miR-155/自噬/外泌體對酒精性肝病的影響*

陳思龍，徐光福，覃詩雨，肖 莉

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長期過度飲酒導(dǎo)致的一種慢性肝臟損傷性疾病，其發(fā)病率在全球逐年增高［1］，在中國已成為繼病毒感染之后的第二大肝損傷原因。ALD可表現(xiàn)為一系列的病理變化，包括脂肪變性，肝炎、肝纖維化和硬化，甚至導(dǎo)致肝癌的發(fā)生［2］。由于其病理機制復(fù)雜，目前尚無有效的臨床治療手段和藥物［3］。深入探討ALD的病理機制，具有重要的科學(xué)研究意義和臨床應(yīng)用前景。

肝臟巨噬細胞（即kupffer細胞）的持續(xù)過度活化對誘導(dǎo)和推動ALD具有舉足輕重的作用［4］。以巨噬細胞為靶點，抑制ALD中肝臟過度的炎癥反應(yīng)被認為是治療ALD的重要研究方向［5］。基于腸源性內(nèi)毒素激活肝內(nèi)巨噬細胞的作用［6］，使用腸道抗生素和益生菌等［7-8］也對ALD具有一定的治療作用。近年來的研究顯示，外泌體可直接激活A(yù)LD中肝臟巨噬細胞，是巨噬細胞過度活化的重要因素［9-10］。但酒精誘導(dǎo)肝臟外泌體生成的相關(guān)調(diào)節(jié)機制仍不明確。

近年來的研究顯示，自噬和外泌體相關(guān)分泌途徑之間密切相關(guān)［11］。它們共享了許多相同的因素，例如外泌體來源于多泡小體（multivesicular bodies，MVB），自噬體也可以與晚期內(nèi)囊體或MVB融合，產(chǎn)生自噬內(nèi)涵體［12］。在外泌體實驗中也發(fā)現(xiàn)了許多參與不同自噬過程的蛋白質(zhì)，例如HSPA8，HSP90AA 1，VCP和Rab7A等。但在ALD中，自嗜和外泌體生成關(guān)系尚不明確。本實驗以“miR-155/自噬/外泌體”為主要研究對象，從肝細胞對巨噬細胞活化作用的角度，探討酒精性肝病的病理機制，為藥物治療靶點的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物和細胞

8～10周齡雌性C57BL/6N小鼠購自三峽大學(xué)實驗動物中心（合格證號：No.42010200002783）。所有動物實驗均經(jīng)三峽大學(xué)動物保護和使用委員會批準，按照國家衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針進行。小鼠正常肝細胞AML-12購于ATCC（貨號CRL-2254）。

2 主要試劑

Lieber-DeCarli酒精液體飼料購于南通營養(yǎng)動物飼料高科技有限公司（貨號TP4030D、TP4030C）；ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit（貨號EQ806A-1）和去外泌體胎牛血清（貨號EXOFBSHI）購自System Biosciences；兔抗鼠CD63抗體（貨 號DF2305）購 自Affinity Biosciences；佛 波 酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；貨號P1585）和PKH26（貨號MINI26）購于Sigma Aldrich。

3 主要方法

3.1 動物實驗將C57BL/6N小鼠隨機分為飲食對照（control）組和酒精喂養(yǎng)（ethanol）組，單籠喂養(yǎng)，并將飲食對照組和酒精喂養(yǎng)組小鼠進行等熱量配對喂養(yǎng)［13］，每組10只。酒精飲食的小鼠以含有5%（v/v）乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)6周；配對飲食小鼠每日喂飼與酒精飲食小鼠相等熱量的液體飼料。實驗結(jié)束時，收集血漿和組織樣本。

3.2 細胞培養(yǎng)AML-12細胞在37°C、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM；Gibco）中，添加1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%去外泌體胎牛血清中。當細胞融合度達到70%～80%時，加入250 mmol/L乙醇培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)細胞損傷。

THP-1細胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)PMA（5μg/L）刺激12 h，形成PMA分化的THP-1細胞（簡稱dpTHP-1細胞）。將來源于AML-12細胞的外泌體（28μg/L）與pdTHP-1細胞共培養(yǎng)24 h，收集細胞，檢測相關(guān)細胞因子mRNA的表達。

3.3 外泌體的分離與鑒定收集細胞培養(yǎng)基，根據(jù)說明書進行外泌體分離（ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit）。簡單地說，將10 mL培養(yǎng)基與2 mL ExoQuick外泌體沉淀溶液在4℃下混合過夜，然后在1 500×g下離心30 min，取上清液，得到富含外泌體的部分。將外泌體洗滌2次并重新懸浮在PBS中并在-80℃下儲存。通過透射電鏡和納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術(shù)對外泌體的大小、濃度和表面標記物進行了表征。利用NanoSight NS300系統(tǒng)（NanoSight，Amesbury）分析外泌體的濃度和大小分布。每個樣品測量3次。

3.4 組織染色4%中性甲醛固定的肝組織常規(guī)制作成石蠟切片或冰凍切片，進行HE染色或油紅染色后顯微鏡下觀察。石蠟切片在進行抗原修復(fù)后，與5%山羊血清/0.3%吐溫-20/PBS非特異性結(jié)合，并與兔抗鼠CD63抗體（1∶100）在4℃下孵育過夜。洗滌后，用Cy3結(jié)合山羊抗兔IgG在室溫下黑暗中孵育1h。經(jīng)DAPI核染色后，在Olympus BX53顯微鏡下觀察，用IPP6.0軟件進行強度測定。

3.5 顯微鏡檢查用熒光染料PKH26（Sigma）標記肝細胞外泌體，與pdTHP-1細胞在28μg/L的終濃度下孵育12 h，在Olympus BX53顯微鏡下觀察細胞攝取外泌體的情況，并用Cell Sense軟件采集圖像。

3.6 ELISA和生化分析肝組織勻漿（50 g/L）于RIPA緩沖液（含PMSF）中。采用標準化全自動生化分析儀（Rayto）測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性、甘油三酯（triglyceride，TG）和肝臟總膽固醇（total cholesterol，TC）的水平。為了便于分析，所有小于檢測下限的值都被認為是零。

3.7 Western blot分析肝組織或AML-12細胞使用含PMSF的RIPA緩沖液勻漿，提取總蛋白。等量的蛋白質(zhì)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使用抗LAMP-1和LAMP-2抗體（1∶300；Proteintech）進行Western blot（Bio-Rad公司）檢測。蛋白質(zhì)條帶掃描后用ImageJ軟件，以GAPDH為內(nèi)參照進行分析定量。

3.8 RT-qPCR按RNAiso plus試劑盒說明書使用Trizol從小鼠肝組織樣本或AML-12細胞中分離出總RNA，PrimeScript?RTreagent Kit（TaKaRa）進行反向轉(zhuǎn)錄，擴增cDNA。以GAPDH mRNA或U6的表達為標準，用2-ΔΔCt法計算相對mRNA的表達。其中主要使用的引物序列見表1。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，對組間差異進行t檢驗（Dunnett-t），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性酒精攝入導(dǎo)致肝臟損傷

液體酒精飼料喂養(yǎng)C57BL/6N小鼠6周，建立小鼠慢性ALD模型。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，酒精性飼料導(dǎo)致小鼠肝細胞空泡變性、肝組織的脂質(zhì)沉積和炎癥細胞浸潤（圖1A、1B）。與配對喂養(yǎng)小鼠相比，喂養(yǎng)酒精的小鼠血清ALT活性顯著升高（P＜0.05，圖1C），肝臟組織甘油三酯的含量增加（P＜0.01，圖1D）。這些結(jié)果表明，慢性酒精導(dǎo)致了肝臟損傷。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences used for RT-qPCR

Figure 1.The liver injury in ALD mice.A：HE staining（×200）；B：Oil red O staining（×200）；C：serum ALT activity；D：TG content in liver.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖1 ALD小鼠肝臟損傷情況的觀察

2 慢性酒精攝入誘導(dǎo)肝臟過度的炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)被認為在ALD的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用［14］。我們檢測了肝臟組織炎癥因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、NOS-2、F4/80和MCP-1的mRNA表達顯著增加（P＜0.05）。這說明，慢性酒精的攝入可誘導(dǎo)巨噬細胞的過度活化和肝臟炎癥反應(yīng)的增強。見圖2。

Figure 2.Excessive inflammatory responses in the liver of ALD mice.Relative mRNA expression of TNF-α，IL-1β，NOS-2，F(xiàn)4/80 and MCP-1 in the liver was detected by RT-qPCR.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖2 ALD小鼠肝臟中發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)

3 慢性酒精攝入對小鼠肝臟miR-155/自噬/外泌體的影響

細胞外囊泡的傳遞可以介導(dǎo)細胞之間的通訊［15］。我們發(fā)現(xiàn)，與配對飲食組相比，酒精飲食喂養(yǎng)小鼠肝臟CD63（外泌體標志蛋白）的表達顯著增加（圖3A）。在ALD中，酒精誘導(dǎo)肝細胞分泌大量的細胞外囊泡，含有高濃度的CD40L，能直接激活肝臟巨噬細胞［16］。進一步的結(jié)果顯示，酒精的暴露明顯地提高了小鼠肝臟CD40L的表達（圖3B）。

近年來的研究表明，細胞外泌體的生成與自噬密切相關(guān)。我們檢測肝臟自噬相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，與配對飲食組相比，酒精飲食喂養(yǎng)小鼠肝臟溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1和LAMP2的表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示酒精會損害肝臟細胞的自噬程序（圖3C）。此外，慢性酒精的攝入可導(dǎo)致肝臟miR-155的表達顯著升高（P＜0.01圖3D）。這些結(jié)果提示，酒精可誘導(dǎo)肝臟miR-155的表達，抑制肝細胞自噬，促進肝細胞外泌體的生成，外泌體可直接介導(dǎo)肝臟巨噬細胞的活化。

4 乙醇通過升高AML-12細胞中miR-155的表達導(dǎo)致細胞自噬受損

為了進一步明確酒精對肝細胞的作用，我們使用乙醇刺激AML-12細胞24 h，制備酒精損傷肝細胞體外模型。結(jié)果表明，酒精可直接誘導(dǎo)AML-12細胞的miR-155表 達 的 升 高（P＜0.05，圖4A），降 低LAMP1和LAMP2的 表 達（P＜0.05，P＜0.01，圖4B）。

5 乙醇誘導(dǎo)AML-12細胞分泌的外泌體直接介導(dǎo)巨噬細胞的活化

為了明確酒精作用下肝細胞對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，我們將AML-12細胞暴露于乙醇中24 h，分離純化細胞外囊泡，電鏡觀察顯示其膜性結(jié)構(gòu)和大?。▓D5A）。經(jīng)NAT分析表明，細胞囊泡的大小在100～150 nm之間，說明其大部分為外泌體（圖5B）。與對照組相比，酒精顯著升高了AML-12細胞外泌體的分泌數(shù)量（P＜0.05，圖5C）。

我們將AML-12細胞分泌的外泌體和pdTHP-1細胞共培養(yǎng)，研究外泌體對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)6 h后，就可以觀察到pdTHP-1細胞攝取外泌體的現(xiàn)象（圖5D）。乙醇處理組外泌體刺激pdTHP-1細胞12 h后，細胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的mRNA表達顯著增加，IL-10和CD206的mRNA表達沒有明顯變化（圖5E），提示向M1型巨噬細胞活化的趨勢。然而，來自對照組的外泌體對pdTHP-1細胞的細胞因子表達沒有明顯的改變。

Figure 3.The changes of miR-155-mediated autophagy/exosome expression in ALD mouse liver.A：the expression of CD63 in the liver tissue；B：CD40L in the liver tissue；C：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2 in the liver tissue；D：miR-155 in the liver tissue.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖3 miR-155介導(dǎo)的自噬/外泌體軸在ALD小鼠肝臟中的表達

Figure 4.Ethanol induced impairment of autophagy in AML-12 cells.A：relative expression of miR-155；B：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 乙醇導(dǎo)致AML-12細胞自噬功能受損

討 論

酒精可誘導(dǎo)肝細胞分泌大量外泌體。在ALD患者［17］和動物模型外周血［18］中可發(fā)現(xiàn)，外泌體的數(shù)量顯著升高。在體外使用酒精刺激肝細胞發(fā)現(xiàn)，外泌體的生成量成倍增加，而且與巨噬細胞相比，肝細胞是ALD中分泌外泌體的主要細胞［18］。對ALD患者外周血中外泌體的研究表明，外泌體中有多種miRNA，其蛋白質(zhì)［19］及磷脂［20］等的表達均發(fā)生了顯著改變。Saha等［21］的實驗表明，使用酒精刺激肝細胞產(chǎn)生的細胞外囊泡（主要為外泌體）可通過HSP90介導(dǎo)巨噬細胞的活化。Verma等［16］的實驗顯示，酒精可誘導(dǎo)肝細胞分泌大量的外泌體，攜帶36種與炎癥相關(guān)的蛋白，其中CD40L可直接介導(dǎo)巨噬細胞的活化，加重肝臟的炎癥反應(yīng)。使用CD40L中和抗體可以顯著的降低外泌體對巨噬細胞的活化作用。以上研究都說明，來源于肝細胞的外泌體是激活肝內(nèi)巨噬細胞的重要因素。本實驗也顯示，酒精的攝入可導(dǎo)致小鼠肝細胞外泌體表達的增高，體外實驗表明酒精誘導(dǎo)肝細胞分泌的外泌體可直接介導(dǎo)巨噬細胞的激活。但是酒精誘導(dǎo)肝細胞外泌體合成的機制尚不十分清楚。

Figure 5.Immunomodulatory effect of exosomes secreted by ethanol-stimulated hepatocytes on macrophages.A：the morphological change of extracellular vesicle was observed under electron microscope（×10 000）；B：the size and distribution of extracellular vesicles were detected by nanoparticle tracking analysis；C：the numbers of exosomes（PF：paired feed group；AF：alcohol feed group）；D：the intake of exosomes by THP-1 cells（×200）；E：the mRNA expression of TNF-α，IL-1β，IL-10 and CD206.Control-Ex：control exosome；ethanol-Ex：ethanol-treated exosomes.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs PF group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs control-Ex group.圖5 乙醇刺激肝細胞分泌的外泌體對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用

在酒精性肝損傷中，急性酒精可直接激活肝臟自噬，而慢性酒精的暴露會導(dǎo)致肝臟自噬功能不足，表現(xiàn)為自噬通量受損［22］。慢性酒精攝入時自噬通量的損害與溶酶體功能和生物發(fā)生有關(guān)。酒精性飼料喂養(yǎng)降低了小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄因子EB［23］，后者是溶酶體生物發(fā)生和自噬的主要調(diào)節(jié)因子。Babuta［24］等的研究也表明，慢性酒精的攝入啟動了肝細胞自噬，但溶酶體功能下調(diào)，整體自噬通量是損傷的。同時體外實驗也發(fā)現(xiàn)，在肝細胞和巨噬細胞中沉默LAMP1和LAMP2基因，可有效提高外泌體的釋放。本實驗也發(fā)現(xiàn)，慢性酒精的攝入可誘導(dǎo)肝細胞外泌體的分泌成倍增加，同時肝細胞LAMP1和LAMP2表達顯著降低，說明溶酶體功能損傷，自噬功能被抑制，提示酒精可能通過調(diào)節(jié)肝細胞自噬中的溶酶體功能，誘導(dǎo)外泌體的生物合成。但是在ALD中，自噬和外泌體的相互關(guān)聯(lián)仍需要進一步探索。

miR-155似乎是參與ALD發(fā)生和發(fā)展的重要途徑的關(guān)鍵miRNA［25］，在肝臟炎癥和纖維化中均具有重要的調(diào)節(jié)作用。ALD患者［26］和實驗研究［27］都證明，酒精暴露后不同細胞群的肝臟或外周血miR-155表達顯著增加。miR-155在巨噬細胞中的高表達可延長TNF-ɑmRNA的半衰期，介導(dǎo)ALD中肝脂肪變性、炎癥和肝細胞死亡［27］。與野生型小鼠相比［28］，酒精喂養(yǎng)后miR-155 KO小鼠肝臟甘油三酯、ALT水平和脂質(zhì)過氧化水平顯著降低，減輕慢性酒精誘導(dǎo)的肝損傷，這意味著靶向調(diào)節(jié)miR-155可能具有治療ALD的潛力。已有報道表明miR-155可直接或間接作用于自噬途徑的多種基因，包括mTOR，p62，LAMP1和LAMP2等［29-30］，從而調(diào)控細胞的自噬過程。本實驗結(jié)果表明，酒精誘導(dǎo)肝細胞miR-155表達的升高，這可能與肝細胞自噬功能受損與關(guān)。

我們的研究表明，酒精刺激肝細胞生成大量miR-155，通過抑制LAMP1和LAMP2的表達導(dǎo)致肝細胞自噬功能障礙，誘導(dǎo)肝細胞生成大量外泌體，外泌體通過其攜帶的生物分子可直接介導(dǎo)巨噬細胞的活化，引發(fā)級聯(lián)炎癥反應(yīng)，造成肝臟損傷。酒精通過刺激肝臟miR-155介導(dǎo)自噬和外泌體分泌，誘導(dǎo)外泌體及其攜帶的致炎因子釋放的顯著增加，也是ALD中肝臟巨噬細胞持續(xù)過度激活的重要因素。