紫穗槐蜂蜜對小鼠急性酒精性胃潰瘍的預(yù)防作用

祝 敏，靳 林，趙浩安,，王 倩，張錦錦，楊二林，曹 煒,4,*

（1.西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069；2.陜西省國營林場管理站（陜西省林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心），陜西 西安 710082； 3.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069；4.陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710065）

胃潰瘍是因胃黏膜破壞導(dǎo)致的一種常見消化性潰瘍疾病，具有易感染、病程長、難治愈、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。胃潰瘍發(fā)病機(jī)制復(fù)雜尚未完全明晰，已有研究表明其主要是由于胃黏膜的攻擊因子與防御機(jī)制失衡引起的[2]，酒精是典型的胃黏膜攻擊因子之一。酒精經(jīng)進(jìn)入人體后會首先由包括胃腸在內(nèi)的消化系統(tǒng)消化吸收進(jìn)入血液[3]，因此高濃度的酒精攝入會首先侵蝕胃黏膜，通過對胃黏液和碳酸氫鹽的消解，破壞胃黏膜保護(hù)層，造成胃黏膜不可逆的損傷，繼而誘發(fā)急性胃潰瘍[4]。病理研究表明，急性酒精性胃潰瘍的發(fā)病主要與中性粒細(xì)胞的浸潤、促炎因子的釋放及其所引起的氧化應(yīng)激緊密相關(guān)[3-4]。如不能有效治愈，胃潰瘍會發(fā)展成為胃出血、胃炎甚至是胃癌，危及患者生命。胃潰瘍的防治一直都是研究人員關(guān)注的重點(diǎn)，目前胃潰瘍的治療是依靠一些化學(xué)合成藥物，包括質(zhì)子泵抑制劑在內(nèi)的抗生素和胃酸中和劑[3]，但是這些藥物大多數(shù)會引起過敏癥、心律不齊、造血功能障礙等不良副作用。因此，應(yīng)用無毒副作用且具有良好生物活性的天然食品防治胃潰瘍逐漸成為研究人員的重點(diǎn)。

蜂蜜是由蜜蜂收集植物花蜜并通過自身分泌物對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化、發(fā)酵最終成熟的天然食品，因其突出的抑菌、抗氧化、抗炎等生物活性，一直是備受消費(fèi)者和研究人員青睞的天然功能食品。蜂蜜的高滲透壓[5-6]、抗氧化和抗?jié)兡芰7]都與其解酒[8]及護(hù)胃作用[9-10]存在潛在聯(lián)系。我國是蜂蜜生產(chǎn)大國，蜂蜜品種和產(chǎn)量均居世界前列。民間常有用蜂蜜預(yù)防酒精性胃潰瘍的傳統(tǒng)，但對于其作用機(jī)理鮮見詳細(xì)報道。本課題組在基層蜂場走訪調(diào)研中發(fā)現(xiàn)了一種我國西北地區(qū)特色單花種蜂蜜——紫穗槐蜂蜜。紫穗槐是一種大量種植于我國西北地區(qū)的沙地造林灌木樹種。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紫穗槐蜂蜜的理化指標(biāo)符合GB 14963—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》及國際標(biāo)準(zhǔn)Council Directive 2001/110/EC中對蜂蜜質(zhì)量的要求，且具有良好的抗氧化活性。

本研究以連續(xù)攝入10 d紫穗槐蜂蜜的急性酒精胃潰瘍小鼠為對象，通過分析基本生化指標(biāo)、組織病理學(xué)、相關(guān)炎癥因子和基因及蛋白表達(dá)，擬探明紫穗槐蜂蜜對酒精引起的急性胃潰瘍的預(yù)防作用及其潛在機(jī)理。本研究詳細(xì)報道了我國特色單花種蜂蜜對酒精誘導(dǎo)的小鼠胃損傷的防治作用及其潛在的保護(hù)機(jī)制，可為蜂蜜功能食品發(fā)展開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明小鼠（體質(zhì)量18～22 g）由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2017-001。實驗開始前，動物在恒溫（（25±2）℃）、恒濕（相對濕度（50±10）%）、自然照明10～14 h的環(huán)境下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

紫穗槐蜂蜜采自陜西榆林佳縣，4 ℃下保存。通過實驗室測定得到紫穗槐蜂蜜基本成分為：紫穗槐花粉孢子質(zhì)量分?jǐn)?shù)68%、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（18.0±0.2）%、游離酸含量（15.42±0.29）meq/kg、內(nèi)酯酸含量（4.50±0.73）meq/kg、總酸含量（19.93± 0.47）meq/kg、果糖含量（46.77±1.33）g/100 g、葡萄糖含量（27.42±0.64）g/100 g、蔗糖含量（0.81± 0.22）g/100 g及脯氨酸含量（332.22±21.99）mg/kg， 5-羥甲基糠醛未檢出，理化特性為電導(dǎo)率（0.20± 0.01）mS/cm、pH 3.94。

過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和動物組織蛋白質(zhì)含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；MiniBEST通用RNA提取試劑盒、PrimeSciptTMRT預(yù)混合液 日本TaKaRa 公司；核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）p65、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體 武漢賽維爾生物科技有限公司；沒食子酸、丁香酸、木犀草素、柚皮素、短葉松素三乙酸酯、白楊素等標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 美國Sigma公司；無水乙醇及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6510高效液相色譜/電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography/electron spray ionization-quadrupole time of flight-mass spectrometer，HPLC/ESI-Q-TOF-MS） 美國安捷倫科技公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；Gentier 96E實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 西安天隆科技有限公司；數(shù)字切片掃描顯微鏡 德國Leica Microsystems公司。

1.3 方法

1.3.1 紫穗槐蜂蜜酚類化合物的測定

參考本實驗室建立的測定蜂產(chǎn)品酚類化合物的HPLC/ESI-Q-TOF-MS方法[11]，具體條件如下：流動相A：超純水；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～2 min、85% A，2～10 min、85%～70% A，10～25 min、70%～10% A，25～30 min、10% A，30～31 min、10%～85% A，31～45 min、85% A；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。通過比對標(biāo)準(zhǔn)品保留時間、質(zhì)荷比對紫穗槐蜂蜜酚類化合物進(jìn)行定性分析，通過離子流色譜圖峰面積帶入化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.2 動物分組與給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、紫穗槐蜂蜜低劑量組（5 g/kgmb）、紫穗槐蜂蜜高劑量組（20 g/kgmb），每組10 只，紫穗槐蜂蜜組每天灌胃給藥1 次，正常對照組和模型組給予等量蒸餾水。連續(xù)灌胃10 d。末次給藥2 h后，除正常對照組外，所有處理組小鼠以10 mL/kgmb灌胃體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，建立酒精性胃潰瘍小鼠模型，灌胃乙醇前需對各處理組小鼠禁食不禁水24 h。乙醇灌胃后1 h，頸椎脫臼處死小鼠。

1.3.3 小鼠胃組織采集、處理及病理學(xué)觀察

小鼠頸椎脫臼處死后解剖取出胃，用4 ℃生理鹽水沖洗表面污血，拭干。從胃底向幽門，沿胃小彎最長徑將胃組織平行剖開，將胃體內(nèi)外翻轉(zhuǎn)，用4 ℃生理鹽水將內(nèi)部殘余物洗凈，平鋪觀察胃內(nèi)壁出血性潰瘍病變，胃組織潰瘍情況通過潰瘍指數(shù)評價。潰瘍指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：微小潰瘍（1～2 mm）1 分；中等潰瘍（3～4 mm）2 分；大型潰瘍（5～6 mm）4 分；超大潰瘍（＞6 mm）8 分。每個處理組潰瘍指數(shù)以組內(nèi)每只小鼠的潰瘍總評分與小鼠數(shù)量的比值表示。

為更好比較不同劑量紫穗槐蜂蜜處理對小鼠胃組織的保護(hù)效果，按式（1）計算胃組織保護(hù)率。

潰瘍指數(shù)評價結(jié)束后，將胃組織剖分為兩部分，一部分浸入體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林試劑中，脫水，石蠟包埋。組織蠟塊進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和過碘酸-席夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理情況。另一部分胃組織用4 ℃生理鹽水制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的胃勻漿，用于生化指標(biāo)檢測。

1.3.4 NF-κB p65和iNOS免疫組織化學(xué)分析及評分

組織蠟塊脫蠟水合后，將組織浸入檸檬酸緩沖溶液（pH 6.0），置于微波爐中進(jìn)行抗原熱修復(fù)。隨后用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2預(yù)處理后，與相應(yīng)抗體進(jìn)行孵化后進(jìn)行免疫染色，染色后的切片在數(shù)字切片掃描顯微鏡下獲取斷面圖像進(jìn)行免疫組化評分。評分規(guī)則如下：圖像中細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞，按陽性細(xì)胞著色程度由弱至強(qiáng)分別記分，無黃色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，深棕黃色3 分。記錄視野下完整細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，免疫組化評分按式（2）計算。

1.3.5 生化指標(biāo)的檢測

取1.3.3節(jié)制備的胃勻漿，2500 r/min下低溫離心10 min，取上清液備用。根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書測定胃勻漿中CAT、SOD活力及GSH、MDA、NO、TNF-α、PGE2和組織蛋白的含量，結(jié)果以每克（或毫克）蛋白所含各指標(biāo)水平表示。

通過qPCR測定胃組織中iNOS、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β基因表達(dá)水平。采用RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。取RNA樣本采用試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA樣本，根據(jù)基因序列特異性設(shè)計引物，通過qPCR并采用SYBR GREEN染料法，以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，循環(huán)40 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫穗槐蜂蜜酚類化合物分析結(jié)果

圖 1 紫穗槐蜂蜜HPLC/ESI-Q-TOF-MS總離子流圖Fig. 1 High performance liquid chromatography/electron spray ionization-quadrupole time of flight-mass spectrometer total ion chromatogram showing the phenolic composition of AFH

蜂蜜中酚類化合物與其生物活性一直是蜂蜜活性研究的重點(diǎn)。HPLC/ESI-Q-TOF-MS總離子流圖如圖1所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對分析，在供試紫穗槐蜂蜜樣品中定性、定量檢測出6 種已知酚類物質(zhì)，其化學(xué)式及含量 如表1所示。紫穗槐蜂蜜中酚酸類化合物主要包括沒食子酸和丁香酸，黃酮類化合物主要包括木樨草素、柚皮素、白楊素和短葉松素三乙酸酯。已有研究證實，蜂蜜的抗氧化和抗?jié)兊然钚耘c其酚類化合物種類和含量緊密相關(guān)[12]，因此推測酚類化合物也是紫穗槐蜂蜜防治酒精性胃潰瘍的主要活性成分之一。

表 1 紫穗槐蜂蜜中主要酚類化合物含量Table 1 Contents of phenolic compounds in AFH

2.2 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠潰瘍指數(shù)的影響

圖 2 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織病變 和胃潰瘍指數(shù)的影響Fig. 2 Effect of AFH on gastric pathological change and gastric ulcer index in mice with acute alcoholic gastric ulcer

對預(yù)先灌胃紫穗槐蜂蜜的小鼠用乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍后，觀察小鼠胃部潰瘍程度，通過潰瘍指數(shù)評價紫穗槐蜂蜜對酒精性胃潰瘍的預(yù)防性保護(hù)作用。圖2顯示不同處理組小鼠胃組織病變形態(tài)及通過觀察計算得到的潰瘍指數(shù)。正常組小鼠胃組織宏觀形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯出血性 病變，而潰瘍模型組小鼠胃組織出血性病變明顯，潰瘍最為嚴(yán)重，潰瘍指數(shù)達(dá)到11.11±2.26，紫穗槐蜂蜜處理組小鼠胃組織形態(tài)相較模型組潰瘍病變明顯緩解，胃潰瘍指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。通過計算胃組織保護(hù)率比較不同劑量紫穗槐蜂蜜處理對小鼠胃組織的保護(hù)效果，高劑量紫穗槐蜂蜜處理對小鼠胃組織保護(hù)率達(dá)到89.83%，胃部潰瘍程度與正常組小鼠無明顯差異。

2.3 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織病理 變化的影響

圖 3 各組小鼠胃組織HE染色和PAS染色病理觀察Fig. 3 Observation of gastric tissues by HE and PAS staining

如圖3所示，小鼠胃部組織結(jié)構(gòu)HE染色切片中，正常組小鼠胃部組織腺體排列整齊，黏膜層、黏膜下層和肌肉層結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，未見明顯水腫及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠胃組織正常結(jié)構(gòu)消失，頂端腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)大量片狀脫落，并出現(xiàn)部分凝固性壞死。黏膜層受損嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤和散在出血點(diǎn)。過量乙醇的攝入還會造成小鼠胃黏膜下層出現(xiàn)增寬現(xiàn)象，即水腫，損傷未累及黏膜肌層。與模型組小鼠相比，紫穗槐蜂蜜低劑量組小鼠胃組織腺體細(xì)胞排列較為整齊，局部腺體脫落，黏膜下層水腫有所緩解，但仍有局部出血和炎癥細(xì)胞浸潤等異常組織結(jié)構(gòu)。紫穗槐蜂蜜高劑量組小鼠胃組織結(jié)構(gòu)接近正常胃組織，表明紫穗槐蜂蜜的提前攝入對乙醇攝入后的小鼠胃組織具有一定保護(hù)作用。

胃黏膜上層分泌的黏液與胃組織細(xì)胞連接可以形成胃黏膜保護(hù)屏障，是胃上皮組織抵抗外來損傷（如乙醇、酸等）的重要防御因子。本實驗對小鼠胃組織進(jìn)行PAS染色，檢測胃黏膜表層糖原、糖蛋白和其他多糖的含量，以切片中藍(lán)紫色點(diǎn)的數(shù)量評價各處理組小鼠胃黏膜表層糖蛋白數(shù)量。如圖3所示，過量乙醇的攝入會引起小鼠胃黏膜表層糖蛋白的損耗，造成模型組小鼠胃組織PAS染色損失明顯，整體PAS染色很淡甚至缺失。紫穗槐蜂蜜預(yù)處理的小鼠胃組織PAS染色強(qiáng)度較模型組明顯增加，其中紫穗槐蜂蜜高劑量組小鼠胃黏液保護(hù)屏障的完整性和連續(xù)性與正常組小鼠相似。

2.4 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織氧化 應(yīng)激的影響

CAT、SOD和GSH作為與機(jī)體氧化應(yīng)激水平相關(guān)物質(zhì)，是其抵抗氧化損傷的重要防線[13]。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物，其含量能夠反映脂質(zhì)過氧化的程度。本實驗中選擇CAT活力、GSH含量、SOD活力和MDA含量作為指標(biāo)評價紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠氧化應(yīng)激的影響。

圖 4 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織氧化應(yīng)激水平的影響Fig. 4 Effect of AFH on oxidative stress levels in gastric tissues from mice with acute alcoholic gastric ulcer

如圖4所示，小鼠在灌胃乙醇后，除CAT活力在各處理組間無顯著差異外，模型組小鼠胃組織的SOD活力和GSH含量均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。提前灌胃的紫穗槐蜂蜜對小鼠胃組織氧化應(yīng)激水平有所改善。紫穗槐蜂蜜處理組小鼠胃組織SOD活力和GSH含量均有所升高，MDA含量降低。其中高劑量紫穗槐蜂蜜處理能夠使小鼠胃組織的SOD活力和GSH含量分別提高73.22%和87.15%，顯著高于模型組小鼠 （P＜0.05），而MDA含量降低了37.06%，與正常組小鼠相比無顯著差異。

2.5 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織抗炎 標(biāo)記物和炎癥因子水平的影響

圖 5 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織抗炎標(biāo)記物 和炎癥因子水平的影響Fig. 5 Effect of AFH on the levels of anti-inflammatory markers and inflammatory factors in gastric tissues from mice with acute alcoholic gastric ulcer

PGE2和NO是胃組織重要的抗炎標(biāo)記物，其含量能夠間接反映機(jī)體抗炎作用水平。如圖5所示，過量乙醇的攝入造成模型組小鼠胃組織中PGE2含量顯著低于正常組 小鼠（P＜0.05），較正常組降低57.88%。連續(xù)10 d的紫穗槐蜂蜜灌胃可以顯著提高小鼠胃組織中PGE2含量 （P＜0.05），且不同劑量組之間無顯著差異（P＞0.05）。 胃潰瘍模型組小鼠胃組織NO含量較正常組小鼠顯著降低；與模型組相比，紫穗槐蜂蜜高劑量組NO含量顯著提高了47.35%（P＜0.05），且與正常組小鼠無顯著差異（P＞0.05）。

TNF-α是機(jī)體內(nèi)常見的炎癥因子，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。乙醇灌胃會導(dǎo)致小鼠胃組織中TNF-α含量顯著升高（圖5），預(yù)先灌胃紫穗槐蜂蜜能夠顯著緩解乙醇攝入造成的TNF-α含量劇增，與模型組相比，紫穗槐蜂蜜低劑量組和高劑量組分別降低了56.90%和79.39%，其中紫穗槐蜂蜜高劑量組TNF-α含量與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.6 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織炎癥因子基因表達(dá)的影響

圖 6 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織炎癥因子 基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of AFH on the gene expression of inflammatory factors in gastric tissues from mice with acute alcoholic gastric ulcer

如圖6所示，與正常組相比，乙醇的攝入誘導(dǎo)小鼠胃組織中炎癥因子iNOS、IL-6和IL-1βmRNA相對表達(dá)水平顯著升高，分別較正常組提高了75.85%、65.67%和43.37%。紫穗槐蜂蜜高劑量組小鼠IL-6mRNA相對表達(dá)水平與正常組無顯著差異（P＞0.05）；而對于炎癥因子iNOS和IL-1βmRNA相對表達(dá)水平，紫穗槐蜂蜜低、高劑量組均與正常組無顯著差異（P＞0.05），表明紫穗槐蜂蜜處理對iNOS和IL-1β表達(dá)均具有顯著調(diào)控作用。

2.7 紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織免疫組化評分的影響

圖 7 各組小鼠胃組織中NF-κB p65免疫組化切片及評分Fig. 7 NF-κB p65 immunohistochemical sections and immunohistochemical scores of gastric tissues from mice in four groups

圖 8 各組小鼠胃組織中iNOS免疫組化切片及評分Fig. 8 iNOS Immunohistochemical sections and immunohistochemical scores of gastric tissues from mice in four groups

如圖7、8所示，正常組小鼠胃組織中NF-κB p65和iNOS陽性細(xì)胞很少，而乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍導(dǎo)致模型組小鼠胃組織中NF-κB p65和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，免疫組化評分顯著升高（P＜0.05），約為正常組免疫組化評分的4 倍。與模型組小鼠相比，紫穗槐蜂蜜處理組小鼠胃組織中NF-κB p65和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低，且高劑量紫穗槐蜂蜜對細(xì)胞的保護(hù)效果明顯優(yōu)于低劑量。此外，紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍小鼠胃組織NF-κB p65和iNOS免疫組化結(jié)果也與促炎因子基因表達(dá)結(jié)果相印證，即紫穗槐蜂蜜能夠顯著抑制胃潰瘍相關(guān)炎癥因子基因和蛋白的表達(dá)。

3 討 論

胃潰瘍是最常見的胃腸道疾病，感染人群約占全球人數(shù)的4%～5%，而過量飲酒是胃潰瘍的主要病因之一[14]。 現(xiàn)有研究顯示，酒精性胃潰瘍主要與胃黏膜保護(hù)層 損傷、胃組織氧化應(yīng)激水平紊亂、炎癥因子浸潤等有關(guān)[15]。 完整的胃黏膜是保護(hù)胃組織免受乙醇直接損傷的首要屏障，有學(xué)者提出預(yù)防胃潰瘍最重要的步驟是在胃內(nèi)壁上形成一層保護(hù)層，保護(hù)底層黏膜免受外界刺激物的 侵害[16]。本實驗中，紫穗槐蜂蜜預(yù)先處理后，小鼠胃組織得到有效保護(hù)，潰瘍病理表現(xiàn)和指數(shù)顯著降低，表明當(dāng)機(jī)體攝入過量乙醇時，紫穗槐蜂蜜可以通過保護(hù)胃黏膜完整性從而達(dá)到預(yù)防急性酒精性胃潰瘍的效果。這與新西蘭麥盧卡蜂蜜、土耳其杜鵑花蜂蜜、板栗蜂蜜和橡樹蜜在防治胃潰瘍方面的表現(xiàn)相似[9-10]。

胃黏膜受到刺激后也會誘發(fā)活性氧的過度表達(dá)造成生物大分子氧化損傷和過氧化作用，其產(chǎn)生的超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等會導(dǎo)致胃組織抗氧化防御系統(tǒng)的紊亂[17-18]。因此，合理地改善胃組織中過度應(yīng)激的氧化狀態(tài)也是防治胃潰瘍的重要途徑之一。然而大部分治療胃潰瘍的藥物，例如質(zhì)子泵抑制劑類的奧美拉唑，僅單純地抑制或中和過度分泌的胃酸，不能介入受損胃組織的氧化應(yīng)激，這也是藥物不能根治胃潰瘍致使其反復(fù)發(fā)作的重要原因[1]。本實驗通過HPLC/ESI-Q-TOF-MS對紫穗槐蜂蜜所含的主要酚酸和黃酮進(jìn)行了定性和定量分析，其中丁香酸、木樨草素和柚皮素等都被研究證實具有良好的抗氧化活性[19-20]。實驗結(jié)果證明，紫穗槐蜂蜜能夠通過促進(jìn)機(jī)體胃組織抗氧化酶（SOD）活力、提高非酶類抗氧化物（GSH）含量、抑制脂質(zhì)過氧化程度（MDA含量）來改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而實現(xiàn)對酒精性胃潰瘍的預(yù)防性保護(hù)作用。相較而言，低劑量紫穗槐蜂蜜處理對小鼠胃組織的MDA抑制作用和SOD活力提高作用分別優(yōu)于土耳其橡樹蜜和新西蘭麥盧卡蜂蜜[9-10]。

酒精性胃潰瘍損害與炎癥反應(yīng)也存在關(guān)聯(lián)性，過量乙醇的攝入會刺激胃黏膜上的微循環(huán)血管，產(chǎn)生 大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，破壞胃組織正常結(jié)構(gòu)及生理功能[21]。PGE2是胃黏膜完整性、胃組織pH值環(huán)境及胃黏液分泌水平的重要調(diào)節(jié)因子，對胃潰瘍的防治有重要意義[22-24]。本實驗中，紫穗槐蜂蜜處理能夠有效緩解乙醇攝入對PGE2生成的抑制。NO是胃腸道中非膽堿能和非腎上腺能神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子，乙醇誘發(fā)的胃潰瘍通常與NO途徑的調(diào)節(jié)失常有關(guān)[9,25]。高劑量紫穗槐蜂蜜的預(yù)處理可以顯著改善小鼠機(jī)體內(nèi)的NO調(diào)節(jié)失常，使其維持在正常水平。NF-κB是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和急性炎癥表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠激發(fā)促炎因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）轉(zhuǎn)錄表達(dá)的上調(diào)[26]。TNF-α、IL-6和IL-1β是機(jī)體中最常見的促炎因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[27-29]。本實驗中，qPCR及免疫組化染色結(jié)果均表明，紫穗槐蜂蜜的預(yù)先灌胃可以有效抑制乙醇引起的TNF-α因子的激增、NF-κB p65免疫組化的陽性表達(dá)和IL-6及IL-1β因子基因的正向表達(dá)。另外，iNOS是機(jī)體內(nèi)NO水平調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)，過度的iNOS表達(dá)會造成機(jī)體內(nèi)有害NO的累積，這部分NO與胃潰瘍和慢性潰瘍性結(jié)腸炎的病發(fā)有關(guān)[30]。同樣地，紫穗槐蜂蜜能夠有效抑制胃潰瘍小鼠胃組織中iNOS的正向（陽性）表達(dá)，避免有害NO的過渡積累以此達(dá)到預(yù)防酒精性胃潰瘍的效果。已有研究證明，紫穗槐果實和葉子富含異黃酮、查耳酮等黃酮類化合物，具有良好的抗炎作用，能夠明顯抑制二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳廓腫脹及醋酸導(dǎo)致的毛細(xì)血管通透性的增加[31-32]，蜜源植物作為蜂蜜植物化學(xué)成分主要來源，影響著蜂蜜的生化成分和藥用特性，由此推斷，紫穗槐蜂蜜中黃酮類物質(zhì)也是其對急性酒精性胃潰瘍炎癥因子抑制作用的重要生物活性成分。

綜上，紫穗槐蜂蜜對急性酒精性胃潰瘍具有良好的預(yù)防作用。可能的作用機(jī)制包括保護(hù)機(jī)體胃黏膜完整性、改善組織氧化應(yīng)激狀態(tài)和抑制炎癥因子的表達(dá)，提示紫穗槐蜂蜜具備開發(fā)為預(yù)防胃潰瘍天然食品的潛能。