應用Illumina NovaSeq測序技術比較3 種雜糧 對大鼠腸道菌群的影響

王 勇，宋 歌，龐邵杰，綦文濤*

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

我國雜糧種類和產量位居世界第一，雜糧產量約占世界雜糧總產量的17%，占國內糧食總產量的10%。越來越多證據表明膳食燕麥、蕎麥、小米等雜糧對降低人體慢性疾病發(fā)病風險具有重要作用，可調節(jié)血糖、降低血脂、降低血壓、預防冠心病及結腸癌等疾病[1-2]。腸道菌群失調可導致多種疾病，如肥胖、肝臟疾病和炎癥性腸道疾病[3]。飲食習慣是影響人體腸道菌群多樣性的主要因素，研究表明，非洲農村兒童因食用小米、高粱等雜糧，較歐洲兒童腸道菌群多樣性和腸道短鏈脂肪酸含量更高[4]。從腸道菌群角度探索雜糧/全谷物的健康功能機制已成為近年來食品營養(yǎng)學領域研究的新熱點[5-6]，相關基礎研究對指導國民健康膳食尤為重要。

燕麥、蕎麥等雜糧富含的膳食纖維和多酚可提高腸道菌群多樣性，促進腸道特定產短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）菌的生長，維持腸道結構完整性，調節(jié)脂類代謝，從而緩解肥胖和2型糖尿病癥狀[7-8]。β-葡聚糖為燕麥中主要益生元，進入結腸后可被腸道菌群利用，其作為常見膳食纖維具有降低膽固醇和餐后血糖、減輕胰島素抵抗和代謝綜合征等作用[9]。苦蕎中富含的抗性淀粉，具有提高腸道益生菌豐度、降低血液膽固醇和甘油三酯濃度的功效[10]。值得注意的是，純化的膳食纖維不具有全谷物增加腸道菌群多樣性的活性，可能是由于全谷物中的多種營養(yǎng)素間的協(xié)同作用發(fā)揮功效[11]。除了膳食纖維，雜糧富含黃酮、酚酸等多酚類物質，多酚作為重要的益生元，與腸道菌群的互作機制及對腸道健康的影響也受到越來越多的關注[12-13]。

升級后的Illumina NovaSeq測序平臺可實現(xiàn)雙端測序的PE250策略，測序通量高、深度大，成為更適用于16S擴增子測序的新平臺。本研究通過分析飼喂含不同雜糧飼料的大鼠體質量、攝食量、能量攝入、肝臟和結腸結構差異等，檢測結腸內容物中SCFAs含量，通過Illumina NovaSeq高通量測序平臺對大鼠結腸細菌16S rRNA V4區(qū)進行定性分析，從操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）、不同水平物種組成分析、主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）等方面系統(tǒng)闡釋攝食熟化后的燕麥、蕎麥和小米對大鼠結腸菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5 周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。

燕麥（裸燕麥，‘壩莜1號’）購自河北省張家口張北縣；蕎麥（苦蕎，‘川蕎1號’）購自四川省涼山彝族自治州；小米（‘晉谷21號’）購自山西省呂梁興縣；AIN-93G標準維持飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；含燕麥、蕎麥和小米飼料訂制于南通特洛菲飼料科技有限公司。燕麥、蕎麥和小米均經蒸煮、烘干后添加至飼料，飼料配方和熱量密度如表1所示。

表 1 飼料配方和熱量密度Table 1 Compositions and energy density of the diets employed in this study g/100 g

甲醇、甲酸（色譜純） 美國Thermo-Fisher Scientific公司；3-硝基苯肼、2,6-二叔丁基對甲酚 （色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC I-CLASS高效液相色譜儀、C18BEH色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Xevo TQ-S Micro質譜檢測儀 美國Waters公司；ML4002電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；DW-86L338型-80 ℃超低溫 冰箱 青島海爾集團；3-30K高速冷凍離心機 德國希格瑪實驗室離心機公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及飼養(yǎng)

48 只SPF級雄性SD大鼠，用AIN-93G標準維持飼料預飼1 周后，按體質量隨機分為4 組，每組12 只：空白對照組（飼喂標準維持飼料）、燕麥組（飼喂含22%（質量分數，下同）燕麥的飼料）、蕎麥組（飼喂含22%蕎麥的飼料）、小米組（飼喂含22%小米的飼料）。大鼠飼養(yǎng)于國家糧食和物資儲備局科學研究院昌平實驗基地SPF級動物房，實驗周期為12 周，飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，維持室內溫度（23±2）℃、相對濕度60%、12 h晝夜循環(huán)采光。每周稱量并記錄體質量，每兩天記錄攝食量，每隔2～3 d更換一次墊料。

1.3.2 標本采集及處理

飼養(yǎng)12 周后稱量大鼠體質量，CO2麻醉后，心臟取血。斷頸處死大鼠，將大鼠轉移至超凈工作臺內，使用體積分數75%的乙醇溶液擦拭大鼠腹部，使用消毒后的手術剪打開大鼠腹腔，迅速將肝臟、腸道完整分離出來，取部分肝臟和結腸組織用于病理檢測，其余部分保存于 -80 ℃待測。結腸內容物保存于滅菌后的EP管中，液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存，用于提取腸道菌群DNA。

1.3.3 組織學觀察

1.3.3.1 肝臟組織學觀察

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色：分離1 cm×1 cm肝臟右葉浸泡于質量分數10%甲醛溶液中，石蠟包埋后進行組織切片制備和HE染色。光學顯微鏡下觀察脂肪空泡、肝細胞基本結構及炎細胞浸潤情況等。

油紅O染色：分離1 cm×1 cm肝臟右葉，液氮冷凍制作切片，進行油紅O溶液染色（0.5 g/100 mL，溶解于異丙醇中）。將切片置于光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化，參照中華肝病學會脂肪肝病診斷標準進行切片評分。

1.3.3.2 結腸組織學觀察

部分結腸組織經體積分數10%甲醛溶液浸泡后進行石蠟包埋、切片制備與HE染色。光學顯微鏡下觀察結腸組織形態(tài)。

1.3.4 大鼠腸道菌群分析

1.3.4.1 大鼠結腸內容物高通量測序分析

大鼠結腸內容物樣品（每組隨機取8 個）從-80 ℃冰箱取出后立刻放入干冰，送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司，采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺，通過擴增細菌16S rRNA基因的V4區(qū)域基因序列分析大鼠結腸菌群多樣性。

1.3.4.2 生物學信息分析

基于有效數據進行OTU聚類和物種分類分析，根據OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、韋恩圖分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，對OTUs進行多序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)生樹，進一步得到不同樣品和分組的群落結構差異，通過PCoA降維圖和樣品聚類樹進行分析，并選用LEfSe方法對分組樣品的物種組成和群落結果進行差異顯著性檢驗。

1.3.5 大鼠結腸內容物SCFAs含量的測定

稱取樣本約80 mg，加入250 μL水、250 μL甲醇，漩渦提取30 min。13200 r/min離心取上清液50 μL，加入50 μL內標（質量濃度5 μg/mL同位素標記的丙酸）、50 μL衍生試劑（200 μmol/L 3-硝基苯肼），常溫衍生30 min，加入50 μL質量濃度2 μg/mL抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚，漩渦10 s。13200 r/min離心10 min，取上清液檢測，采用液相色譜-質譜聯(lián)用外標法進行檢測和定量。

流動相A：含體積分數0.1%甲酸的去離子水；流動相B：甲醇。梯度洗脫：0～2 min，90%～80% A；2～9 min，80%～40% A；9～10 min，40%～5% A；10～11 min，5%～0%；11～11.1 min，0～90%；11.1～13 min，90%。檢測條件：流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，柱溫45 ℃。

質譜條件：毛細管電壓2.7 kV、錐孔電壓30 V、錐孔流速20 L/h、離子源溫度150 ℃、離子化溫度450 ℃、離子化氣流流速1000 L/h。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

使用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA和Duncan’s test分析差異顯著性，P＜0.05時被認為差異具有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 燕麥、蕎麥和小米特征功能活性成分檢測結果

雜糧的健康作用與其含量豐富的功能活性物質密切相關。本研究所選取的燕麥中β-葡聚糖質量分數為（4.19±0.42）%。蕎麥中總黃酮質量分數為（1.76±0.06）%（以蘆丁計），抗性淀粉質量分數為（0.39±0.01）%。小米中VB1含量為（0.27±0.04）mg/100 g， 總膳食纖維質量分數為（2.16±0.02）%，粗脂肪質量分數為（4.40±0.36）%。與前期報道的3 種雜糧特征功能活性成分含量[14-16]基本一致，因此，本研究所選取雜糧品種具有代表性。

2.2 燕麥、蕎麥和小米對大鼠體質量、攝食量和能量 攝入的影響

表 2 大鼠體質量、攝食量和能量攝入Table 2 Body mass, food intake and energy intake of rats

如表2所示，空白對照組、燕麥組、蕎麥組和小米組大鼠初始體質量基本相同（P＞0.05）。處死前第12周時，蕎麥組大鼠的體質量最大，與空白對照組相比增長6.99%，但無顯著性差異（P＞0.05），與Peng Lianxin等[17]研究結果一致，飼喂蕎麥可增加高脂飲食大鼠體質量。燕麥組、蕎麥組和小米組攝食量及能量攝入均與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。表明添加3 種雜糧均未影響大鼠的正常生長。

2.3 燕麥、蕎麥和小米對大鼠肝臟結構影響

圖 1 飼喂燕麥、蕎麥和小米對正常大鼠肝臟組織的影響Fig. 1 Effects of oats, tartary buckwheat and foxtail millet supplementation on liver histology in normal rats

如圖1所示，空白對照組、燕麥組和小米組大鼠肝小葉結構存在，肝小葉內肝細胞無水腫，10%肝細胞微泡性脂肪變性，偶見點狀肝細胞壞死和很少量單核淋巴細胞灶狀浸潤，未見肝細胞嗜酸性變，肝血竇輕度淤血，未見肝Kupffer細胞增生，匯管區(qū)未見炎細胞浸潤；油紅O染色顯示空白對照組、燕麥組和小米組10%的肝細胞內可見紅染的細小脂滴。蕎麥組大鼠未見肝細胞脂肪變性，油紅O染色顯示肝細胞內未見紅染的脂滴，表明膳食蕎麥具有一定預防肝細胞脂肪變性的作用。

2.4 燕麥、蕎麥和小米對大鼠結腸組織結構的影響

圖 2 飼喂燕麥、蕎麥、小米對正常大鼠結腸組織的影響Fig. 2 Effects of oats, tartary buckwheat and foxtail millet supplementation on colon histology in normal rats

如圖2所示，空白對照組大鼠結腸黏膜無損傷，未見隱窩膿腫，杯狀細胞無減少，腸壁內未見炎細胞浸潤。燕麥組大鼠結腸黏膜無損傷，未見隱窩膿腫，杯狀細胞無減少，黏膜層內很少量單核淋巴細胞散在浸潤。蕎麥組大鼠結腸黏膜無損傷，未見隱窩膿腫，杯狀細胞無減少，黏膜層和黏膜下層可見中等量單核淋巴細胞灶狀浸潤。小米組大鼠結腸黏膜無損傷，未見隱窩膿腫，杯狀細胞輕微減少，腸壁全層中等量單核淋巴細胞灶狀浸潤。綜上，飼料中添加3 種雜糧后，大鼠結腸結構保持正常的形態(tài)，未出現(xiàn)明顯病變。

2.5 燕麥、蕎麥和小米對大鼠結腸菌群的影響

2.5.1 結腸菌群OTU數量

韋恩圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種（如OTU）數目，由圖3可知，4 組大鼠結腸內容物樣本共產生724 個OTU，燕麥組的OTU數量最多（559 個），蕎麥組的OTU數量其次（540 個），空白對照組和小米組的OTU數量均為508 個，4 組樣品的共有物種為390 個，燕麥組特有物種數量最多（59 個）。由此可見，飼喂燕麥后大鼠結腸菌群會增加新的物種，結腸菌群的多樣性得到提升。

圖 3 大鼠結腸菌群OTU的韋恩圖Fig. 3 Venn diagram showing unique and shared colonic flora in normal rats supplemented with different kinds of coarse cereals

2.5.2 基于門分類水平分析結果

圖 4 大鼠結腸菌群門水平物種組成分析Fig. 4 Analysis of colonic microbiota composition at the phylum level in normal rats

本實驗通過Illumina NovaSeq測序技術分析了大鼠結腸內容物的菌群，重點分析飼喂燕麥、蕎麥和小米對門水平和屬水平上大鼠結腸菌群組成的影響。由圖4可知，各組樣本生成的OTU主要由5 個菌門構成：厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門、疣微菌門和擬桿菌門占絕對主導地位。燕麥組厚壁菌門相對豐度與對照組無顯著差異（P＞0.05），蕎麥組和小米組使厚壁菌門相對豐度分別提高23.29%和30.03%，使疣微菌門相對豐度分別下降41.05%和55.48%，使擬桿菌門相對豐度分別下降49.87%和58.58%。據報道2型糖尿病患者糞便菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值下降，這是腸道菌群失調的重要標志之一[18]。Martínez等[19]研究發(fā)現(xiàn)，28 個健康受試者每天食用60 g全谷物大麥、糙米、大麥與糙米復合物（質量比1∶1），4 周后3 組受試者糞便中菌群多樣性顯著增加，厚壁菌門/擬桿菌門比值增加。

2.5.3 基于屬分類水平的分析結果

由圖5可知，在屬水平上，各組優(yōu)勢菌群主要有阿克曼氏菌屬、瘤胃菌科未定屬（unidentified_Ruminococcaceae）、布勞特氏菌屬（Blautia）、擬桿菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）和羅姆布茨菌屬（Romboutsia）等。飼喂燕麥、蕎麥和小米會影響大鼠結腸菌群屬水平上的組成，結果分析表明攝食燕麥顯著增加乳桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對豐度，攝食蕎麥和小米顯著降低阿克曼氏菌屬相對豐度，攝食小米顯著增加布勞特氏菌屬豐度。膳食全谷物人群腸道厚壁菌門中布勞特氏菌屬、乳桿菌屬和放線菌門中柯林斯菌屬（Collinsella）豐度增加[20]。乳桿菌屬不同菌種具有顯著的益生效果，包括抑制致病菌，改善腸道菌群結構，促進腸上皮細胞增殖，增強機體免疫功能，改善血脂，抗氧化等功效[21]。燕麥組和小米組使乳桿菌屬相對豐度分別提高196.40%和48.65%。大量研究表明腸道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的豐度與宿主患肥胖、2型糖尿病、炎癥性腸病等呈負相關，嗜黏蛋白阿克曼氏菌在代謝炎癥、屏障功能和脂肪儲存中起關鍵作用，其定植情況是反映機體健康水平的標志之一[22-23]。擬桿菌屬豐度升高與結腸直腸癌、肝病等多種疾病相關，本實驗中攝食燕麥、蕎麥和小米分別使擬桿菌屬相對豐度下降38.53%、51.98%和57.29%。針對中國健康年輕人群的腸道菌群結構特征分析研究表明，布勞特氏菌屬具有在人體腸道內發(fā)酵產生SCFAs的能力，其主要參與丁酸鹽的產生[24]。因此，本實驗結果表明燕麥、蕎麥和小米攝入可促進腸道益生菌的繁殖，并抑制腸道有害菌的生長。通過體外模型研究燕麥和蕎麥對人腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)燕麥和蕎麥對有益菌（雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳桿菌屬）具有一定的增殖作用，同時對有害菌（腸球菌和大腸桿菌）的生長具有一定的抑制作用[10,25]。此外，蕎麥殼提取物因富含多酚類化合物，可改善糖尿病大鼠的腸道菌群結構，提高腸道內乳桿菌屬、布勞特氏菌屬和普氏菌屬（Prevotella）等菌屬豐度[26]。

圖 5 大鼠結腸菌群屬水平物種組成分析Fig. 5 Analysis of colonic microbiota composition at the genus level in normal rats

2.5.4 菌群PCoA結果

圖 6 大鼠結腸菌群PCoA圖Fig. 6 Principal co-ordinate analysis of colonic microbiota in normal rats

利用每個樣品OTU的豐度信息進行PCoA，結果表明，空白對照組、燕麥組、蕎麥組和小米組大鼠腸道內菌群多樣性均有明顯的聚類現(xiàn)象（圖6），說明飼喂3 種雜糧對大鼠結腸菌群結構的影響顯著，且蕎麥和小米對結腸菌群的影響相似度較高。

2.5.5 LEfSe菌群差異分析結果

圖 7 大鼠結腸菌群差異分析Fig. 7 LEfSe analysis of differences in colonic microbiota in normal rats supplemented with different kinds of coarse cereals

圖7A顯示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表攝食3 種雜糧對大鼠腸道內差異物種的影響，通過將差異映射到已知層級結構的分類樹上的方式得到進化分支圖（圖7B）。利用LEfSe軟件分析大鼠結腸菌群差異，先對4 組樣品進行Kruskal-Wallis秩和檢驗，將篩選出的差異再通過Wilcoxon秩和檢驗進行兩兩組間比較。篩選P＜0.05、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值大于4的菌群進行展示和比較，如圖7A所示，相對于其他3 組，飼喂燕麥后大鼠結腸中疣微菌門豐度增加，阿克曼氏菌屬豐度增加； 飼喂蕎麥后大鼠結腸中瘤胃菌科未定屬豐度增加；飼喂小米后大鼠結腸中厚壁菌門豐度增加，布勞特氏菌屬和閻氏菌屬（Yaniella）豐度增加。

2.6 燕麥、蕎麥和小米對大鼠結腸SCFAs含量的影響

表 3 結腸內容物SCFAs含量Table 3 SCFA concentrations in colonic contents of rats μg/g

如表3所示，飼喂燕麥和小米后，大鼠結腸中乙酸和總SCFAs含量顯著高于對照組（P＜0.05），小米組丙酸和異丁酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。腸道內的SCFAs主要來自食物中不能被人體直接消化的碳水化合物，如纖維素、半纖維素、抗性淀粉和低聚糖等，被腸道微生物發(fā)酵形成有益代謝終產物SCFAs等，SCFAs在調節(jié)宿主代謝、降低結腸pH值、改善腸道屏障功能、降低膽固醇水平等方面具有關鍵作用[27-28]。全谷物膳食人群較精制谷物膳食人群糞便中乙酸和丁酸含量高[29]。Dong Jilin等[14]研究發(fā)現(xiàn)3 種燕麥產品（燕麥片、去皮燕麥面粉、精制燕麥麩）飼喂的高脂飲食大鼠的結腸中總SCFAs含量增加，燕麥產品可通過增加乳桿菌屬和雙歧桿菌屬數量，改變腸道菌群結構而影響機體能量和脂肪代謝。近期研究表明高脂飲食模式下，小米可提高大鼠盲腸中乙酸、丙酸和丁酸含量[30]。本實驗中攝食小米顯著增加布勞特氏菌屬豐度，該菌屬具有發(fā)酵產生SCFAs的能力，因此推測布勞特氏菌屬豐度的增加可能為小米提高腸道SCFAs含量的機制之一。

本研究評價熟化形式雜糧對體內腸道健康的影響，雜糧的健康作用與其含量豐富的營養(yǎng)物質、功能活性成分密切相關，雜糧富含膳食纖維和抗性淀粉，進入腸道后經細菌發(fā)酵，促進腸道有益菌的增殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，對多種代謝性疾病具有干預作用[8]。Knudsen等[31]研究表明，燕麥中可溶性膳食纖維β-葡聚糖可調整大鼠腸道菌群結構，促進益生菌在腸道內定植，減少腸道有害菌的黏附；Peng Lianxin等[17]研究發(fā)現(xiàn)蕎麥中黃酮類抗氧化物質（如蘆丁）具有改善高脂飲食大鼠腸道菌群的功效，但是蕎麥和蘆丁對SCFAs的產生均無明顯作用；Yang Ruipeng等[32]研究發(fā)現(xiàn)小米谷糠內殼的結合態(tài)多酚可顯著增加小鼠糞便中厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門豐度，以上研究結果均與本實驗結果一致。

3 結 論

本實驗應用Illumina NovaSeq高通量測序技術探究熟化后燕麥、蕎麥和小米對正常大鼠的腸道菌群影響，并比較3 種雜糧對腸道有益代謝產物、腸道結構等方面的作用。主要結論如下：1）攝食燕麥可增加大鼠腸道菌群多樣性，顯著增加益生菌乳桿菌屬和阿克曼氏菌屬豐度，對腸道菌群具有一定的改善作用。2）蕎麥和小米可增加結腸中厚壁菌門相對豐度，降低疣微菌門和擬桿菌門相對豐度，蕎麥和小米對結腸菌群的影響相似度較高。 3）燕麥和小米可提高大鼠結腸內乙酸和總SCFAs含量，小米還可增加結腸內丙酸和異丁酸含量。本研究通過系統(tǒng)比較3 種雜糧對腸道菌群的影響，為谷物功能食品的開發(fā)提供科學依據。