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    ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的EP300過(guò)表達(dá)在苯腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用*

    2021-06-02 11:55:24黃麗欣彭波輝馮玉松羅孝美吳書琪張煥婷
    中國(guó)病理生理雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:乙?;?/a>孵育心肌細(xì)胞

    黃麗欣,彭波輝,彭 昌△,馮玉松,羅孝美,吳書琪,張煥婷

    (遵義醫(yī)科大學(xué)1附屬醫(yī)院兒內(nèi)一科,2第一臨床學(xué)院,3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,貴州遵義563000)

    病理性心肌肥厚是引起心臟衰竭和心源性猝死的重要原因。近年來(lái)病理性心肌肥厚發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì),且防治措施尚不完善[1],因此尋找新的治療手段成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究證實(shí)組蛋白乙?;揎検Ш鈪⑴c了苯腎上腺素(phenylephrine,PE)所致的病理性心肌肥厚,且進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙酰化酶抑制劑漆樹酸(anacardic acid,AA)能夠逆轉(zhuǎn)PE所致的心肌肥厚[2],但該過(guò)程的上游信號(hào)通路并不清楚。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是MAPKs家族中的一個(gè)主要成員[3]。研究顯示,ERK通路在細(xì)胞分化、增殖、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中起著重要調(diào)節(jié)作用,且該通路可通過(guò)上調(diào)組蛋白H3乙?;?,參與酒精暴露所致的心臟發(fā)育相關(guān)基因過(guò)表達(dá),提示該通路可能與組蛋白乙?;揎検Ш饨閷?dǎo)的心肌肥厚相關(guān)[4]。因此,本研究應(yīng)用PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大模型,探討ERK信號(hào)通路在組蛋白乙?;敢种苿〢A改善PE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用,為心肌肥厚的防治提供參考資料。

    材料和方法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選取SPF級(jí)新生3 d的健康昆明小鼠120只,體重2.3~2.7 g,雌雄不限,由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0015。

    2 主要試劑與儀器

    ERK抑制劑U0126、膠原酶Ⅱ和PE(Sigma);胎牛血清(Gibco);抗ERK及p-ERK單克隆抗體(Cell Signaling Technology);抗第9位賴氨酸乙?;慕M蛋白H3(acetylated histone H3 at lysine 9,H3K9ac)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)和E1A結(jié) 合 蛋 白p300(E1A-binding protein p300,EP300)單克隆抗體及兔IgG多克隆抗體(Abcam);抗Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG熒光Ⅱ抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司);抗α-actin及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(Proteintech);Trizol總RNA提取試劑(BioTeke);SDS-PAGE凝膠試劑盒(Beyotime);免疫共沉試劑盒(Beaver)。

    3 主要實(shí)驗(yàn)方法

    3.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)選取出生3 d的昆明小鼠,在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子及眼科剪取出心臟,輕柔擠出心臟中的血,預(yù)冷PBS液洗凈殘血,將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊,加入少許0.05%膠原酶Ⅱ反復(fù)吹打消化2 min,放置沉淀后,棄上清液,如此反復(fù),直至消化完全。將收集的上清液離心(240×g、10 min),棄上清,沉淀與4 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后接種到25 mL培養(yǎng)瓶中,在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中差速培養(yǎng)90min后,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,加入終濃度為0.1 mmol/L的BrdU后繼續(xù)培養(yǎng)。

    3.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞干預(yù)各組藥物濃度參照文獻(xiàn)[5-7]選取,采用PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型后,按隨機(jī)數(shù)字表法將心肌細(xì)胞分為正常(normal)組(不給予任何處理)、生理鹽水(normal saline,NS)組(給予等量NS處理細(xì)胞)和PE組(用100 μmol/L PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h),探討PE干預(yù)的小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系。再將心肌細(xì)胞分為NS組、溶劑對(duì)照(DMSO+PE)組(用100μmol/L PE加等體積的DMSO處理心肌細(xì)胞)、PE組、AA+PE組(用50μmol/L AA處理后加入100μmol/L PE處理心肌細(xì)胞)、U0126+PE組(用10μmol/L U0126干預(yù)后加入100μmol/L PE處理心肌細(xì)胞)和AA+U0126+PE組(用50μmol/L AA孵育心肌細(xì)胞30 min后,再加入10μmol/L U0126處理,最終用100μmol/L PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h),進(jìn)一步探討ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的EP300過(guò)表達(dá)在PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用。

    3.3 Western blot檢測(cè)提取心肌細(xì)胞蛋白,用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,將PVDF膜浸泡于封閉液中,分別加入兔來(lái)源單克隆抗體H3K9ac、EP300、β-MHC、ERK和p-ERK,4℃搖床孵育過(guò)夜,TBST洗滌,每次5 min,洗滌6次,然后加入Ⅱ抗孵育,搖床上孵育1 h,TBST洗滌,每次5 min,洗滌6次,使用化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影。采用Bio-Rad圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描;應(yīng)用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行分析。

    3.4 RT-qPCR檢測(cè)引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)由寶生物公司合成。將β-MHC產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋,運(yùn)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴(kuò)增,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到R2值和擴(kuò)增效率。β-MHC的上游引物序列為5′-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3′,下游引物序列為5′-GCAGAGGCACCAAAATGAAT-3′,產(chǎn)物大小為113 bp;β-actin的上游引物序列為5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′,下游引物序列5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′,產(chǎn) 物 大 小 為289 bp。反應(yīng)條件為:94℃30 s;94℃5 s,60℃30 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照,所得數(shù)據(jù)用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析軟件處理。

    3.5 免疫共沉淀移去培養(yǎng)液,PBS清洗,用結(jié)合緩沖液(含蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞,充分混勻后置于冰上孵育10 min,低溫(4℃)20 000×g離心10 min,收集上清。將磁珠預(yù)處理后,分別加入EP300抗體和H3K9ac抗體,室溫翻轉(zhuǎn)20 min,棄上清,加入緩沖液洗滌2次后,加入抗原4℃翻轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。將抗原吸附后的磁體/抗體/抗原復(fù)合物經(jīng)磁性分離,再洗滌,棄掉上清,加入5×SDS-PAGELoading Buffer混合均勻,95℃加熱5 min,室溫下18 000×g離心10 min,收集上清液進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

    3.6 免疫熒光檢測(cè)制作細(xì)胞爬片,吸出細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌,4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌,每次5 min,洗滌3次,0.3%Triton X-100室溫孵育15 min,PBS洗滌,每次5 min,洗滌3次,室溫下山羊血清封閉30 min,加入抗α-actin(1∶50)4℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,每次5 min,Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGⅡ抗(1∶1 000),室溫避光孵育1.5 h,PBS洗滌3次,每次5 min,再加入抗EP300Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,每次5 min,孵育Ⅱ抗,室溫避光孵育1.5 h,PBS洗滌3次,每次5 min,DAPI染核5 min,PBS洗滌3次,每次5 min,抗熒光淬滅劑封片,于熒光倒置顯微鏡下觀察,應(yīng)用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件分析。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析,組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 PE干預(yù)的小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系

    Western blot結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中,PE組EP300和H3K9ac表達(dá)水平顯著高于NS組(P<0.05),見圖1A、B。免疫共沉淀結(jié)果顯示,EP300可特異性與H3K9ac相互結(jié)合,見圖1C。

    2 各組小鼠心肌細(xì)胞中ERK和p-ERK的表達(dá)水平

    Western blot結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中,ERK表達(dá)水平在各組心肌細(xì)胞中無(wú)顯著差異(P>0.05),而p-ERK的表達(dá)水平在PE組顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05);而ERK抑制劑和AA干預(yù)組的p-ERK水平均顯著低于PE組(P<0.05),見圖2。

    3 各組小鼠心肌細(xì)胞中H3K9ac水平

    Western blot結(jié)果顯示,在小鼠心肌細(xì)胞中,PE組H3K9ac水平顯著高于NS組(P<0.05);而ERK抑制劑和AA干預(yù)組H3K9ac的水平均顯著低于PE組(P<0.05),見圖3。

    4 各組小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白乙?;窫P300的表達(dá)水平

    免疫熒光及Western blot結(jié)果表明,在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中,PE組EP300表達(dá)水平顯著高于NS組(P<0.05);AA及ERK抑制劑干預(yù)組EP300的表達(dá)水平顯著低于PE組(P<0.05),見圖4。

    5 ERK信號(hào)通路在AA逆轉(zhuǎn)PE誘導(dǎo)心肌肥大標(biāo)志物β-MHC過(guò)表達(dá)中的作用

    RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示,PE組心肌肥大標(biāo)志物β-MHC的mRNA水平及蛋白水平均顯著高于NS組(P<0.05),ERK抑制劑及AA干預(yù)組β-MHC的mRNA及蛋白水平均顯著低于PE組(P<0.05),見圖5。

    討 論

    心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)各種刺激因素所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),分為生理性肥厚和病理性肥厚,病理性心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大和心肌間質(zhì)增生,是導(dǎo)致慢性心力衰竭和心源性猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。本課題組前期研究證實(shí)組蛋白乙酰化修飾失衡參與了PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚[9],而AA能夠抑制組蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)介導(dǎo)的組蛋白H3K9高乙酰化進(jìn)而改善心肌肥厚[10],且進(jìn)一步證實(shí)P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogenactivated protein kinase,P38 MAPK)信號(hào)通路參與了AA改善PE誘導(dǎo)的心肌肥厚[11],但MAPK信號(hào)通路家族還包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和ERK信號(hào)通路,而ERK和JNK信號(hào)通路是否參與AA改善PE誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚并不清楚。因此,本研究應(yīng)用PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大,來(lái)探討ERK信號(hào)通路在EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙?;Ш庵滦募〖?xì)胞肥大中的作用。

    Figure 1.The expression of EP300 and H3K9ac in the mouse myocardial cells and their mutual regulation.A:the protein levels of EP300;B:the protein levels of H3K9ac;C:co-immunoprecipitation(Co-IP)in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to three different experimental conditionswith anti-EP300-protein Gmagnetic beads and immunoblot(IB)with an anti-H3K9ac or anti-EP300 antibody for evaluation of protein expression.Input:positive control;IgG:negative control.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs NSgroup.圖1 小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K 9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系

    Figure 2.The protein levels of ERK and p-ERK in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs NSgroup;#P<0.05 vs PEgroup.圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞中ERK及p-ERK的蛋白水平

    Figure 3.The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs NSgroup;#P<0.05 vs PEgroup.圖3 小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白H3K9ac水平的比較

    Figure 4.The expression of EP300 in the mouse myocardial cells with different treatments.A:the immunofluorescence images of myocardial cells(scale bar=20μm);B:the EP300 average optical density;C:the protein levels of EP300 were assayed by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs NSgroup;#P<0.05 vs PEgroup.圖4 小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白乙?;窫P300的表達(dá)水平

    組蛋白乙?;c基因的活化有著密切關(guān)系,而去乙酰化與基因沉默有關(guān),組蛋白乙酰化/去乙?;Ш庠谛募》屎裰邪l(fā)揮著重要作用。組蛋白乙?;ㄟ^(guò)HATs介導(dǎo),HATs在心臟表達(dá)的亞型主要包括:EP300、p300/CBP輔助因子(p300/CBP-associated factor,PCAF)、組蛋白乙?;赴焙铣赏ㄓ每刂频鞍?(general control nonderepressible-5,GCN5)、CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein,CBP)和類固醇受體輔活化子1(steroid receptor coactivator-1,SRC1)[12-13]。EP300能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,松解染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而影響基因表達(dá)。EP300/CBP作為一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,能與多種轉(zhuǎn)錄因子互相作用,是介導(dǎo)心肌肥厚的關(guān)鍵因子[14]。EP300和CBP共同調(diào)控心臟肥厚相關(guān)基因過(guò)表達(dá),可能在PE誘導(dǎo)的心肌肥大中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,在PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大細(xì)胞中,EP300及組蛋白H3K9ac水平顯著高于生理鹽水對(duì)照組,為了進(jìn)一步證實(shí)兩者的關(guān)系,我們進(jìn)一步應(yīng)用免疫共沉淀驗(yàn)證,結(jié)果表明組蛋白H3K9ac受EP300直接調(diào)控。以上結(jié)果提示EP300過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的組蛋白H3K9乙?;揎検Ш饪赡軈⑴c了心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程。但是組蛋白乙?;窫P300介導(dǎo)的其他組蛋白(如:H3K27ac)修飾是否參與了病理性心肌肥厚過(guò)程,需進(jìn)一步證實(shí)。

    研究顯示在病理性心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞中,ERK磷酸化水平較高,降低其水平可改善心肌肥厚[15]。研究證實(shí)ERK在心肌細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)包括EP300和CBP等[16-17],表明ERK能夠調(diào)控EP300的表達(dá)。當(dāng)ERK受到體內(nèi)、體外刺激時(shí),經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)發(fā)生磷酸化而激活,進(jìn)一步誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因表達(dá)。本研究結(jié)果證實(shí)PE組p-ERK水平顯著升高,與EP300變化水平相一致,但ERK水平并沒有明顯變化,表明ERK并沒有參與PE誘導(dǎo)心肌肥厚的過(guò)程,而ERK可能在上述病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,同時(shí)也提示在PE誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠心肌組織中ERK信號(hào)通路處于激活狀態(tài),參與心肌肥厚的信號(hào)通路較多,其他信號(hào)通路是否在PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚組織中也處于激活狀態(tài)(如JNK)尚待進(jìn)一步研究。研究證實(shí)PE所致的心肌細(xì)胞肥大中MEF-2和β-MHC會(huì)顯著升高[18],β-MHC是常用的心肌肥厚標(biāo)志物,在心臟收縮功能中起著重要的作用,因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了β-MHC的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平。結(jié)果顯示,PE組小鼠心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物β-MHC mRNA水平及蛋白水平均顯著升高,表明β-MHC是判斷PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要標(biāo)志物之一。為進(jìn)一步證實(shí)ERK信號(hào)通路對(duì)EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙酰化失衡在PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ERK抑制劑U0126及組蛋白乙酰化酶抑制劑AA干預(yù)PE處理的小鼠心肌細(xì)胞,結(jié)果表明分別經(jīng)過(guò)上述兩種抑制劑干預(yù)后的小鼠心肌細(xì)胞中p-ERK、H3K9ac、β-MHC及EP300表達(dá)水平與單純PE處理組相比均顯著降低,進(jìn)一步提示我們ERK信號(hào)通路參與的EP300介導(dǎo)的組蛋白乙酰化失衡參與了PE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大。

    綜上所述,ERK信號(hào)通路在EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙?;Ш庵翽E誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中扮演著重要的角色,提示ERK信號(hào)通路可能成為心肌肥厚防治的新靶點(diǎn)。

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