異基因骨髓移植小鼠腸道菌群和NLRP3炎癥小體改變與急性移植物抗宿主病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系*

趙燕娜，汪麗佩，李天一，何志興，張 婷，溫成平

（1浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江杭州310053）

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）近年來已成為治療白血病和再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病的重要方法［1］，但是急性移植物抗宿主?。╝cute graftversus-host disease，aGVHD）作為主要并發(fā)癥，卻限制了Allo-HSCT的應(yīng)用［2］。aGVHD的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，認(rèn)為它是一個(gè)多層面多步驟的病理過程。文獻(xiàn)報(bào)道［3］，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3，NLRP3）可活化白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等細(xì)胞因子，是破壞腸道菌群及促發(fā)aGVHD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究觀察到aGVHD可引起小鼠外周血抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平降低，致炎細(xì)胞因子IL-1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）顯著增高，下調(diào)腸緊密連接蛋白之一的閉合蛋白（occludin）表達(dá)，影響腸道屏障功能，引起腸道菌群結(jié)構(gòu)及靶器官病理學(xué)形態(tài)改變，并激活NLRP3炎癥小體表達(dá)，從而形成惡性循環(huán)，為腸道菌群和NLRP3炎癥小體參與aGVHD的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)，并可能為該疾病治療提供靶點(diǎn)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

6～8周齡SPF級近交系C57BL/6雄性小鼠為供鼠，6～8周齡SPF級近交系BALB/c雌性小鼠為受鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2012-0002和SCXK（滬）2013-0016。小鼠均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼料、墊料和飲用水均經(jīng)高壓滅菌處理。PECD4和FITC-CD8抗體購自BD Pharmingen；小鼠IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α的ELISA試劑盒購于R&D Systems；兔抗緊密連接蛋白閉鎖蛋白（occludin）抗體購于Zymed Laboratories；SP免疫組化染色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)公司；兔抗小鼠NLRP3、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和caspase-1抗體購于Abcam。

2 方法

2.1 受鼠準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)受鼠均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，于移植前1周飲用含慶大霉素（320 mg/L）的消毒飲用水，預(yù)處理行全身照射（total body irradiation，TBI），總劑量13.0 Gy，分兩次照射，每隔3 h一次，照射量頻為2.0 Gy/min，照射距離為100 cm。

2.2 aGVHD模型的建立及分組移植當(dāng)天麻醉后頸脫法處死供鼠，無菌條件下分離股骨、脛骨與脾臟，剪去骨骺端并用注射器反復(fù)沖洗骨髓腔并過濾收集，脾臟于200目篩網(wǎng)上研磨并收集脾細(xì)胞，將上述細(xì)胞收集后，裂解紅細(xì)胞并用PBS洗滌，計(jì)數(shù)后調(diào)整骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞比例為1∶4并混合。受鼠預(yù)處理后4～8 h經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)混合細(xì)胞。白細(xì)胞數(shù)下降后復(fù)升且連續(xù)3 d超過1×109/L為移植成功，移植后7 d左右出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食差、體重下降、聳毛、呈弓背體位等屬于aGVHD造模成功，即aGVHD組。同時(shí)以未接受移植的SPF級近交系BALB/c雌性小鼠為正常對照（normal）組。

2.3 瑞氏-吉姆薩染色法檢測供鼠骨髓細(xì)胞收集供鼠骨髓細(xì)胞懸液，經(jīng)離心涂片機(jī)71×g離心甩片5 min，制成細(xì)胞涂片。常規(guī)瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下放大1 000倍觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測供鼠脾細(xì)胞收集供鼠脾細(xì)胞，PBS洗滌，分別加入PE標(biāo)記的CD4和FITC標(biāo)記的CD8單克隆抗體，室溫孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)記的陽性細(xì)胞率，每個(gè)標(biāo)本檢測記錄10 000個(gè)細(xì)胞，DIVA軟件作陽性率的分析。

2.5 血清細(xì)胞因子的檢測在模型組移植后第14天，雙抗體夾心ELISA法分別測定正常對照組和aGVHD組小鼠外周血IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α水平，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 免疫組化檢測回腸組織緊密連接蛋白的表達(dá)取回腸組織，進(jìn)行固定、包埋及切片后，采用常規(guī)SP法測定，抗occludin抗體反應(yīng)總濃度為1：200，陰性對照用PBS代替，每張切片均于鏡下觀察，細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色顆粒判定為陽性表達(dá)。

2.7 腸道菌群檢測移植后14 d，收集各組小鼠回盲部糞便，立即置于無菌采樣盒內(nèi)，-80℃低溫冷凍保存。取200 mg樣品采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（QIAGEN）快速提取和純化DNA，委托杭州谷禾信息技術(shù)有限公司應(yīng)用16SrDNA基因測序，使用QIIME軟件進(jìn)行測序數(shù)據(jù)處理并對獲得的高質(zhì)量序列進(jìn)行分析比對。

2.8 組織病理學(xué)檢測移植后14 d，處死小鼠，取出肺、肝、脾和回腸組織標(biāo)本，采用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，行HE染色觀察形態(tài)病理學(xué)變化。

2.9 腸組織NLRP3炎癥小體表達(dá)的檢測處死小鼠后提取小腸（幽門部至回盲部）蛋白，行Western blot分析NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 供鼠骨髓細(xì)胞及脾細(xì)胞鑒定

沖洗供鼠股骨和脛骨骨髓腔后甩片并進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，如圖1所示，供鼠骨髓增生活躍，有核細(xì)胞量中等，骨髓小粒內(nèi)細(xì)胞豐富。供鼠脾臟于200目篩網(wǎng)上研磨收集，并進(jìn)行CD4及CD8染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果如圖2所示，脾細(xì)胞中11.6%為CD4+T淋巴細(xì)胞，30.1%為CD8+T淋巴細(xì)胞。以上結(jié)果提示收集到的供鼠細(xì)胞為正常骨髓細(xì)胞及含有豐富T淋巴細(xì)胞的正常脾細(xì)胞。

Figure 1.Wright-Giemsa staining（×1 000）of bone marrow（A）and bone marrow particles（B）.圖1 骨髓片和骨髓小粒的瑞氏-吉姆薩染色

Figure 2.Detection of CD4+and CD8+T cells from spleen by flow cytometry.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中CD4+及CD8+T細(xì)胞

2 aGVHD對細(xì)胞因子的影響

與正常對照小鼠比較，aGVHD組小鼠外周血清細(xì)胞因子發(fā)生明顯改變，其中IL-4和IL-10的水平降低，而IL-1β和TNF-α顯著增高（P＜0.01），說明aGVHD可下調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平，并上調(diào)炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α水平，見表1。

3 aGVHD下調(diào)回腸occludin的表達(dá)

光鏡下比較兩組小鼠回腸組織中緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)情況如圖3所示。在正常小鼠回腸黏膜組織上，occludin連續(xù)分布于小腸上皮細(xì)胞的邊緣，主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈強(qiáng)陽性表達(dá)；aGVHD小鼠回腸黏膜組織壞死脫落，殘存上皮細(xì)胞中occludin染色均變淡、稀疏，提示在aGVHD小鼠回腸組織中，occludin表達(dá)降低，腸黏膜屏障功能受損。

4 aGVHD對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

與正常對照組小鼠比較，aGVHD組腸道菌群物種組成發(fā)生明顯改變，其中疣微菌門（Verrucomicrobia）及其下屬的Verrucomicrobiae（綱）-Verrucomicrobiales（目）中的Verrucomicrobiaceae（科）、阿克曼菌（Ak-kermansia）和RF32顯著上調(diào)；Adlercreutzia（綱）、紅蝽?xiàng)U菌目（Coriobacteriales）中的Coriobacteriaceae（科）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）中的Prevotella（屬）、理研菌科（Rikenellaceae）中的Rikenella（屬）、Paraprevotellaceae（科）-Paraprevotella（屬）、普雷沃菌屬（Prevotella）、Christensenellaceae（科）、分節(jié)絲狀菌（Candidatus arthromitus）、梭菌科（Clostridiaceae）、Dorea（屬）、胃球菌屬（Ruminococcus）、Mogibacteriaceae（科）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、水甲基桿菌屬（Methylobacterium）、薩特菌屬（Sutterella）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、Flexispira（屬）、彎曲菌目（Campylobacterales）、氣單胞菌目（Aeromonadales）中的Aeromonadaceae（科）和鄰單胞菌屬（Plesiomonas）明顯減少。見圖4。

表1 aGVHD引起血清細(xì)胞因子表達(dá)改變Table 1.The expression changes of cytokines in aGVHD（ng/L.Mean±SEM.n=5）

Figure 3.Occludin expression in ileal mucosa detected by immunohistochemistry（×400）.A：normal group；B：aGVHDgroup.圖3 免疫組化檢測回腸組織occludin的表達(dá)

5 aGVHD對靶器官組織的病理學(xué)改變

與正常對照組比較，aGVHD組小鼠肺泡腔內(nèi)可見水腫液、紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁血管擴(kuò)張充血，部分肺泡壁破壞；肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞體積增大、胞漿染色變淡，表現(xiàn)為水腫、肝索增粗紊亂、肝竇變窄等現(xiàn)象；脾臟皮質(zhì)區(qū)域可見出血、壞死等改變；回腸黏膜上皮壞死脫落，見圖5。

6 aGVHD對NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響

提取小鼠小腸總蛋白，行Western blot分析，進(jìn)行NLRP3炎癥小體活性檢測，結(jié)果顯示與正常對照組相比，aGVHD小鼠腸組織中NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)情況均顯著增加，見圖6。

討 論

aGVHD是異基因造血干細(xì)胞移植最常見并發(fā)癥，經(jīng)典理論為“細(xì)胞因子風(fēng)暴學(xué)說”［4］，該學(xué)說把a(bǔ)GVHD的發(fā)生可以分為3個(gè)階段：（1）預(yù)處理方案的毒性、感染和原發(fā)病造成組織損傷，引起細(xì)胞因子大量釋放，如TNF-α、IL-1和IL-6，刺激組織相容性抗原和白細(xì)胞黏附分子在靶細(xì)胞（皮膚、腸黏膜和肝臟）上表達(dá)增加；（2）供者T細(xì)胞識別靶組織的組織相容性抗原，同時(shí)在活化信號IL-1的刺激下被激活，活化的供者T細(xì)胞增殖分化成為Thl亞群細(xì)胞，分泌Thl類細(xì)胞因子（如IL-2和IFN-γ）；（3）IL-2激活供者骨髓中新植活的單核細(xì)胞分泌更多的炎性細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-α和NO，由此引起的炎癥反應(yīng)又導(dǎo)致更多的細(xì)胞因子釋放從而加重局部器官的損傷。但其起始階段的機(jī)制尚不明確，越來越多證據(jù)顯示腸道菌群可能通過機(jī)體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)影響該病發(fā)生發(fā)展［5］，NLRP3是一個(gè)新切入點(diǎn)，其本質(zhì)由支架蛋白NLRs、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis speck-like protein，ASC）和caspase-1組成，是存在于樹突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等胞漿中的一類模式識別受體，可通過識別腸道微生物，導(dǎo)致炎癥小體激活，并發(fā)生自身寡聚化活化炎性caspase-1，進(jìn)而將前炎癥細(xì)胞因子加工為有活性的細(xì)胞因子（如IL-1β），再釋放至細(xì)胞外參與多種炎癥性和免疫性疾病的發(fā)生，最終導(dǎo)致aGVHD［6-7］；在小鼠腸道aGVHD模型中，小鼠外周血白細(xì)胞及腸道相關(guān)病變部位均檢測到IL-1β和caspase-1表達(dá)明顯增高，而NLRP3-/-或ASC-/-小鼠巨噬細(xì)胞對于細(xì)菌脂多糖刺激不能分泌IL-1β等細(xì)胞因子，如早期阻斷樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)或敲除IL-1受體，可明顯提高腸道aGVHD的生存率［8-9］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，在aGVHD等疾病誘發(fā)急性炎癥后，腸壁水腫和屏障功能受損導(dǎo)致腸道菌群成分轉(zhuǎn)移到宿主血液循環(huán)系統(tǒng)，甚至導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，從而進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)［10］。

Figure 4.Effect of aGVHD on the structure of interstional flora.A：LEfSe analysis of intestinal flora structure in normal group and aGVHD group；B：LDA scoring chart of intestinal flora structure in normal group and aGVHD group圖4 aGVHD對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

Figure 5.Pathological changes of lung，liver，spleen and ileum in aGVHDmice（HEstaining，×400）.圖5 GVHD小鼠肺、肝、脾和回腸黏膜的病理改變

Figure 6.Expression of NLRP3 inflammasome in the intestine of aGVHDmice.圖6 aGVHD小鼠小腸NLRP3炎癥小體表達(dá)

在以上理論基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)建立小鼠aGVHD模型，發(fā)現(xiàn)aGVHD小鼠的NLRP3炎癥小體活化、腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)降低以及腸道菌群結(jié)構(gòu)改變。由此推測aGVHD誘發(fā)小鼠血清中炎癥因子濃度升高，是導(dǎo)致腸壁通透性增加的有效誘導(dǎo)因子，隨之可能引發(fā)內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)從而促發(fā)NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子釋放，從而形成了惡性前饋循環(huán)。此外本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)aGVHD可通過下調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10表達(dá)，提示可能存在其它信號通路抑制抗炎因子。以上結(jié)果為深入了解aGVHD的發(fā)生機(jī)理開辟新視角，并為臨床防治該類疾病提供新機(jī)制。