毛金竹,肖淑玲,楊智淳,王孝宇,張?jiān)?,陳俊宏,謝佶晟,陳福德,黃子諾,馮天宇,張璦琿,6,方柏山,6,7
(1廈門(mén)大學(xué)遺傳工程機(jī)器設(shè)計(jì)創(chuàng)新實(shí)踐平臺(tái),福建廈門(mén)361005;2廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建廈門(mén)361005;3廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院,福建廈門(mén)361005;4廈門(mén)大學(xué)材料學(xué)院,福建廈門(mén)361005;5廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,福建廈門(mén)361005;6廈門(mén)市合成生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén)361005;7福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén)361005)
二十世紀(jì)中葉以來(lái),隨著化學(xué)品生產(chǎn)工藝的革新,廉價(jià)高效的農(nóng)藥逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的“必需品”。圖1(a)表明,世界每公頃耕地面積的農(nóng)藥使用量(kg/ha)從1990年至2017年增長(zhǎng)了70%[1]。在全球范圍內(nèi),每年農(nóng)藥的使用量接近30億千克,商品估值約為400億美元[2],這些數(shù)據(jù)表明農(nóng)藥的市場(chǎng)十分龐大并不斷擴(kuò)張。
雖然農(nóng)藥的使用有效地避免了農(nóng)作物的病蟲(chóng)害,提高了產(chǎn)量,但隨著農(nóng)藥的使用范圍不斷擴(kuò)大,其對(duì)于環(huán)境的污染和動(dòng)植物的危害也顯露出來(lái),直接威脅著人類(lèi)的健康[圖1(b)]?;瘜W(xué)合成農(nóng)藥是應(yīng)用最廣泛、毒副作用最顯著的一類(lèi)農(nóng)藥,包括有機(jī)磷類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)等[2]。這類(lèi)農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長(zhǎng)并且能夠在自然界長(zhǎng)期存在并蓄積[3],從而引起環(huán)境污染。據(jù)研究報(bào)道,在地下水、地表水[4]、土壤[5]、空氣[6]和高海拔地區(qū)[7]都能檢測(cè)到這類(lèi)農(nóng)藥?;瘜W(xué)合成農(nóng)藥還表現(xiàn)出廣泛的毒性,有機(jī)磷農(nóng)藥和有機(jī)氯農(nóng)藥具有強(qiáng)的神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)等[8-15]毒性。擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑雖然毒性較小,但也被報(bào)道能夠增加多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[16-18]。農(nóng)藥殘留對(duì)人類(lèi)的健康造成了極大的威脅,對(duì)其進(jìn)行有效檢測(cè)成為保障人類(lèi)健康安全的重要環(huán)節(jié)。但常規(guī)的檢測(cè)手段操作復(fù)雜、等待時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)成本昂貴[19],無(wú)法滿(mǎn)足農(nóng)殘?jiān)粰z測(cè)的需要。因此開(kāi)發(fā)靈敏度高、特異性好、耐用性強(qiáng)的便攜快速檢測(cè)方法對(duì)微量甚至是痕量的農(nóng)殘進(jìn)行有效監(jiān)控已成為農(nóng)藥檢測(cè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)之一。
合成生物學(xué)作為一門(mén)新興科學(xué),通過(guò)基因編輯手段和工程化思維對(duì)生物體進(jìn)行改造與創(chuàng)新,常被稱(chēng)作變革性的工具。其獨(dú)特的創(chuàng)造性近幾十年來(lái)給多個(gè)領(lǐng)域和行業(yè)帶來(lái)了新的生機(jī)與活力。以環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域?yàn)槔煤铣缮飳W(xué)改造出的菌株能夠有效檢測(cè)和降解多種環(huán)境污染物[20-22],其中包括對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。合成生物學(xué)能夠?qū)鹘y(tǒng)的生物傳感器、農(nóng)殘誘導(dǎo)操縱子等響應(yīng)部件和輸出不同信號(hào)的報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行多樣化組合,激發(fā)傳統(tǒng)生物檢測(cè)技術(shù)的新潛能,為多種農(nóng)殘的檢測(cè)提供新的思路與方法。原位檢測(cè)農(nóng)殘的特點(diǎn)更是傳統(tǒng)檢測(cè)手段無(wú)法比擬的,高靈敏度和多輸出信號(hào)也打破了農(nóng)殘檢測(cè)的固有局限,拓寬了檢測(cè)的應(yīng)用范圍。對(duì)比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段,本文歸納與總結(jié)當(dāng)前合成生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用與創(chuàng)新,分析其具有的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)。
圖1 世界農(nóng)藥使用量情況及其危害[1]Fig.1 World pesticide use and itshazards[1]
目前檢測(cè)農(nóng)藥殘留的傳統(tǒng)方法大致可分為兩類(lèi):一類(lèi)是以色譜法、質(zhì)譜法、光譜法以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等方法為代表的常規(guī)方法,這些方法能夠提供可靠的分析結(jié)果,但操作費(fèi)時(shí)、預(yù)處理復(fù)雜、成本昂貴且需要使用大量的有機(jī)溶劑,因此不適用于針對(duì)大量樣品的檢測(cè)工作[23];另一類(lèi)則是基于各種生物傳感器的先進(jìn)檢測(cè)方法,操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低且適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),但高昂的開(kāi)發(fā)成本限制了其在現(xiàn)階段的應(yīng)用。
1.1.1 氣相色譜法 氣相色譜(GC)適用于分析非極性、易揮發(fā)且易氣化的化合物。其通常與特定的檢測(cè)器結(jié)合用于不同農(nóng)藥檢測(cè),表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能[24],如電子捕獲檢測(cè)器(ECD)適用于檢測(cè)鹵代化合物,火焰光度檢測(cè)器(FPD)主要用于測(cè)定含硫和磷的農(nóng)藥化合物,氮磷檢測(cè)器(NPD)對(duì)含有氮和磷的農(nóng)藥有極高的選擇性,而火焰離子化檢測(cè)器(FID)則幾乎適用于各種農(nóng)藥的檢測(cè)[25]。
1.1.2 液相色譜法 液相色譜(LC)可以用于檢測(cè)強(qiáng)極性、揮發(fā)性弱及對(duì)熱敏感的化合物,一般與熒光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器等檢測(cè)裝置聯(lián)用。其中高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)[26]。
1.1.3 質(zhì)譜法 質(zhì)譜法(MS)常與GC、LC聯(lián)用。GC-MS檢測(cè)器擁有更強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確性、結(jié)果重現(xiàn)性以及抗干擾性。此外,使用GC-MS能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)方法靈敏度與抗干擾能力[25]。LC-MS極大地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與選擇性,且能夠同時(shí)完成不同農(nóng)藥成分的識(shí)別與確認(rèn)。由于其無(wú)須衍生化、高靈敏度等特點(diǎn),近年來(lái)已經(jīng)成為多組分農(nóng)殘分析中的首選方法[26]。
酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法因其低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被格外重視。該方法基于抗原-抗體間的特異性相互作用,因此能為某些農(nóng)藥提供特異性極高的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí),該方法能夠一次性裝載大量樣品,極大地簡(jiǎn)化了樣品的處理程序[27]。
單鏈抗體(scFvs)和納米抗體(VHHs)等小抗體與特定蛋白進(jìn)行融合產(chǎn)生的新型酶聯(lián)免疫吸附方法也開(kāi)始出現(xiàn)[28-29],常見(jiàn)的設(shè)計(jì)為抗體-堿性磷酸酯酶(AP)融合體。如圖2所示,這種融合表達(dá)設(shè)計(jì)能夠省去二抗的步驟,是一種簡(jiǎn)單快速的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。該法已被應(yīng)用于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥[28,30-31]、有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥[32-34]的檢測(cè)。但該技術(shù)特異性較差,對(duì)于特定農(nóng)藥檢測(cè)的專(zhuān)一性不夠強(qiáng),無(wú)法勝任未知樣品的農(nóng)殘檢測(cè)[35]。
毛細(xì)管電泳法(CE)對(duì)樣品量要求較低、分離效率高且耗時(shí)短。但毛細(xì)管內(nèi)徑較小,在檢測(cè)中只允許少量進(jìn)樣,因此在靈敏度方面有一定的欠缺,一般與高靈敏度的檢測(cè)方法(如MS)聯(lián)用以彌補(bǔ)不足[36],或者通過(guò)更高效的樣品濃縮方法來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度[37]。該方法與色譜法及ELISA相比,進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率并降低了成本。
表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法具有快速測(cè)定食品中農(nóng)藥殘留的能力,其靈敏度極高且操作方便。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種SERS檢測(cè)方法:原位SERS方法,可直接檢測(cè)植物表面的農(nóng)藥殘留[38-39];以納米銀粒子為基質(zhì)的SERS方法無(wú)須樣品處理即可檢測(cè)飲料樣品[40];結(jié)合表面拭子的SERS方法可對(duì)水果表面殘留的農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)[41]。但使用該方法需建立不同農(nóng)藥分子的光譜數(shù)據(jù)庫(kù),并對(duì)農(nóng)藥的代謝物、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物等進(jìn)行光譜學(xué)的研究。
圖2 利用scFv-AP進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)[32]Fig.2 The competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed using scFv-AP[32]
傳統(tǒng)的無(wú)細(xì)胞生物傳感器基于配體-受體特異性結(jié)合的原理,將待檢測(cè)物的含量、種類(lèi)等信息通過(guò)不同的方法轉(zhuǎn)化為各種信號(hào),從而達(dá)到定量檢測(cè)的目的[42-47]。這類(lèi)方法與前述的方法相比集成度高、簡(jiǎn)單便攜且不依賴(lài)于精密儀器。
1.5.1 電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)傳感器依靠不同的酶與特定農(nóng)藥結(jié)合后釋放的電信號(hào)完成對(duì)農(nóng)藥的識(shí)別與定量,一般將酶純化后固定于電極進(jìn)行檢測(cè)。酶及電極材料的選擇對(duì)傳感器特性影響顯著。傳統(tǒng)的乙酰膽堿酶(AChE)傳感器檢測(cè)番茄中的農(nóng)藥,常見(jiàn)農(nóng)藥檢出限約為2μmol/L[42]。而使用Fe3O4/羧基化多壁碳納米管修飾過(guò)的金電極作為負(fù)載材料時(shí),針對(duì)某些常見(jiàn)農(nóng)藥的檢出限可低至0.1 nmol/L[43]。但這種方法的局限在于酶的純化成本較高,操作也十分復(fù)雜。與全細(xì)胞生物傳感器相比,重復(fù)使用性能不足。
1.5.2 壓電生物傳感器 將能與待測(cè)物特異性結(jié)合的蛋白負(fù)載在具有壓電效應(yīng)的材料上,待測(cè)物存在時(shí),其與蛋白之間的吸附作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)量發(fā)生變化,這種變化會(huì)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),放大后實(shí)現(xiàn)農(nóng)殘定量檢測(cè)。二氧化硅作為傳統(tǒng)的壓電材料,在早期常作為承載物使用[44]。近些年隨著材料技術(shù)的發(fā)展,選用聚合物材料作為承載物開(kāi)始逐漸成為一種趨勢(shì)[45]。
1.5.3 熒光探針生物傳感器 通過(guò)設(shè)計(jì)熒光探針測(cè)定酶活,進(jìn)而檢測(cè)農(nóng)殘的方法在氨基甲酸酯類(lèi)和有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)殘檢測(cè)中都有廣泛的應(yīng)用。有機(jī)磷和氨基甲酸酯能夠抑制乙酰膽堿酯酶的催化作用,利用這一特性開(kāi)發(fā)了基于乙酰膽堿酯酶(AChE)催化的高靈敏度熒光生物傳感器[46-47],其作用原理見(jiàn)圖3。
傳統(tǒng)的生物傳感器主要以無(wú)細(xì)胞傳感器為主,利用純化蛋白結(jié)合負(fù)載材料或設(shè)計(jì)探針的方法實(shí)現(xiàn)農(nóng)殘的檢測(cè)。與之不同的是,合成生物學(xué)傳感器則在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建響應(yīng)農(nóng)殘分子的模塊化基因回路,農(nóng)殘分子或其降解產(chǎn)物在胞內(nèi)特異性的結(jié)合啟動(dòng)了響應(yīng)模塊的表達(dá),以此實(shí)現(xiàn)農(nóng)殘分子快速和高靈敏的檢測(cè)。綜上所述,現(xiàn)行的一些傳統(tǒng)農(nóng)殘檢測(cè)方法仍存在成本高、操作復(fù)雜等局限性,尋求能夠突破這種局限的創(chuàng)新方法成為當(dāng)前研究的主要目標(biāo),合成生物學(xué)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)創(chuàng)造了可能。
近年來(lái)合成生物學(xué)模塊化、工程化思想逐漸應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域,本節(jié)將結(jié)合目前合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用(表1),對(duì)其應(yīng)用原理進(jìn)行介紹。
合成生物學(xué)技術(shù)可以在細(xì)菌體內(nèi)構(gòu)建模塊化基因回路并建立起能夠檢測(cè)特定類(lèi)型農(nóng)藥的全細(xì)胞生物傳感器。生物傳感器的構(gòu)建不再需要純化蛋白的復(fù)雜步驟,而是將整個(gè)細(xì)胞作為檢測(cè)器,大大節(jié)省了時(shí)間和成本。
2.1.1 表面展示水解酶 當(dāng)前研究已報(bào)道了多種能夠降解特定農(nóng)殘的酶,如有機(jī)磷水解酶(OPH)[60]、甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)[61-62]、γ-六氯環(huán)己烷脫氫氯酶[48]等。這些酶能夠?qū)⑥r(nóng)殘降解為更易于檢測(cè)的
圖3 基于AChE的高靈敏度熒光生物傳感器[46]Fig.3 High sensitivity fluorescent biosensor based on AChE[46]
表1 合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Application of synthetic biology in pesticide residue detection
小分子或特征化合物,通過(guò)檢測(cè)降解產(chǎn)物可以間接測(cè)定農(nóng)殘含量。這些酶的發(fā)現(xiàn)及其基因鑒定是合成生物學(xué)的改造基礎(chǔ)。農(nóng)殘降解酶通常存在于土壤微生物體內(nèi),但這些微生物往往繁殖能力弱、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高、產(chǎn)酶效率低,不適合作為全細(xì)胞生物傳感器的底盤(pán)細(xì)胞。合成生物學(xué)技術(shù)將原始宿主菌體內(nèi)的降解途徑轉(zhuǎn)移到易于進(jìn)行基因操作的細(xì)菌體內(nèi),成功構(gòu)建出高效的農(nóng)殘檢測(cè)工程菌株[48]。同時(shí)為了避免農(nóng)藥低效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)運(yùn)的損失,常通過(guò)表面展示系統(tǒng)將降解酶表達(dá)在菌體表面,利用體外催化的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)殘的降解與檢測(cè)[53-54,63]。除催化型的生物傳感器外,近些年利用重組基因技術(shù)在菌體表面展示抗體的農(nóng)殘檢測(cè)方法也開(kāi)始出現(xiàn)[58]。
2.1.2 轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng) 操縱子系統(tǒng)對(duì)農(nóng)殘進(jìn)行特異性響應(yīng)也是合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的一種重要應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以結(jié)合特定的農(nóng)藥化合物,進(jìn)而作用于相應(yīng)的啟動(dòng)子,開(kāi)啟其轉(zhuǎn)錄過(guò)程。其作用原理如圖4所示:將各種類(lèi)型的報(bào)告基因插入到啟動(dòng)子的下游,若試樣中有農(nóng)殘存在,則會(huì)激活啟動(dòng)子,啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá),通過(guò)檢測(cè)輸出信號(hào)測(cè)定農(nóng)殘含量。操縱子與報(bào)告基因多樣化組合的特點(diǎn),使得不同強(qiáng)度甚至響應(yīng)不同農(nóng)藥的基因元件可以組合使用,并且能夠進(jìn)行靈活多變的調(diào)節(jié),應(yīng)用范圍十分廣泛,如AtzR[49]、DmpR等[64]。
圖4 農(nóng)藥分子特異性激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Fig.4 Pesticide specific activation of transcription regulators
多種農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物具有干擾細(xì)胞內(nèi)分泌的功能,表現(xiàn)為雌激素樣作用或抗雌激素樣作用,因而可以通過(guò)內(nèi)分泌干擾物篩選試驗(yàn)進(jìn)行農(nóng)殘檢測(cè)[65]。利用這一特性已開(kāi)發(fā)了酵母轉(zhuǎn)錄激活基因(GAL4)雙元系統(tǒng)等一系列的農(nóng)殘檢測(cè)方法[66]。GAL4雙元系統(tǒng)法中兩種質(zhì)粒:表達(dá)雌激素受體配體結(jié)合域(ERdef)和Gal4融合蛋白的pGal4-ERdef質(zhì)粒與Gal4反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pUAS-tk-Luc共轉(zhuǎn)化,其中Gal4能夠顯著誘導(dǎo)UAS下游基因的表達(dá)。通過(guò)測(cè)試樣品是否誘導(dǎo)/拮抗Luc(熒光素酶)表達(dá),來(lái)判斷試樣中是否存在農(nóng)殘。合成生物學(xué)方法使用報(bào)告基因顯示樣品的內(nèi)分泌干擾作用使得農(nóng)殘檢測(cè)更加直觀(guān)和方便,增加可視性的同時(shí)也大大降低了農(nóng)殘檢測(cè)的難度。
無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)指的是構(gòu)造的工程化回路在無(wú)細(xì)胞底盤(pán)的類(lèi)細(xì)胞系統(tǒng)中(含有細(xì)胞表達(dá)的必需成分)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[67],其能精準(zhǔn)控制各組分的混合比例,與簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)建模相結(jié)合,檢測(cè)更加準(zhǔn)確。無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的出現(xiàn),規(guī)避了基因修飾微生物(genetically modified organisms,GMOs)的釋放,避免了生物安全性問(wèn)題[68],使得合成生物學(xué)應(yīng)用于農(nóng)殘的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)更為安全,更具實(shí)用性。同時(shí)無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)方法對(duì)于檢測(cè)環(huán)境的要求更為寬松,能夠在高毒性環(huán)境下工作,適應(yīng)多種農(nóng)殘檢測(cè)的需要。該系統(tǒng)還能避免農(nóng)藥進(jìn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率低、重組菌發(fā)生基因突變等問(wèn)題。目前使用熒光素酶作為報(bào)告基因的無(wú)細(xì)胞生物傳感器已成功用于轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的檢測(cè)研究[69],但無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的研究還十分稀缺,主要原因是目前對(duì)天然的體內(nèi)遺傳學(xué)的研究仍不透徹,其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具有極大的挑戰(zhàn)性。高成本、技術(shù)難度大、實(shí)施困難等弊端嚴(yán)重地限制了其開(kāi)發(fā)與規(guī)?;瘧?yīng)用[67],隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新,相信未來(lái)的農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域?qū)?huì)涌現(xiàn)出一系列優(yōu)秀的無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)檢測(cè)方法。
從本節(jié)的敘述中可以發(fā)現(xiàn),合成生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用原理十分多元化,足以表明合成生物學(xué)在此領(lǐng)域具有巨大的研發(fā)價(jià)值與應(yīng)用潛力。
有機(jī)氯農(nóng)藥(OCs)是一類(lèi)半衰期長(zhǎng)的有機(jī)化合物,常見(jiàn)的有機(jī)氯農(nóng)藥有二氯二苯基三氯乙烷(DDT)、林丹(γ-HCH)、阿特拉津、β-六氯環(huán)己烷(β-HCH)等。由于使用廣泛和半衰期較長(zhǎng),OCs已成為環(huán)境中普遍存在的污染物[70]。
對(duì)于有機(jī)氯農(nóng)藥,目前的主要檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜法、固相萃取色譜法等復(fù)雜精細(xì)的方法,這些方法費(fèi)時(shí)又昂貴,不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近些年來(lái)針對(duì)此類(lèi)農(nóng)藥,已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些極具潛力的合成生物學(xué)檢測(cè)方法。
3.1.1 代謝礦化作用 檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥的主要思路是將難以直接檢測(cè)的有機(jī)物初步代謝為易于檢測(cè)的化合物。研究表明γ-六氯環(huán)己烷氯化氫酶通過(guò)三步脫氯作用,可初步降解林丹(γ-HCH),并釋放三個(gè)HCl分子。聚苯胺的質(zhì)子化程度及其電導(dǎo)率隨pH的降低而增加,將HCH脫氯化氫酶(LinA2)基因?qū)氪竽c桿菌中表達(dá),并將工程菌固定在可檢測(cè)pH變化的聚苯胺基質(zhì)中,施加0.4 V電勢(shì)時(shí),電流可隨pH的降低(HCl分子的產(chǎn)生)而增加,因而構(gòu)建出高靈敏度、選擇性強(qiáng)的林丹(γ-HCH)全細(xì)胞傳感器[48]。
而在Gong等[71]的研究中,在底盤(pán)生物惡臭假單胞菌KT2440中組裝了來(lái)自三種不同微生物的七種酶,將γ-HCH完全礦化為CO2和H2O。盡管尚未有基于此的檢測(cè)研究成果報(bào)道,但是若能設(shè)計(jì)出響應(yīng)這一過(guò)程分解產(chǎn)物的生物元件,便能開(kāi)發(fā)出全新的農(nóng)藥檢測(cè)傳感器。
3.1.2 激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子法 Hua等[49]利用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AtzR與阿特拉津降解產(chǎn)物氰尿酸的特異性結(jié)合能夠作用于atzD啟動(dòng)子輸出信號(hào)的特點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)阿特拉津的檢測(cè)。在此研究中,atzD啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子AtzR與氰尿酸作用,讓氰尿酸檢測(cè)從pH檢測(cè)、電流檢測(cè)等中脫離出來(lái),以lux CDABE基因?qū)崿F(xiàn)生物發(fā)光報(bào)告氰尿酸的濃度,直接明了且易于操作。
有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)是磷酸及其衍生物的酯類(lèi)化合物,其主要的作用機(jī)制是抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性[11]。由于有機(jī)磷農(nóng)藥具有多種毒性,其一直是農(nóng)殘檢測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象。
目前針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的合成生物學(xué)檢測(cè)手段主要分為兩大類(lèi):一類(lèi)是基于有機(jī)磷水解酶(OPH)、甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)等催化型的生物傳感器;另一類(lèi)是基于乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制型的生物傳感器[50,72]??紤]到純化酶成本和有機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)入胞效率等問(wèn)題[28-29,73],目前的研究通常在菌體表面展示相關(guān)酶,常用的表面展示系統(tǒng)包括Lpp-OmpA[22,50,73]、INPNC[22,53-54,63]等。
3.2.1 表面展示有機(jī)磷水解酶(OPH)有機(jī)磷水解酶(OPH)是一種能夠水解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的酶[60],由opd基因編碼。其水解產(chǎn)物多樣化,可與多種感應(yīng)系統(tǒng)搭配使用,應(yīng)用價(jià)值高。
(1)pH檢測(cè)法 目前已在大腸桿菌、酵母菌等菌體內(nèi)成功表達(dá)OPH,催化有機(jī)磷生成質(zhì)子。其與表面展示系統(tǒng)聯(lián)用,可通過(guò)測(cè)定菌體周?chē)膒H,建立有機(jī)磷濃度與pH之間的定量關(guān)系,從而實(shí)現(xiàn)直接、快速、便捷檢測(cè)有機(jī)磷的目的[21,50]。檢測(cè)裝置如圖5所示,將工程細(xì)胞懸液滴入聚碳酸酯膜中心,并將細(xì)胞固定膜連接到pH電極的氫離子傳感玻璃表面,將溶解在純甲醇中的有機(jī)磷神經(jīng)毒劑(5~10μl)添加到電池中(過(guò)程在恒溫的緩沖液中進(jìn)行),用pH/離子分析儀記錄電勢(shì)(即pH)的變化最后傳輸?shù)接涗浧?,這種檢測(cè)方法已被證實(shí)可在2個(gè)月內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性,檢測(cè)限可低至2μmol/L[50]。
此外利用綠色熒光蛋白(GFP/EGFP)的熒光值能對(duì)pH變化做出快速響應(yīng)的特點(diǎn)也可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。如圖6所示,將水解酶與熒光蛋白融合[22]或共同表面展示[51,60],通過(guò)熒光顯微鏡測(cè)定全細(xì)胞熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的檢測(cè),檢測(cè)十分快速,較電極法操作更簡(jiǎn)便。
雖然pH檢測(cè)法簡(jiǎn)便快速,但其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的特異性不強(qiáng),易受到多種因素的干擾,對(duì)于一些較為復(fù)雜的檢測(cè)情況,其實(shí)用性仍存在一定的問(wèn)題。
(2)對(duì)硝基苯酚(PNP)響應(yīng)法 OPH降解對(duì)硝基苯基取代的有機(jī)磷農(nóng)藥的產(chǎn)物之一是對(duì)硝基苯酚(PNP),因而對(duì)對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)的另一種思路是檢測(cè)PNP的濃度。
通過(guò)合成生物學(xué)構(gòu)造表面展示OPH的重組大腸桿菌細(xì)胞降解產(chǎn)生PNP,從而開(kāi)發(fā)出的光纖生物感應(yīng)器就是其中一個(gè)成功的案例[52]。該系統(tǒng)適用于多種有機(jī)磷的檢測(cè),具有較強(qiáng)的選擇性。此外,直接利用分光光度計(jì)在410 nm處檢測(cè)PNP也顯示出較寬的檢測(cè)范圍和較強(qiáng)的特異性,還具有比光纖檢測(cè)系統(tǒng)更加優(yōu)良的靈敏度[53]。
而間接響應(yīng)PNP需要借助能夠降解PNP的惡臭 假 單 胞 菌JS444(Pseudomonas putidaJS444)[74]。通過(guò)基因改造在惡臭假單胞菌JS444表面展示OPH,使其能夠同時(shí)降解有機(jī)磷(OPs)和PNP。一系列的酶促反應(yīng)會(huì)消耗氧氣,故將其與溶解氧電極搭配能建立有機(jī)磷農(nóng)藥含量與電流之間的定量關(guān)系,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硝基苯基取代的有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)[54,75]。與前文pH檢測(cè)法相類(lèi)似,將工程菌固定在氧電極上,向電池中添加10~20μl已知濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液,使用數(shù)字生物氧監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè),最后傳輸數(shù)據(jù)至圖表記錄器,5 min后測(cè)量氧電極的穩(wěn)態(tài)輸出。出色的靈敏度、穩(wěn)定性和便攜易操作的優(yōu)勢(shì)都使其成為合成生物學(xué)在農(nóng)殘檢測(cè)中應(yīng)用的經(jīng)典案例。此外,惡臭假單胞菌JS444還可被另一種能夠降解PNP的莫拉氏菌屬(Moraxellasp.)代替[76],可起到同樣的效果[55,77]。
3.2.2 激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子法 已發(fā)現(xiàn)了對(duì)氧磷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[78]及能夠被毒死蜱(CPF)敏感型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(ChpR)開(kāi)啟的啟動(dòng)子ChpA[56],若在它們下游安插報(bào)告基因,可通過(guò)對(duì)報(bào)告信號(hào)的監(jiān)測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。此外,還存在多種能夠被對(duì)硝基苯酚(PNP)激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,并已應(yīng)用于有機(jī)磷的檢測(cè),如PnpR[57]、DmpR[64]。OPH催化產(chǎn)生的PNP激活轉(zhuǎn)錄因子,被激活的轉(zhuǎn)錄因子與同源啟動(dòng)子結(jié)合(如PnpR-PnpC,DmpR-Pdmp),可開(kāi)啟下游報(bào)告基因的表達(dá),通過(guò)比色法或其他檢測(cè)技術(shù)就可簡(jiǎn)單、快速地對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)。該法能夠與多種報(bào)告基因組合,可根據(jù)不同的檢測(cè)需要進(jìn)行方案調(diào)整,充分體現(xiàn)了合成生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)。
圖5 pH玻璃電極檢測(cè)有機(jī)磷[50]Fig.5 Detection of organophosphorus by pH glass electrode[50]
圖6 表面展示水解酶及綠色熒光蛋白[22,51]Fig.6 Surface display of hydrolase and green fluorescent protein[22,51]
擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)多種害蟲(chóng)具有殺傷作用,毒性相對(duì)較小,一直被廣泛使用,但長(zhǎng)期接觸仍會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物帶來(lái)內(nèi)分泌干擾、免疫毒性等多種不良反應(yīng)。因此農(nóng)副產(chǎn)品和食品中擬除蟲(chóng)菊酯的殘留問(wèn)題也不容忽視[79]。
3.3.1 基于重組基因技術(shù)的免疫檢測(cè) 近些年免疫檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展,已經(jīng)有研究者設(shè)計(jì)了高效的針對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的免疫測(cè)定法[80]。擬除蟲(chóng)菊酯在人類(lèi)體內(nèi)會(huì)較快代謝為3-苯氧基苯甲酸(3-PBA),因此3-PBA是一種用于監(jiān)測(cè)人類(lèi)接觸擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的生物標(biāo)志物[28,58]。Riangrungroj等[58]研究出了一種響應(yīng)3-PBA的全細(xì)胞生物傳感器。其使用合成生物學(xué)技術(shù)在大腸桿菌表面展示抗3-PBA VHH。當(dāng)工程細(xì)胞與加入的牛血清白蛋白偶聯(lián)的3-PBA半抗原(3-PBA-hapten-BSA)結(jié)合時(shí),可以直觀(guān)地觀(guān)察到細(xì)胞粘連。若樣品中存在游離的3-PBA,其與3-PBA-hapten-BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VHH,破壞細(xì)胞粘連并使之沉淀。同時(shí)通過(guò)共表達(dá)紫藍(lán)色amilCP色素蛋白使細(xì)胞著色,提高了檢測(cè)性能,檢測(cè)限可低至3 ng/ml。
3.3.2 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn) 借助擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的雌激素樣作用[81]及其降解產(chǎn)物3-PBA的抗雌激素活性開(kāi)發(fā)出了一種雌激素受體(hERα/rERα)介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告法[66]。利用雌激素結(jié)合域(ERdef)和GAL4的融合蛋白及GAL4反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pUAS-tk-Luc,測(cè)試樣品是否誘導(dǎo)Luc(熒光素酶)表達(dá)或拮抗Luc表達(dá),來(lái)判斷試樣中是否存在擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥。此外,將雌激素受體(ER)替換成雄激素受體(AR),也顯現(xiàn)出類(lèi)似的作用原理[82-83]。但由于自然界有多種能夠影響雌激素作用的物質(zhì),故該方法不適合用于針對(duì)未知樣品的檢測(cè)。同時(shí)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)的農(nóng)藥雌激素樣作用相對(duì)較弱,甚至在有些研究中未呈現(xiàn)雌激素樣作用[84],這直接導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度不佳[66]。
表2 合成生物學(xué)方法檢測(cè)農(nóng)殘的優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Advantages and disadvantages of synthetic biological methods for pesticide residues detection
氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥在自然環(huán)境下的持久度低且殺蟲(chóng)效果好,因而成為近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的殺蟲(chóng)劑[85]。氨基甲酸酯會(huì)不可逆地抑制中樞和外周神經(jīng)乙酰膽堿酯酶的活性,導(dǎo)致乙酰膽堿在人體內(nèi)大量聚集,嚴(yán)重可致命[86]。
我國(guó)現(xiàn)行氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法有色譜法、膽堿酯酶抑制法等。色譜法儀器體積大、操作要求較為嚴(yán)格。因此建立靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是很必要的[59]。無(wú)細(xì)胞生物熒光傳感器就是一種可行的方法,張昊等[59]從氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥降解菌H5的基因文庫(kù)中篩選出能對(duì)氨基甲酸酯特異性響應(yīng)的啟動(dòng)子基因,在其下游連接熒光蛋白(EGFP)基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,后通過(guò)溶菌酶凍融破碎技術(shù)制備出能高效檢測(cè)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的無(wú)細(xì)胞體系生物熒光傳感器。
雖然現(xiàn)階段合成生物學(xué)在氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用較少,但是一系列氨基甲酸酯類(lèi)化合物的水解酶的發(fā)現(xiàn)及其在大腸桿菌中的成功表達(dá)[87],展現(xiàn)了這一領(lǐng)域的潛力,相信在未來(lái)合成生物學(xué)將會(huì)在氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)殘檢測(cè)中有更大的貢獻(xiàn)。
合成生物學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科,在短短十多年間已經(jīng)取得了眾多突破性的進(jìn)展。目前研究者們已經(jīng)構(gòu)建了大量在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)可用的全細(xì)胞生物傳感器,也開(kāi)發(fā)了一些更具實(shí)際應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)檢測(cè)方法,在多種農(nóng)藥的特異性檢測(cè)方面取得一定的研究成果。這些傳感器大多通過(guò)設(shè)計(jì)巧妙的特異性響應(yīng),使得在特定農(nóng)藥分子存在時(shí)出現(xiàn)易于監(jiān)測(cè)的陽(yáng)性信號(hào),大大方便了農(nóng)殘檢測(cè)[20]。相比傳統(tǒng)方法,這些新方案存在諸多優(yōu)勢(shì)(表2),其不需要大而昂貴的精密儀器,也不需要復(fù)雜的運(yùn)輸和前處理過(guò)程,更加具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、原位監(jiān)測(cè)的潛力,在商業(yè)化上也更有成本優(yōu)勢(shì)。
但是,合成生物學(xué)在農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用尤其是全細(xì)胞傳感器仍然面臨著眾多挑戰(zhàn)。全細(xì)胞生物傳感器一般無(wú)法達(dá)到化學(xué)檢測(cè)的精度,而且在很多情況下由于報(bào)告基因的表達(dá)所需的時(shí)間而造成延長(zhǎng)響應(yīng),此外如何在營(yíng)養(yǎng)缺乏甚至是含毒性化合物的環(huán)境下保存細(xì)胞活力也是必須考慮的問(wèn)題[88]。針對(duì)上述問(wèn)題,研究人員試圖通過(guò)精制宿主植株[89]、設(shè)計(jì)更敏感的啟動(dòng)子[90]、使用表面展示的蛋白[91]等提高微生物傳感器的特異性、敏感性并減少響應(yīng)時(shí)間[92]。選擇水凝膠[93]等材料進(jìn)行封裝,提升安全性同時(shí)方便儲(chǔ)存。
近年來(lái)各種各樣的合成生物學(xué)檢測(cè)方案正在進(jìn)行從實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H推廣應(yīng)用的嘗試。一方面這需要克服前文提到的檢測(cè)限、特異性和培養(yǎng)條件等限制,另一方面也必須考慮生物安全問(wèn)題。這不僅要求研究人員加強(qiáng)生物控制,也要求在應(yīng)用前對(duì)微生物衍生傳感器對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康的潛在影響進(jìn)行更系統(tǒng)的評(píng)估[88]。在未來(lái),微生物傳感器也將向著更自動(dòng)化、更精細(xì)的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)展,具有廣闊的前景[89],合成生物學(xué)勢(shì)必在其中起到關(guān)鍵性的作用。