連翹葉連翹苷提取物對高脂飲食誘導(dǎo) 大鼠肥胖的預(yù)防作用

王 靜，黃慶辰，高敏玥，朱小盼，陳子彤，王少康*，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009）

植物連翹（Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl）屬木犀科落葉開花灌木，主要產(chǎn)于山西、河南、山東和陜西等地[1]。連翹果是植物連翹的果實，有青翹和老翹兩種，青翹是在尚未成熟時采下的果實，老翹是在果實成熟、果殼裂開時采下的果實，連翹作為中藥材在我國已有悠久的歷史，具有清熱解毒、散結(jié)消腫等功效[2-4]。連翹葉是植物連翹的葉子，目前在連翹葉中已經(jīng)有200多種化學(xué)成分被分離提取出來，有效成分包括連翹苷、連翹酯苷、綠原酸和蘆丁等[5-6]，具有抗菌抗炎、抗氧化、抑制人食管癌細胞的增殖和神經(jīng)保護等作用[7-11]。連翹苷是連翹葉的有效成分，也是主要成分之一，已有研究表明，連翹苷對營養(yǎng)性肥胖小鼠具有減肥作用，能夠使肥胖小鼠體質(zhì)量增長率降低，脂肪濕質(zhì)量減輕，脂肪系數(shù)變小[12-13]。近年來對連翹果實資源的開發(fā)比較廣泛，而連翹葉資源一直被大量浪費，但經(jīng)研究證實，連翹葉中連翹苷的含量比老翹高40 倍，比青翹高2～4 倍[14]。連翹葉在民間有食用習(xí)慣和歷史記載，山西省疾病預(yù)防控制中心進行的連翹葉急性經(jīng)口毒性實驗、90 d經(jīng)口毒性實驗等6 項毒性研究結(jié)果表明連翹葉具有食用安全性[15]。因此，2017年 原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準連翹葉新食品原料 終止審查，同時山西省頒布了DBS14/001—2017《食品安全地方標準 連翹葉》，在全國首先將連翹葉列入食品范疇，進行管理[16]。

長期高脂高糖飲食可導(dǎo)致肥胖，肥胖在臨床上被稱為一種代謝綜合征，通常是由于能量消耗、能量攝入和能量儲存之間的不平衡造成的。肥胖可導(dǎo)致高血壓、血脂異常、內(nèi)分泌代謝紊亂，同時還是癌癥、腎臟疾病等的誘發(fā)因素。目前大多數(shù)患者會選擇節(jié)食、減肥藥物甚至減肥手術(shù)來控制肥胖，但節(jié)食可能會損傷認知功能，而減肥藥物具有很多副作用，如肺動脈高壓、中風(fēng)、心血管疾病、神經(jīng)精神疾病等，施行減肥手術(shù)的減肥效果顯著，也能降低減肥藥物所引起的疾病和死亡，但手術(shù)帶來的風(fēng)險不容忽視[17-19]。因此，尋找綠色、天然、安全、高效的減肥或預(yù)防肥胖的產(chǎn)品具有十分重要的意義，天然植物和植物化學(xué)物成本較低且副作用可 忽略[20-21]，對其研究越來越多。本研究通過探討連翹葉中連翹苷提取物對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖的預(yù)防作用，有助于連翹葉資源的開發(fā)利用，同時也為連翹葉保健功能的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠65 只，體質(zhì)量（200±10）g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（浙） 2019-0002；動物使用許可證編號：SYXK（蘇）2016-0014； 本次動物實驗在東南大學(xué)實驗動物中心進行，已獲得東南大學(xué)實驗動物倫理審查委員會批準（倫理審批號：20190805009）。

連翹葉由山西惠源四海農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，全部采自山西陽泉里洪水村?；A(chǔ)飼料和高脂飼料由蘇州雙獅實驗動物科技有限公司提供。

連翹苷標準品（純度≥98%） 北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；瘦素（leptin，LP）、游離脂肪酸（free fat acid，F(xiàn)FA）試劑盒、質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛通用型組織固定液 南京金益柏生物科技有限 公司；蘇木精-伊紅染液（hematoxylin-eosin，HE） 珠海貝索生物技術(shù)有限公司。水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限 公司；電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、油浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限 公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；1260 LC高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；BX51T-PHD-J11顯微鏡 日本奧林巴斯公司；ELx800光吸收酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 連翹苷提取物的制備

連翹苷提取物由本實驗室自制，制備過程：將連翹葉粉碎后取適量加20 倍體積水，90 ℃下提取2 次，每次60 min，收集2 次浸提液，離心后取上清液，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥成粉狀（經(jīng)高效液相色譜儀檢測，其中連翹苷質(zhì)量分數(shù)為13.3%），以備后續(xù)動物實驗用。

1.3.2 動物飼養(yǎng)、分組及干預(yù)

SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，室溫20～26 ℃，相對濕度45%～65%，明暗交替12 h，保持良好的通風(fēng)。65 只大鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料7 d后，按體質(zhì)量隨機分組：空白對照組（8 只）和肥胖模型組（57 只）?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)飼料，肥胖模型組飼喂高脂飼料，喂養(yǎng)2 周后，給予高脂飼料的57 只大鼠按體質(zhì)量增加量排序，淘汰體質(zhì)量增加量較低的17 只肥胖抵抗大鼠。

將篩選出的40 只肥胖敏感大鼠按體質(zhì)量隨機分成5 組，分別為模型對照組和連翹苷提取物低、中、高劑量組，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局國食藥監(jiān)保化（2012）107號文件以及《保健食品功能評價指導(dǎo)原則（2020年版）（征求意見稿）》，各種動物實驗至少應(yīng)設(shè)3 個劑量組，劑量選擇應(yīng)合理，盡可能找出最低有效劑量。故本實驗以連翹苷人體推薦攝入量的5、10、30 倍分別作為低、中、高劑量組；又根據(jù)DBS14/001—2017規(guī)定，成人干制連翹葉每日推薦食用量不高于6 g/d，因此低、中、高3 個劑量組按連翹葉質(zhì)量計，分別為0.5、1、3 g/（kgmb·d）。根據(jù)前期本實驗室測得連翹葉中連翹苷質(zhì)量分數(shù)為5.32%，連翹苷提取物中連翹苷質(zhì)量分數(shù)為13.3%，因此低、中、高劑量組所需連翹苷提取物0.2、0.4、1.2 g/（kgmb·d），即連翹苷劑量分別為26.6、53.2、159.6 mg/（kgmb·d），同時設(shè)置標準品組（連翹苷標準品（連翹苷質(zhì)量分數(shù)按98%計）54.3 mg/（kgmb·d）， 與中劑量組干預(yù)物中的連翹苷劑量相同）。給予高脂飼料，空白對照組和模型對照組灌胃等量的蒸餾水，大鼠灌胃量為2 mL/200 g。每天定時灌胃1 次，持續(xù)灌胃6 周。實驗期間每天記錄給食量和撒食量，每周記錄剩食量，每周稱量體質(zhì)量1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

1.3.3 動物實驗解剖和組織取材

在干預(yù)第6周末，禁食12 h，稱量體質(zhì)量，將大鼠平攤仰臥，用卷尺準確測量鼻尖到肛門的長度作為體長，對大鼠進行股動脈取血，離心取上層血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。再將大鼠進行二氧化碳吸入處死，解剖取腎周脂肪、睪周脂肪，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，分別稱質(zhì)量并記錄，取睪周脂肪同一部位用質(zhì)量分數(shù)4%的多聚甲醛通用型組織固定液固定，以待后續(xù)病理切片觀察，其余放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 指標的測定

1.3.4.1 攝食量

根據(jù)實驗期間記錄的給食量、撒食量和剩食量，按照公式（1）計算攝食量。

1.3.4.2 肥胖指數(shù)（Lee’s指數(shù)）

根據(jù)實驗期間記錄的大鼠體質(zhì)量和體長按照公 式（2）計算Lee’s指數(shù)。

1.3.4.3 腎周、睪周、內(nèi)臟脂肪系數(shù)

腎周、睪周和內(nèi)臟脂肪系數(shù)分別為腎周脂肪質(zhì)量、睪周脂肪質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量（腎周脂肪質(zhì)量和睪周脂肪質(zhì)量之和）與大鼠體質(zhì)量之比。

1.3.4.4 血清生化指標的檢測

用全自動生化分析儀測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度 脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平；TBA水平按照試劑盒要求進行測定；LP、FFA水平按照酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒要求進行測定。

1.3.4.5 脂肪組織病理切片

脂肪組織采用HE染色，經(jīng)顯微鏡鏡檢和圖像采集分析，觀察病理組織學(xué)變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)均以平均值± 標準差表示，采用LSD檢驗進行ANOVA方差分析，方差不齊時采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，并用中位數(shù)（四分位間距）表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹苷提取物對各組大鼠攝食量和體質(zhì)量的影響

實驗期間各組大鼠攝食量之間無顯著性差異 （P＞0.05），說明連翹苷提取物對大鼠攝食量無影響。各組大鼠體質(zhì)量變化見表1，可以看出，模型對照組與空白對照組的體質(zhì)量相比，均有顯著性差異（P＜0.05），表明高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖成功。實驗干預(yù)前4 周，各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，模型對照組與各干預(yù)組之間體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）。干預(yù)第5周時，與模型對照組相比，中劑量組、高劑量組和標準品組的體質(zhì)量分別降低了5.56%、6.24%、5.72%，第6周時，分別降低了7.94%、8.50%、7.98%，差異均具有顯著性 （P＜0.05）。其中高劑量組體質(zhì)量減少幅度最大，而中劑量組和標準品組體質(zhì)量減少幅度相差不大，且無顯著性差異（P＞0.05），可能是由于中劑量組和標準品組的連翹苷含量相似，從而使預(yù)防肥胖的效果相當。

表 1 各組大鼠體質(zhì)量的變化（n＝8）Table 1 Changes in body mass of rats in each group (n = 8)

2.2 連翹苷提取物對肥胖大鼠Lee’s指數(shù)的影響

Lee’s指數(shù)是評價肥胖程度的指標[22]，如表2所示，各組之間體長無顯著性差異（P＞0.05），表明連翹苷提取物對大鼠體長無影響。與空白對照組相比，模型對照組的Lee’s指數(shù)顯著大于空白對照組（P＜0.05）；與模型對照組相比，高劑量組的Lee’s指數(shù)降低了4.18%，且具有顯著性差異（P＜0.05），標準品組與中劑量組的Lee’s指數(shù)相比無顯著性差異（P＞0.05）。

表 2 連翹苷提取物對肥胖大鼠Lee’s指數(shù)的影響（n＝8）Table 2 Effect of forsythin extract on Lee’s index of obese rats (n= 8）

2.3 連翹苷提取物對肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪含量的影響

表 3 連翹苷提取物對肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪含量的影響（n＝ 8）Table 3 Effect of forsythin extract on visceral fat contents in obese rats (n= 8)

如表3所示，模型對照組內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及其系數(shù)顯著大于空白對照組（P＜0.05），說明高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖成功。同時，與模型對照組相比，中、高劑量組能夠使大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及其系數(shù)降低，差異均具有顯著性（P＜0.05），說明連翹苷提取物能夠改善肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪蓄積的現(xiàn)象，而且劑量越高，效果越好。此外，中劑量組和標準品組內(nèi)臟脂肪質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪系數(shù)差異不顯著（P＞0.05），說明中劑量組和標準品組的干預(yù)效果相當。

2.4 連翹苷提取物對肥胖大鼠血清生化指標的影響

實驗干預(yù)6 周后，大鼠血清生化指標的變化如表4所示，模型對照組的TC、LDL-C、TBA、LP和FFA水平比空白對照組高，且具有顯著性差異（P＜0.05）。與模型對照組相比，連翹苷提取物能夠降低肥胖大鼠的TC、LDL-C、LP和FFA水平，且具有顯著性差異 （P＜0.05），說明連翹苷提取物能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂紊亂的現(xiàn)象。還發(fā)現(xiàn)中劑量組與標準品組降低TC、LDL-C、LP水平的效果差異不顯著（P＞0.05），說明兩組干預(yù)效果相似。

表 4 連翹苷提取物對肥胖大鼠血清生化指標的影響（n＝8）Table 4 Effect of forsythin extract on serum biochemical indexes in obese rats (n = 8)

2.5 連翹苷提取物對肥胖大鼠脂肪組織的影響

圖 1 HE染色大鼠睪周脂肪組織切片F(xiàn)ig. 1 Pathological sections of testis tissue from rats stained by hematoxylin-eosin stainning

表 5 連翹苷提取物對肥胖大鼠脂肪細胞當量直徑、周長和面積的 影響（n＝ 6）Table 5 Effect of forsythin extract on equivalent diameter, circumference and area of adipocytes in obese rats (n = 6)

如圖1及表5所示，在相同顯微鏡視野下，模型對照組與空白對照組相比，脂肪細胞數(shù)量減少，脂肪充盈，細胞膨大，且脂肪細胞當量直徑、周長和面積顯著大于空白對照組（P＜0.05）。連翹苷提取物低、中、高劑量組較模型對照組有所改善，可見脂肪細胞數(shù)量增加，脂肪細胞變小，但低劑量組效果不明顯，高劑量組效果最顯著，且與模型對照組相比，低劑量組脂肪細胞的面積 顯著減小（P＜0.05），中劑量組脂肪細胞的周長和面積顯著減小（P＜0.05），高劑量組脂肪細胞的當量直徑、周長和面積顯著減小（P＜0.05）。標準品組與中劑量組的干預(yù)效果較為相似，可見脂肪細胞數(shù)量、大小較為接近。

3 討 論

連翹葉作為新食品原料，在食品領(lǐng)域應(yīng)用逐漸廣泛，民間已炮制出連翹紅茶、綠茶等，此外還有連翹涼茶、天然食品防腐劑和新型抗氧化劑等[23-26]。本研究用連翹葉制備連翹苷提取物，探討其對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖的預(yù)防作用，為連翹葉保健功能的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

近年來，肥胖已經(jīng)成為人們?nèi)找骊P(guān)注的重點，1975—2016年，全球兒童和青少年的平均體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）和肥胖患病率呈上升趨勢，2015年共有1.077億肥胖兒童和6.037億肥胖成人，其造成的疾病負擔也迅速增加，據(jù)統(tǒng)計，高BMI在1990—2015年 導(dǎo)致全球400萬 人死亡[27-28]。隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，中國居民的膳食結(jié)構(gòu)比例也發(fā)生了變化，伴隨而來的是中國居民疾病譜也發(fā)生了變化，無論是成人還是兒童青少年，超重肥胖率均呈現(xiàn)上升趨勢，18歲及以上居民平均血壓、血糖、TC和TG水平均呈上升趨勢[29-30]。

本研究進行6 周干預(yù)實驗后，發(fā)現(xiàn)模型對照組的TC、LDL-C、TBA、LP、FFA水平，相同顯微鏡視野下脂肪細胞數(shù)量及大小、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及其系數(shù)、Lee’s指數(shù)、體質(zhì)量均顯著高于空白對照組，說明高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖成功。肥胖患者往往伴隨著血脂水平的改變，通常是TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低[31-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組的TC、LDL-C、TBA、LP、FFA水平明顯高于空白對照組，說明高脂飲食會造成體內(nèi)TC、LDL-C、TBA、LP、FFA水平的升高，還發(fā)現(xiàn)高劑量組降低肥胖大鼠TC和LDL-C的效果最明顯，中劑量組與標準品組干預(yù)效果較為接近，可能是由于兩組中所含連翹苷含量相似。但不同劑量組與模型對照組相比，血清TG和HDL-C水平差異不顯著，可能是因為實驗干預(yù)時間為6 周，還不足以使大鼠的血清TG和HDL-C水平發(fā)生顯著變化。連翹苷提取物還能夠降低肥胖大鼠血清LP水平，而對于血清FFA水平，高劑量可能會降低其水平，低、中劑量似乎對肥胖大鼠血清FFA水平?jīng)]有明顯影響。此外，脂肪組織病理結(jié)果顯示各劑量組較模型對照組脂肪細胞數(shù)量增加，脂肪細胞變小，但低劑量組效果不明顯，高劑量組效果最顯著，中劑量組和標準品組效果較接近。

研究還發(fā)現(xiàn)中、高劑量連翹苷提取物能夠明顯降低肥胖大鼠的體質(zhì)量，并使肥胖大鼠的Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪系數(shù)減小，且對攝食量沒有影響，說明連翹苷提取物可能具有安全性；此外還發(fā)現(xiàn)連翹苷提取物高劑量組預(yù)防肥胖的效果優(yōu)于中劑量組，而標準品組和中劑量組干預(yù)效果 相當，說明連翹苷提取物中連翹苷含量越高，預(yù)防肥胖的效果越好，相同劑量的連翹苷可能預(yù)防肥胖的效果也相當，此外研究沒有發(fā)現(xiàn)連翹苷提取物低劑量組對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖的預(yù)防作用，可能是由于低劑量組連翹苷含量較低。與趙詠梅等[12]的研究相比，本實驗從預(yù)防肥胖的角度出發(fā)，探究更加全面，同時也通過中劑量組和標準品組的對比，證明了是連翹葉中的連翹苷對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖具有預(yù)防作用。

4 結(jié) 論

連翹葉中連翹苷提取物通過控制肥胖大鼠的TC、LDL-C、LP和FFA水平的升高，改善肥胖大鼠的血脂水平，并且減緩脂肪組織細胞的增長，降低肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及其系數(shù)、Lee’s指數(shù)和體質(zhì)量，能夠預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肥胖，連翹葉中的連翹苷是其中的功能性成分。該研究證實了連翹葉中連翹苷提取物可作為綠色、天然、安全、高效的預(yù)防肥胖的食品，為連翹葉資源的深入開發(fā)利用和連翹葉保健功能的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。