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    益腎通絡(luò)方對大鼠勃起功能障礙及NO-cGMP通路的影響*

    2021-06-02 11:55:48陳建設(shè)郝高利樊立鵬董亞洲
    中國病理生理雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:西地那非睪酮陰莖

    李 勛,陳建設(shè),門 波,李 暉,陳 翔,張 輝,郝高利,樊立鵬,董亞洲

    [河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)生殖男科,河南鄭州450002]

    勃起功能障礙(erectiledysfunction,ED)是一種常見的男性性功能障礙疾病,患者陰莖不能持續(xù)達(dá)到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活,近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢,不僅影響男性生育能力,也極大威脅其心理及精神健康[1-2]。一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷(nitric oxide-cyclic guanosine momophosphate,NO-cGMP)通路是調(diào)控陰莖勃起的主要信號,NO作為產(chǎn)生和維持陰莖勃起的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì),由一氧化氮合成酶(nitric oxidesynthetase,NOS)在催化下生成,當(dāng)其生成減少時(shí),cGMP水平降低,血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙受阻,從而抑制陰莖的勃起;激活NO-cGMP信號通路,則可改善ED臨床癥狀[2-4]。ED在中醫(yī)理論中屬于“陽痿”,腎陽虧虛、血瘀脈絡(luò)是其主要病機(jī),補(bǔ)腎壯陽、活血通絡(luò)是ED主要的治療手段[5]。益腎通絡(luò)方(Yishentongluo decoction,YSTL)是治療男性不育的經(jīng)驗(yàn)方,可溫腎助陽、益氣活血、散結(jié)通絡(luò),抑制生精細(xì)胞凋亡,提高精索靜脈曲張不育癥患者生精能力,并對肝郁腎虛型ED患者臨床療效顯著[6-7]。但益腎通絡(luò)方對ED大鼠NO-cGMP通路的影響目前還不清楚,本文通過建立ED大鼠模型,對此進(jìn)行探索。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SD大鼠,許可證號為SYXK(粵)2018-0193,深圳康泰生物制品股份有限公司,體重200~240 g。飼養(yǎng)條件:12 h/12 h交替光暗,溫度25℃,濕度55%左右,大鼠自由飲食、飲水,動物房環(huán)境保持安靜、通風(fēng)良好。

    1.2 試劑與儀器益腎通絡(luò)方(丹參30 g、淫羊藿20 g、菟絲子20 g、黃芪20 g、川牛膝10 g、熟地黃10 g和水蛭6 g為1劑)購自康仁堂藥業(yè)有限公司;己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)購自Sigma;西地那非(sildenafil)片(國藥準(zhǔn)字:H20020526)購自美國輝瑞公司;阿撲嗎啡購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司;睪酮放射免疫測定試劑盒購自天津協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司;大鼠cGMPELISA試劑盒,兔源抗NOS、鳥苷酸環(huán)化酶(guanosine cyclase,GC)和GAPDH的Ⅰ抗,以及羊抗兔Ⅱ抗購自Abcam;NOSELISA試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;NOELISA試劑盒購自濰坊祺翔生物科技有限公司;RIPA裂解液和BCA試劑盒購自碧云天。ELx800酶標(biāo)儀購自Bio-Rad;MP150生理儀購自BIOPAC;H6080放免儀購自Carl Zeiss;Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購自Eppendorf;1659001蛋白電泳儀和Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad;GIS-500凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司。

    2 方法

    2.1 大鼠模型制備及分組給藥取SD大鼠,將DES溶于生理鹽水中,以5 mg/kg[8]腹腔注射,每天1次,連續(xù)注射8周后,檢測大鼠血清睪酮水平,并進(jìn)行阿撲嗎啡誘導(dǎo)勃起實(shí)驗(yàn),當(dāng)大鼠血清睪酮水平(71.08±9.86)相比對照組大鼠(335.17±30.12)明顯降低,且在30 min內(nèi)勃起次數(shù)為0時(shí),表明建模成功,共建模63只,成功60只,隨機(jī)分為模型(model)組、益腎通絡(luò)方低(YSTL-low)、中(YSTL-medium)、高(YSTL-high)劑量組和西地那非(sildenafil)組,每組12只,另取12只SD大鼠,腹腔注射等劑量生理鹽水,設(shè)定為對照組。取益腎通絡(luò)方2劑,加水煎煮,過濾得到生藥濃度為2.32 g/mL的藥液100 mL,以生理鹽水稀釋,獲得濃度為0.58、1.16和2.32 g/mL的藥液,益腎通絡(luò)方各劑量組以10 mL/kg[9]灌胃,使終劑量分別為5.8、11.6和23.2 g/kg,西地那非溶于生理鹽水中,制備為0.5 mg/mL的溶液,以10 mL/kg的劑量[10]灌胃,使終劑量為5 g/kg,模型組和對照組以10 mL/kg的生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)用藥4周。

    2.2 阿撲嗎啡誘導(dǎo)勃起實(shí)驗(yàn)以阿撲嗎啡試驗(yàn)檢測大鼠勃起功能[11]:末次給藥24 h后,將大鼠放置在安靜、昏暗的環(huán)境下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前,先讓動物適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境1 h,于頸部皮下注射阿撲嗎啡,劑量為100 μg/kg,然后觀察大鼠陰莖勃起情況,記錄30 min內(nèi)勃起次數(shù)及勃起潛伏期,取其平均值。陰莖勃起標(biāo)志:大鼠龜頭充血、陰莖體增長并露出,有時(shí)伴有射精、彎腰舔食陰莖及打哈欠等動作。勃起潛伏期:從阿撲嗎啡注射結(jié)束至大鼠出現(xiàn)第1次陰莖勃起之間所用的時(shí)間,若30 min內(nèi)大鼠未勃起,則勃起潛伏期為30 min。

    2.3 大鼠最大陰莖海綿體內(nèi)壓(maximum intracavernous pressure,Max ICP)/平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)的檢測勃起實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠禁食12 h,通過電刺激海綿體神經(jīng),使陰莖海綿體充血勃起,參數(shù)為電流5 mA,頻率50 Hz,脈沖寬度61.66 ms,持續(xù)60 s,以生理儀連續(xù)監(jiān)測ICP及MAP,計(jì)算Max ICP/MAP值。

    2.4 大鼠血清睪酮水平、陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平的測定2.3中的檢測結(jié)束后,各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血2 mL,靜置后4℃、3 000 r/min離心,取上清液,得到血清備用,然后吸入乙醚麻醉大鼠后處死,分離陰莖組織,剪取約3 g,剪碎后加入蛋白裂解液,以勻漿機(jī)制備為勻漿液,4℃、3 000 r/min離心20 min,取上清液,參照試劑盒說明書,以BCA法測定其中蛋白總濃度,血清及蛋白樣品液各取500 μL,采用試劑盒分別測定血清中睪酮水平、陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,剩余蛋白樣品液進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

    2.5 大鼠陰莖組織中NOS和GC蛋白表達(dá)的測定各組分別取含20μg總蛋白的2.4中剩余的樣品液,上樣,進(jìn)行電泳,然后濕轉(zhuǎn),將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,經(jīng)5%牛奶溶液封閉后(室溫孵育2 h),分別以兔源抗GAPDH、NOS、GC的Ⅰ抗溶液孵育過夜(4℃),稀釋比例均為1∶2 000,TBST溶液漂洗3次,以稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔Ⅱ抗溶液孵育2 h(室溫),TBST溶液漂洗3次,以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影,使用凝膠成像儀對條帶拍照,并采用ImageJ軟件分析圖像,得出蛋白相對表達(dá)量。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 益腎通絡(luò)方對大鼠勃起功能的影響

    與對照組比較,模型組大鼠勃起次數(shù)明顯降低(P<0.05),勃起潛伏期明顯升高(P<0.05);與模型組比較,益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠勃起次數(shù)升高(P<0.05),勃起潛伏期降低(P<0.05),且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性(P<0.05);益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見表1。

    表1 各組大鼠勃起功能、Max ICP/MAP和血清睪酮水平的變化Table 1.Erectile function,Max ICP/MAPand serum testosterone levels in each group(Mean±SD.n=12)

    2 益腎通絡(luò)方對大鼠Max ICP/MAP的影響

    與對照組比較,模型組大鼠Max ICP/MAP明顯降低(P<0.05);與模型組比較,益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠Max ICP/MAP升高(P<0.05),且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性(P<0.05);益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見表1。

    3 益腎通絡(luò)方對大鼠血清睪酮的影響

    與對照組比較,模型組大鼠血清睪酮水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠血清睪酮水平升高(P<0.05),且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性(P<0.05);益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見表1。

    4 益腎通絡(luò)方對大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平的影響

    與對照組比較,模型組大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平升高(P<0.05),且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性(P<0.05);益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見表2。

    5 益腎通絡(luò)方對大鼠陰莖組織中NO-cGMP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與對照組比較,模型組大鼠陰莖組織中NOcGMP通路相關(guān)蛋白NOS和GC蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠陰莖組織中NOS和GC蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性(P<0.05);益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見圖1、表2。

    討 論

    ED的病因復(fù)雜多樣,生理及心理等多方面因素涉及其中,睪酮水平低下是其主要病因之一,肢端肥大癥、甲狀腺疾病、垂體功能減退等均可影響性腺功能,減少睪酮生成,繼而引發(fā)ED,DES作為一種非甾體合成雌激素,可破壞睪丸引帶細(xì)胞的形態(tài),抑制其增殖,損傷男性生殖系統(tǒng)功能,可用來構(gòu)建ED動物模型[8,12-14]。本文通過腹腔注射DES的方法建立ED大鼠模型,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠勃起次數(shù)、Max ICP/MAP、血清睪酮水平明顯降低,勃起潛伏期明顯升高,表明DES可影響睪酮合成,降低其血清水平,損傷大鼠陰莖勃起功能,造成ED,揭示模型建立成功。

    表2 各組大鼠陰莖組織中NOS活性、NO/cGMP含量和NOS/GC蛋白水平的變化Table 2.NOSactivity,NO/cGMPcontent and NOS/GCprotein levels in penile tissue in each group(Mean±SD.n=12)

    Figure 1.The expression of NO-cGMPpathway-related proteins in penile tissue of rats in each group was determined by Western blot.A:control group;B:model group;C:YSTL-low group;D:YSTL-medium group;E:YSTL-high group;F:sildenafil group.圖1 Western blot檢測各組大鼠陰莖組織中NO-cGMP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

    臨床治療ED以對癥治療為主,藥物常采用磷酸二酯酶抑制劑,西地那非作為一種選擇性磷酸二酯酶抑制劑,在臨床中得到廣泛應(yīng)用,但其對部分患者療效不佳,并且存在較多副作用,中醫(yī)藥治療可標(biāo)本兼治,其毒副作用小,具有明顯優(yōu)勢[7,15-16]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,ED即為“陽痿”,腎藏精,內(nèi)寓真陽,主生殖,是先天為之本,若元陽虧損,腎精不足,可導(dǎo)致推動和滋養(yǎng)不足,精血運(yùn)行受阻,瘀血積聚,因而腎精虧損為本,血瘀阻絡(luò)是標(biāo),是ED的重要病機(jī)。益腎通絡(luò)方是治療腎精虧虛的經(jīng)典方劑,方中川牛膝、丹參能通絡(luò)活血,淫羊藿能補(bǔ)助腎陽,菟絲子能填精益腎,黃芪能升陽補(bǔ)氣,熟地黃能補(bǔ)髓生精,水蛭能通經(jīng)化瘀,諸藥合用具有補(bǔ)腎生精,化瘀通絡(luò)的功效,對男性不育癥、性功能障礙等疾病具有較好的療效[17-19]。本文結(jié)果顯示,以益腎通絡(luò)方處理ED模型大鼠,可升高大鼠勃起次數(shù)、Max ICP/MAP、血清睪酮水平,降低勃起潛伏期,且呈劑量依賴性,表明益腎通絡(luò)方可增強(qiáng)睪酮合成,促使血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙,升高陰莖海綿體內(nèi)壓,改善陰莖勃起功能,進(jìn)一步證實(shí)益腎通絡(luò)方對ED具有治療作用,但其藥理機(jī)制目前還不清楚。

    研究證明,NO-cGMP通路在引起并維持陰莖勃起中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用,NO作為一種內(nèi)源性信號分子,由NOS催化產(chǎn)生,可通過激活GC,把GTP轉(zhuǎn)化為cGMP,作用于鈣離子通道,松弛平滑肌,促使血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙,引起陰莖勃起[3-4]。另外,研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)睪酮合成,可激活NO-cGMP信號,增加血清NO含量,顯著改善ED男性性功能,由此可知NO-cGMP是調(diào)控睪酮水平,改善ED臨床癥狀的重要作用靶點(diǎn)[20-21]。本文結(jié)果顯示,ED模型大鼠陰莖組織中NOS活性及NO、cGMP水平、陰莖組織NOS和GC蛋白表達(dá)明顯降低,經(jīng)益腎通絡(luò)方治療后,其陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平、陰莖組織NOS和GC蛋白表達(dá)升高,且呈劑量依賴性,表明NO-cGMP信號參與睪酮合成的調(diào)控及ED的發(fā)病過程,益腎通絡(luò)方可活化該信號通路,增強(qiáng)睪酮的合成,改善ED癥狀。

    綜上所述,益腎通絡(luò)方可上調(diào)NOS和GC蛋白表達(dá),提高陰莖組織中NO和cGMP水平,增強(qiáng)睪酮合成,促使血液流入陰莖,升高陰莖海綿體內(nèi)壓,修復(fù)陰莖勃起功能,激活NO-cGMP信號可能是其藥理機(jī)制。但本文只進(jìn)行了初步研究,證據(jù)還不充足,需以NOcGMP通路激動劑和抑制劑做對照驗(yàn)證,進(jìn)而對益腎通絡(luò)方治療ED的藥理機(jī)制進(jìn)行充分深入的闡釋。

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