā)超市，取榴蓮核備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉 英國OXOID公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；膽固醇、硫酸鎂、氯化鈣 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)公司；秀麗隱桿線蟲株系CL4176和大腸桿菌株系OP50（尿嘧啶滲漏突變株） 美國明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲遺傳中心。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1D-80冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；KQ-500TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司； WFZUV-2000分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司； LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱 龍口市先科儀器 公司；生物顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

榴蓮核洗凈，瀝干，切片后冷凍干燥3 d，研磨，過60 目篩，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 榴蓮核中總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取0.1 g榴蓮核粉末，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液和0.5 g硫酸銨形成雙水相[15-17]，浸泡30 min后在350 W功率下超聲70 min，然后6000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中用乙醇溶液定容，備用。

1.3.3 榴蓮核中總黃酮提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確量取待測(cè)液10 mL于25 mL比色管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液10 mL，然后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容到25 mL，混勻后靜置15 min；采用紫外分光光度法測(cè)定其510 nm波長處的吸光度[18-19]。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（Y＝0.0118X-0.0034，決定系數(shù)R2＝0.999，其中Y代表吸光度，X代表蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（μg/mL）） 可以得出樣品提取液中的蘆丁含量，按照下列公式計(jì)算出待測(cè)液中總黃酮的提取率。

式中：ρ為將總黃酮提取液所測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程所對(duì)應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為測(cè)定總黃酮含量時(shí)的取樣體積/mL；V1為總黃酮提取液的體積/mL；V2為測(cè)定總黃酮含量時(shí)的定容體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品于6 支錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液5、10、15、20、25、30 mL，參照1.3.2節(jié)方法，考察料液比對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響。并參照上述步驟，考察超聲時(shí)間（40、50、60、70、80、90 min）、超聲功率（250、300、350、400、450 W）、硫酸銨用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g）以及乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80 %）對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件[20]，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Code and level of independent variables used for L9 (34) orthogonal array design

1.3.6 體外抗氧化活性的測(cè)定

采用分光光度法、鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法分別測(cè)定榴蓮核黃酮提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力，具體測(cè)定方法分別參考文獻(xiàn)[21-23]。

1.3.7 線蟲培養(yǎng)和同期化

線蟲的培養(yǎng)使用線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），其上涂布有大腸桿菌OP50作為線蟲的食物，于16 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.8 線蟲壽命的測(cè)定

壽命的測(cè)定主要是用來判斷黃酮提取物在抗氧化的同時(shí)是否會(huì)延長或縮短線蟲的壽命。將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線蟲孵化生長至L4期后升溫至23 ℃，升溫培養(yǎng)可加速線蟲衰老，縮短生命周期，28 h后開始觀察秀麗隱桿線蟲的存活狀態(tài)，通過更換培養(yǎng)基的方式每天計(jì)數(shù)死亡、丟失和存活線蟲的條數(shù)，直至空白組和樣品組的線蟲死亡完全[25-26]。

1.3.9 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)將線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù)作為秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的衡量標(biāo)準(zhǔn)，以此判斷黃酮提取物在抗氧化的同時(shí)，是否會(huì)對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)能力造成影響。將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線蟲孵化生長至L4期后升溫至23 ℃，28 h后將秀麗隱桿線蟲挑取至未涂大腸桿菌OP50的空白NGM培養(yǎng)基上，使其在爬行過程中除掉蟲身黏附的菌，再將線蟲轉(zhuǎn)移至另一空白培養(yǎng)基，記錄1 min內(nèi)線蟲頭部擺動(dòng)的次數(shù)，每天記錄運(yùn)動(dòng)次數(shù)，直至運(yùn)動(dòng)能力喪失[27]。將線蟲頭部從一側(cè)擺回另一側(cè)，再擺動(dòng)回來定義為一次頭部擺動(dòng)。每組至少測(cè)定20 條秀麗隱桿線蟲。

1.3.10 生殖能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)生殖能力的測(cè)定主要是通過判斷黃酮提取物對(duì)線蟲子代數(shù)目的影響從而來評(píng)判樣品在抗氧化的同時(shí)是否會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲的子代產(chǎn)生抑制作用。具體處理方法同1.3.8節(jié)線蟲壽命測(cè)定。每組挑取2 條線蟲單獨(dú)飼養(yǎng)，每天觀察線蟲產(chǎn)卵情況，產(chǎn)第一顆卵的時(shí)間記為生殖能力實(shí)驗(yàn)第1天。每24 h將線蟲轉(zhuǎn)至新板，直至生殖能力喪失。16 ℃下孵育產(chǎn)卵板，48 h后計(jì)數(shù)子代數(shù)目。

1.3.11 癱瘓緩解實(shí)驗(yàn)

翻譯要求分析：校園宣傳語具有啟發(fā)教育性、藝術(shù)審美性等特點(diǎn)，校園宣傳語語體也有其自身的語體風(fēng)格和修辭藝術(shù)。以簡明優(yōu)美的語言打動(dòng)人，以新穎形象的創(chuàng)意吸引人，以真摯生動(dòng)的情感感染人。翻譯過程中，譯者如果只是考慮譯文要忠實(shí)于源文，而忽略受眾、語體、修辭手法等因素，譯文有可能無法滿足這些要求，翻譯往往缺乏充分性。

將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線蟲孵化生長至L4期后升溫至23 ℃，28 h后開始觀察秀麗隱桿線蟲是否癱瘓，每2 h計(jì)數(shù)一次癱瘓條數(shù)，直至全部癱瘓[28-30]。癱瘓的判斷依據(jù)：線蟲狀態(tài)活躍，可正常運(yùn)動(dòng)計(jì)為正常；機(jī)械性刺激線蟲尾部不再做曲線運(yùn)動(dòng)，身體不能移動(dòng)，僅做頭部擺動(dòng)計(jì)為癱瘓。培養(yǎng)28 h后用1 mL的M9緩沖液將平板上的線蟲沖洗并收集至EP管中，4200 r/min離心2 min，棄上清液，并加入150 μL含有體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L pH 7.4），于4 ℃固定24 h后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，加入150 μL含有體積分?jǐn)?shù)5%β-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的125 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl， 于37 ℃孵育24 h后漂洗，用0.125%硫黃素T-50%乙醇染色2 min，再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液脫色制片后便可在熒光顯微鏡下對(duì)Aβ沉積情況進(jìn)行觀察分析。

1.3.12 體內(nèi)抗氧化酶活力測(cè)定

將同期化并升溫處理后的線蟲用M9緩沖液沖洗并收集至EP管中，1000r/min離心10 min，棄上清液，然后用磷酸鹽緩沖液重懸，冰上勻漿，最終制成體積分?jǐn)?shù)5%線蟲勻漿。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書對(duì)秀麗隱桿線蟲勻漿液中SOD活力、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并作圖，采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析結(jié)果

通過圖1A可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨料液比的增加而增加，但到達(dá)一定的比值時(shí)，提取率趨于平穩(wěn)?？赡艿脑蚴牵裆徍酥锌傸S酮的溶出率隨溶劑的增加而增大，當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，總黃酮全部溶出，含量達(dá)到最大。通過圖1B可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨超聲時(shí)間的延長而增加，但超過一定的時(shí)間，提取率隨時(shí)間的延長反而下降。原因可能是延長超聲時(shí)間可提高榴蓮核中總黃酮的析出，但當(dāng)超聲時(shí)間過長時(shí)，溶出的總黃酮發(fā)生分解從而提取率下降。通過圖1C可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨超聲功率的增加而逐漸增加，但超過一定的超聲功率其提取率反而下降。這可能是由于超聲對(duì)植物細(xì)胞有很好的破碎功能，隨著功率的增加，加大了榴蓮核細(xì)胞的破碎程度，所以增加了總黃酮的溶出量。但是當(dāng)超聲功率過大時(shí)，又會(huì)造成總黃酮的分解或氧化，從而造成提取率下降。通過圖1D可以看出，榴蓮核總黃酮的溶出量隨著硫酸銨用量的增加而增加，當(dāng)硫酸銨達(dá)到一定用量時(shí)，其提取率趨于平穩(wěn)。這可能是因?yàn)榱蛩徜@起到的作用是與乙醇構(gòu)成雙水相體系，對(duì)提取榴蓮核中總黃酮起到協(xié)同作用。通過圖1E可以看出，榴蓮核總黃酮隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，但當(dāng)乙醇超過一定體積分?jǐn)?shù)時(shí)，其提取率反而下降。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加使得溶劑極性增強(qiáng)，有利于總黃酮的超聲提取，從而提高了總黃酮的提取率。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，榴蓮核中一些脂溶性物質(zhì)的溶出量也會(huì)隨之增加，反而抑制了總黃酮的溶出。綜上，單因素試驗(yàn)中最佳料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、硫酸銨用量和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1∶200、70 min、350 W、0.5 g以及40%。

圖 1 各因素對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響Fig. 1 Effect of various factors on the extraction rate of total flavonoids from durian seeds

2.2 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

由表2可知，不同的工藝條件對(duì)榴蓮核總黃酮的提取率存在一定的差異，其中最高提取率是最低提取率的1.33 倍。通過極差分析可以得知，各因素對(duì)榴蓮核 總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)槌暪β剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞料液比，榴蓮核總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比為1∶220、超聲時(shí)間為70 min、超聲功率為400 W。在最優(yōu)條件下進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)，平均提取率為（9.25±0.05）%。表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理可行，數(shù)據(jù)可靠，適合榴蓮核中總黃酮的提取。

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9 (34) orthogonal array design with experimental results

2.3 榴蓮核總黃酮提取物體外抗氧化活性

由表3可知，榴蓮核中的總黃酮提取物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（92.6%），相同質(zhì)量濃度下，效果優(yōu)于陽性對(duì)照VC（73.1%）；具有相對(duì)較高的羥自由基清除率（79.4%），相同質(zhì)量濃度下，效果與陽性對(duì)照VC（87.5%）相當(dāng)；且對(duì)超氧陰離子自由基也有一定的清除效果（27.0%）。結(jié)果表明榴蓮黃酮提取物具有很高的體外抗氧化能力，因此進(jìn)一步考察其是否具有體內(nèi)延緩衰老的功效。

表 3 榴蓮核總黃酮對(duì)自由基的清除率Table 3 Free radical scavenging rates of total flavonoids from durian seeds

2.4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲氧化衰老的影響

2.4.1 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

秀麗隱桿線蟲的平均壽命是14～21 d，由圖2可知，升溫培養(yǎng)加速了線蟲的衰老，縮短了線蟲的生長周期。但黃酮提取物樣品組與只喂食大腸桿菌OP50空白組線蟲的壽命不同，樣品能使線蟲生存曲線右移，生命周期較空白組延長了約20%，這說明榴蓮核黃酮提取物能明顯延長線蟲的壽命。

圖 2 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線蟲壽命的影響 Fig. 2 Effect of flavonoids extract from durian seeds on the lifespan of C. elegans

圖 3 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig. 3 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the mobility of C. elegans

2.4.2 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響由圖3可知，兩組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力均隨著時(shí)間的延長而下降，這是因?yàn)榫€蟲體內(nèi)氧化程度超出了自身的清除能力，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡使線蟲逐步達(dá)到衰老狀態(tài)，進(jìn)而使其運(yùn)動(dòng)能力被削弱。但是黃酮提取物組秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率均高于只喂食大腸桿菌OP50空白組，且與空白組相比，樣品組隨著時(shí)間延長呈現(xiàn)出效果逐漸明顯的趨勢(shì)。這說明在一定時(shí)間范圍內(nèi)黃酮提取物能夠緩解運(yùn)動(dòng)能力下降程度，即黃酮提取物在延緩線蟲衰老、提高運(yùn)動(dòng)能力方面具有重要潛力。

2.4.3 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響

圖 4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線蟲生殖能力的影響Fig. 4 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the fertility of C. elegans

本實(shí)驗(yàn)主要是通過每天計(jì)數(shù)子代數(shù)目評(píng)判黃酮提取物起抗氧化作用的同時(shí)對(duì)子代的影響。由圖4可知， 線蟲產(chǎn)卵期一般持續(xù)4 d左右，且第2天為產(chǎn)卵高峰期。只喂食大腸桿菌OP50空白組與喂食黃酮提取物樣品組線蟲相比，后者在第1天和第2天的產(chǎn)卵量要高于前者，兩者無顯著差異；在第3天時(shí)，空白組和樣品組線蟲的產(chǎn)卵量均明顯下降；在第4天時(shí)，兩組線蟲均完成產(chǎn)卵，總產(chǎn)卵量均為220 個(gè)左右，無顯著性差異（P＞0.05）。這說明榴蓮核黃酮提取物在緩解氧化損傷、延緩衰老的同時(shí)并不會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲的生殖能力造成顯著傷害。

2.4.4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲癱瘓緩解能力的影響

一方面，升溫培養(yǎng)加速了線蟲的氧化和衰老且縮短了其生長周期，使實(shí)驗(yàn)得以較快、較準(zhǔn)確的完成；另一方面，升溫可誘導(dǎo)模式生物秀麗隱桿線蟲CL4176體內(nèi)表達(dá)Aβ，Aβ為氧化衰老反應(yīng)的產(chǎn)物，其在體內(nèi)聚集使得線蟲出現(xiàn)癱瘓表型，所以可通過觀察癱瘓表型的變化判斷榴蓮核黃酮提取物能否緩解或抑制Aβ毒性，緩解氧化損傷。由圖5可知，在癱瘓緩解能力測(cè)定中，通過對(duì)線蟲癱瘓率的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在第1天時(shí)空白組和樣品組均未出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象；在第2～5天時(shí)，兩組均持續(xù)癱瘓但喂食榴蓮核黃酮提取物組秀麗隱桿線蟲的癱瘓率明顯低于空白組。由圖6可知，黃酮提取物能夠明顯改善線蟲體內(nèi)Aβ沉積情況。這說明，榴蓮核黃酮提取物能夠緩解Aβ毒性，降低線蟲CL4176癱瘓率。

圖 5 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線蟲癱瘓緩解能力的影響Fig. 5 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the paralysis relief of C. elegans

圖 6 線蟲體內(nèi)Aβ沉積情況Fig. 6 Aβ aggregation in C. elegans

2.4.5 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化酶活力的影響

鑒于榴蓮核黃酮提取物能夠緩解線蟲氧化損傷病癥，進(jìn)一步分析其對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶的影響。 由圖7A可知，在線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的測(cè)定中，喂食榴蓮核黃酮提取物的線蟲組具有更高的SOD活力，較空白組線蟲而言，樣品組顯著提高了27.91%（P＜0.05）。由圖7B可知，在CAT活力測(cè)定中，空白組和樣品組線蟲的CAT活力分別為163.00 U/g和177.72 U/g，樣品組較空白組提高了8.28%。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的一種天然產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用為脂質(zhì)氧化的指標(biāo)，由圖7C可知，喂食榴蓮核黃酮提取物的線蟲組具有更低的MDA含量，較空白組線蟲的MDA含量而言，樣品組極顯著降低了30.77%（P＜0.01）。表明榴蓮核黃酮提取物在一定程度上能夠提高線蟲體內(nèi)抗氧化能力，緩解氧化損傷，緩解線蟲衰老。

圖 7 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線蟲體內(nèi)SOD活力（A）、CAT活力（B）和MDA含量（C）的影響 Fig. 7 Effect of flavonoid extract from durian seeds on SOD activity (A), catalase activity (B) and MDA content (C) in C. elegans

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定榴蓮核黃酮提取物的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比為1∶220、超聲時(shí)間為70 min、超聲功率為400 W。在最優(yōu)條件下進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)，榴蓮核總黃酮平均提取率可達(dá)（9.25±0.05）%。

最優(yōu)條件下獲得的榴蓮核黃酮提取物具有一定的體外抗氧化活性，其具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力以及較高的羥自由基清除率，對(duì)超氧陰離子自由基也有較好的清除效果，清除率分別達(dá)到92.6%、79.4%和27.0%。

榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲的氧化損傷和衰老具有一定的保護(hù)作用。黃酮提取物樣品組與空白組的線蟲相比，樣品組線蟲的生存曲線右移，即黃酮提取物對(duì)延緩衰老、延長壽命起到了積極的作用；樣品組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力均高于空白組，且隨著時(shí)間延長樣品效果趨于顯著，即黃酮提取物在一定程度上能夠延緩衰老、提高運(yùn)動(dòng)能力；線蟲的生殖期為4 d左右，這段時(shí)間內(nèi)兩組線蟲呈現(xiàn)出不同的產(chǎn)卵量，但兩組總產(chǎn)卵量均在220 個(gè)左右，即榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲的后代不會(huì)產(chǎn)生顯著影響，對(duì)提取物的功效可進(jìn)一步的研究與運(yùn)用；樣品組的線蟲癱瘓率要低于空白組，表示榴蓮核黃酮提取物能夠減少Aβ沉積，緩解氧化損傷；而且樣品組線蟲的體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活力高于空白組，表示榴蓮核黃酮提取物具有較好的體內(nèi)抗氧化效果。

綜上，本實(shí)驗(yàn)為榴蓮核黃酮提取物的抗氧化、抗衰老研究提供參考，同時(shí)有助于對(duì)榴蓮的全面認(rèn)識(shí)和開發(fā)。