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    干擾海馬spastin表達(dá)通過抑制突觸傳遞介導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能障礙*

    2021-06-02 11:55:16李志坤王晗婕鄭雪峰郭國慶張吉鳳
    中國病理生理雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:樹突象限海馬

    李志坤,祝 瑋,王晗婕,鄭雪峰,郭國慶,張吉鳳

    (暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院解剖學(xué)系,認(rèn)知與發(fā)育障礙神經(jīng)科學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510632)

    SPAST是遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia,HSP)的致病基因,約有40%的HSP系由SPAST基因突變所致[1-2]。單純型HSP患者神經(jīng)系統(tǒng)的主要病理改變?yōu)槠べ|(zhì)脊髓束的退行性變,表現(xiàn)為雙下肢的痙攣性癱瘓[3];而復(fù)雜型HSP常伴有認(rèn)知功能異常,包括學(xué)習(xí)記憶減退和注意力缺陷等不同程度的認(rèn)知障礙[4-5]。認(rèn)知功能障礙發(fā)生的原因是什么,是否與SPAST編碼的spastin蛋白的功能缺失有關(guān)?spastin是AAA型ATP酶活性的蛋白,主要功能是把微管切割成短的片段,以釋放微管的動(dòng)力[6],除了AAA型ATP酶結(jié)構(gòu)域,spastin的N端還具有一個(gè)疏水的HR結(jié)構(gòu)域,以及MIT和MTBD結(jié)構(gòu)域,MTBD負(fù)責(zé)把spastin錨定于微管,而MIT結(jié)構(gòu)域則參與細(xì)胞內(nèi)膜管的形成和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。我們前期研究顯示,spastin的MIT結(jié)構(gòu)域能夠與AMPA受體結(jié)合,參與谷氨酸能受體的轉(zhuǎn)運(yùn)[8],從而改變培養(yǎng)神經(jīng)元的樹突棘可塑性,提示spastin介導(dǎo)的AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)功能可能與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。為了驗(yàn)證我們的推測,本研究特意干擾小鼠海馬部位spastin蛋白的表達(dá),用膜片鉗技術(shù)檢測突觸傳遞的功能,并評(píng)估小鼠的行為學(xué)表現(xiàn),借以明確spastin是否參與小鼠認(rèn)知功能的調(diào)控。

    材料和方法

    1 動(dòng)物

    SPF級(jí)C57BL/6小鼠,雄性,4周齡,15~17 g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào):SYXK(遼)2020-0001。分籠飼養(yǎng),自由飲水食,控制環(huán)境溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,晝夜交替時(shí)間為8:00與20:00。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,并通過暨南大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

    2 主要儀器與試劑

    小鼠腦立體定位注射儀(瑞沃德);微量注射泵(KDscientific);冰凍切片機(jī)CM1860和振動(dòng)切片機(jī)1200s(Leica);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行為分析系統(tǒng)(Clever Sys Inc);雙極同心圓刺激電極(FHC);拉制儀P97及Integrated Patch Amplifier(Shutter);正 置 顯 微 鏡Eclipse FN1(Nikon);數(shù)字切片掃描儀(Pannoramic)。spastinⅠ抗、GADPHⅠ抗及河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)購 自Sigma;辣 根 過 氧 化 物 酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(ABclonal);苦毒寧(picrotoxin,PTX)購自Tocris;高爾基染液試劑盒(ZCIBIO);重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)載 體rAAV-U6-shSpastin-CMVEGFP-pA和rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA(樞密科技有限公司)。

    3 主要方法

    3.1 實(shí)驗(yàn)分組4周齡雄性C57BL/6小鼠60只,體重15~17 g,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)(sh-Spastin)組和對(duì)照(control)組,每組30只。

    3.2 海馬定向注射參照Keiser等[9]實(shí)驗(yàn)室病毒注射方法。首先用異氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠,固定于腦立體定位儀,參照小鼠大腦立體定位圖譜確定海馬CA1的位置,前囟(bregma)為原點(diǎn)(0,0,0),在bregma后2.4 mm(AP:-2.4 mm),左、各1.6 mm(ML:±1.6 mm),用1 mm直徑的顱骨鉆小心開骨窗,然后用消毒過的針頭輕輕挑開硬腦膜,使用微量注射泵作微量注射,深度為-1.65 mm(DV:-1.65 mm),注射前將微量注射器下降至-1.70 mm并停留1 min,再上抬至-1.65 mm,實(shí)驗(yàn)組注射rAAV-U6-shSpastin-CMV-EGFP-pA,對(duì)照組注射rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA,注射量為0.3μL,速度為0.03μL/min,注射完畢后繼續(xù)留針10 min,待病毒充分?jǐn)U散后緩慢拔出,用骨蠟封閉骨窗,消毒縫合置小鼠于37℃電熱毯上至蘇醒。

    3.3 Western blot參照本實(shí)驗(yàn)室Western blot方法[10]。注射病毒載體21 d后,每組隨機(jī)選取3只小鼠,異氟烷麻醉,將小鼠腦組織浸入配制好的氧飽和冷凍人工腦脊液中修塊,去除小腦組織后以橫斷面為底用瞬間粘合膠固定于振動(dòng)切片機(jī)底座,使用振動(dòng)切片機(jī)獲取5~6片300μm厚的含海馬區(qū)腦片,立即轉(zhuǎn)移至呈冰水混合物的人工腦脊液中,體視顯微鏡下參照小鼠大腦圖譜快速取小鼠海馬CA1區(qū)于EP管中,并加入細(xì)胞裂解液。剪碎腦組織并超聲破碎組織,然后低溫離心(10 000×g,10 min),取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。10%的SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉室溫封閉1 h后,孵育兔抗spastin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和鼠抗GADPH多克隆抗體(1∶5 000稀釋)過夜,室溫加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000稀釋),孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影,全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。用ImageJ分析條帶的灰度值,待測蛋白相對(duì)表達(dá)水平=待測蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值,GADPH為內(nèi)參照。

    3.4 冰凍切片制備小鼠用異氟烷深度麻醉,冷生理鹽水經(jīng)心臟灌注,4%多聚甲醛固定。開顱取腦后4%多聚甲醛固定過夜。15%、30%蔗糖梯度脫水,Leica冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片,片厚30μm。

    3.5 尼氏染色為確定重組的sh-Spastin腺相關(guān)病毒載體的表達(dá)范圍,在病毒載體注射C57BL/6小鼠海馬的CA1區(qū)表達(dá)21 d后,取冰凍切片進(jìn)行進(jìn)行尼氏染色:切好的腦片貼于玻片上晾干過夜,次日經(jīng)ddH2O洗2 s,5%甲苯胺藍(lán)水溶液處理10 s,ddH2O洗2s,經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水(各2 min),經(jīng)二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ(各5 min)進(jìn)行透明化,中性樹脂封片后鏡檢。

    3.6 HE染色按美侖HE染色試劑盒使用說明書方法,取冰凍切片進(jìn)行腦片貼片后,室溫晾干過夜,用ddH2O洗10 s進(jìn)行水化;蘇木精染液染3 min,自來水沖洗10 s;1%鹽酸乙醇洗3 s后自來水沖洗10 min;伊紅染液染30 s,自來水沖洗30s;經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水(各2 min)后經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ(各5 min)透明;中性樹脂封片后鏡檢。

    3.7 高爾基染色按高爾基染色試劑盒使用說明書的方法,在注射病毒載體21 d后,用異氟烷深度麻醉處死,取腦組織于4%多聚甲醛液固定48 h,將實(shí)驗(yàn)部位(從背側(cè)海馬開始到腹側(cè)海馬結(jié)束)切成2~3 mm厚腦組織塊,加入高爾基染色液將腦組織完全浸沒,放置陰涼通風(fēng)處避光處理14 d(每隔3 d更換一次新染液),染色完成后取出腦組織塊經(jīng)15%和30%的蔗糖溶液脫水處理,經(jīng)濃氨水處理45 min,蒸餾水洗1 min,定影液處理45 min,蒸餾水洗1 min,30%的蔗糖溶液脫水處理2 d,用振動(dòng)切片機(jī)將腦組織切成100μm厚的腦片,貼于明膠玻片晾干后經(jīng)75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水(各2 min)、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ(各5 min)進(jìn)行透明,中性樹脂封片后用數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行全景多層掃描成像。

    3.8 新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)參照Cohen等[11]新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)方法:將小鼠置于40 cm×60 cm×40 cm無蓋的測試箱中,適應(yīng)5 min后于測試箱內(nèi)放兩個(gè)材質(zhì)、大小、顏色均相同的圓柱體,把小鼠頭部朝向圓柱體訓(xùn)練5 min,1 h后將其中一個(gè)圓柱體換成同材質(zhì)同顏色的正方體(邊長與圓柱體直徑一樣),測試5 min,用Topscanlite 3.0軟件分析小鼠對(duì)新舊物體的嗅探時(shí)間與次數(shù)。正常小鼠對(duì)新物體有明顯偏好,表現(xiàn)為嗅探時(shí)間與次數(shù)顯著增加。

    3.9 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照Nunez等[12]的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法:水迷宮實(shí)驗(yàn)分適應(yīng)、訓(xùn)練、測試、反向訓(xùn)練和反向測試5個(gè)階段。適應(yīng)階段:第1天逃生平臺(tái)(N象限)高出水面1 cm,把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳尋找逃生平臺(tái)。訓(xùn)練階段:第2、3天逃生平臺(tái)位于水面下1 cm,把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳尋找逃生平臺(tái),記錄逃生潛伏期。測試階段:將逃生平臺(tái)撤走,把小鼠從S象限中點(diǎn)放入池中60 s,記錄游泳軌跡,分析穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。反向訓(xùn)練階段:將逃生平臺(tái)放于E象限正中且位于水面下,測試小鼠分別從W、S的中點(diǎn)及交點(diǎn)放入池中,記錄潛伏期。反向測試階段:待測小鼠從W與S交點(diǎn)放入池中并自由游泳60 s,分析穿越新平臺(tái)所在象限的次數(shù)及在此象限的持續(xù)時(shí)間。逃生潛伏期反映小鼠的空間學(xué)習(xí)能力,穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間則反映小鼠的空間記憶能力。

    3.10 腦片電生理檢測參照Guo等[13]腦片電生理記錄方法。在rAAV病毒注射后21 d,異氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠,用冷凍高糖人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF;含212 mmol/L蔗糖、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L Na2CO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2、1 mmol/L Ca-Cl2、15 mmol/L抗壞血酸鈉和3 mmol/L丙酮酸鈉)經(jīng)心臟灌注。打開顱骨,快速取腦轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的氧飽和高糖ACSF中,振動(dòng)切片機(jī)冠狀切片,片厚300 μm,隨后轉(zhuǎn)入氧飽和ACSF(含124 mmol/L NaCl、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L NaHCO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2和1 mmol/L CaCl2),恒溫水浴箱34℃孵育30 min,之后室溫孵育1 h備用。在電壓鉗模式下,首先分別記錄微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)和誘發(fā)的興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,evoked EPSC);其次通過記錄間隔100 ms的配對(duì)脈沖刺激產(chǎn)生的EPSC,分析配對(duì)脈沖比值(paired pulse ratio,PPR)即后一個(gè)刺激的EPSC/前一個(gè)刺激的EPSC的振幅比。最后在電流鉗模式下,進(jìn)行群峰電位(population spike,PS)的記錄。首先記錄一段10 min的基線(群峰電位幅值為最大幅值的30%),然后給高頻刺激(high-frequency stimulation,HFS;4個(gè)100 Hz的串刺激,間隔10 s),接著以1/15 Hz的頻率給予測試刺激記錄40 min以上的群峰電位,誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP;群峰電位幅值超過基礎(chǔ)電位的20%并能夠維持至少30 min)。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,組與組之間的比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05作為差異性檢驗(yàn)水平。

    結(jié) 果

    1 sh-Spastin可有效抑制小鼠海馬spastin的表達(dá)

    圖1A顯示,經(jīng)過尼氏染色的小鼠腦切片,其海馬部位的細(xì)胞帶清晰可見,CA1區(qū)細(xì)胞帶周圍均可見綠色熒光,說明病毒載體的注射位置正確,并且均在海馬CA1區(qū)正常表達(dá)。

    HE染色顯示,實(shí)驗(yàn)組海馬的組織學(xué)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無顯著變化,見圖1B;同時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的體重也無顯著差異,見圖1C。這說明干擾spastin的表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元的形態(tài)以及小鼠的生長發(fā)育均沒有影響。

    Western blot結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組海馬組織中spastin蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),說明sh-Spastin可有效干擾海馬spastin蛋白的表達(dá),見圖1D、E。

    Figure 1.The expression of spastin in hippocampus CA1 area was knocked down by sh-Spastin.A:representative schematic diagram of stereotactic injection(21 d after rAAV injection,×200);B:HEstaining showed that spastin knockdown did not change the structure of hippocampus(×200);C:the body weight of mice after injection of rAAV for 21 d(n=17);D and E:the protein level of spastin in hippocampuswas detected by Western blot(n=3).Mean±SEM.*P<0.05 vs control group.圖1 sh-Spastin敲減海馬CA1區(qū)spastin的表達(dá)

    2 干擾海馬spastin表達(dá)導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙

    新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,訓(xùn)練階段對(duì)照組小鼠對(duì)兩相同物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(左側(cè)31.5±2.7,右側(cè)32.5±1.3,P>0.05),嗅探時(shí)間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[左側(cè)(30.7±3.7)s,右側(cè)(31.7±4.6)s,P>0.05],實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)兩相同物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(左側(cè)25.4±2.5,右側(cè)23.5±2.1,P>0.05),嗅探時(shí)間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[左 側(cè)(23.2±2.7)s,右 側(cè)(21.0±2.3)s,P>0.05];而測試階段對(duì)照組小鼠對(duì)新物體的嗅探次數(shù)顯著多于舊物體(新物體38.6±1.6,舊物體25.5±2.0,P<0.05),對(duì)新物體的嗅探時(shí)間也顯著長于舊物體[新物體(40.5±2.2)s,舊物體(21.8±2.5)s,P<0.05],實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)新舊物體嗅探次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(新物體17.1±1.6,舊物體15.5±1.8,P>0.05),嗅探時(shí)間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[新物體(25.4±2.2)s,舊 物 體(22.4±2.6)s,P>0.05],見圖2。

    Figure 2.Spastin knockdown in hippocampus reduced the preference of the mice for novel object.A:schematic diagram of novel object recognition(NOR)test;B:tracks of mice in different stages of NOR test;Cand D:the sniffing times and time of the mice for objects in training and testing stages,respectively.Mean±SEM.n=16.*P<0.05 vs control group.圖2 海馬區(qū)spastin敲減后小鼠對(duì)新奇物體的偏好減少

    水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的小鼠在適應(yīng)階段均能找到逃生平臺(tái)。在訓(xùn)練階段,相比對(duì)照組小鼠,實(shí)驗(yàn)組小鼠找到逃生平臺(tái)的潛伏期顯著延長[在第2天(D2),對(duì)照組(13.0±1.8)s,實(shí)驗(yàn)組(20.9±2.6)s,P<0.05;在第3天(D3),對(duì)照組(6.1±0.8)s,實(shí)驗(yàn)組(12.7±1.5)s,P<0.05],見圖3B。在測試階段,與對(duì)照組小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠穿越逃生平臺(tái)所在象限的次數(shù)顯著減少(對(duì)照組8.1±0.8,實(shí)驗(yàn)組6.1±0.3,P<0.05),在逃生平臺(tái)所在象限持續(xù)的時(shí)間均顯著減少[對(duì)照組(17.8±1.2)s,實(shí)驗(yàn)組(13.2±0.7)s,P<0.05],見圖3C~F。當(dāng)把逃生平臺(tái)轉(zhuǎn)移至新象限,實(shí)驗(yàn)組小鼠找到逃生平臺(tái)的潛伏期顯著增加[在第5天(D5),對(duì)照組(6.5±1.0)s,實(shí)驗(yàn)組(14.8±3.1)s,P<0.05],見圖3B。在反向測試階段,實(shí)驗(yàn)組小鼠穿越新平臺(tái)所在象限的次數(shù)顯著 減 少(對(duì) 照 組8.7±0.8,實(shí) 驗(yàn) 組6.0±0.7,P<0.05),在目標(biāo)象限持續(xù)的時(shí)間也顯著減少[對(duì)照組(22.7±2.0)s,實(shí)驗(yàn)組(13.7±0.8)s,P<0.05],見圖3G~J。

    3 干擾海馬spastin表達(dá)抑制樹突棘的成熟

    為了明確小鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)變化的基礎(chǔ),我們用高爾基染色觀察了海馬錐體神經(jīng)元突起及樹突棘的改變。結(jié)果顯示,干擾海馬spastin表達(dá)后,錐體神經(jīng)元樹突總長度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[對(duì)照組(1 048±98)μm,實(shí)驗(yàn)組(1 049±64)μm,P>0.05],神經(jīng)元樹突分支數(shù)目的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)照組24.7±3.5,實(shí)驗(yàn)組20.1±1.3,P>0.05),見圖4A~C;Sholl分析顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元樹突交叉點(diǎn)數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖4D。進(jìn)一步分析樹突棘的密度,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,基樹突神經(jīng)元樹突棘的密度顯著降低[對(duì)照組(9.4±0.5)No./10μm,實(shí) 驗(yàn) 組(6.3±0.5)No./10 μm,P<0.05],頂樹突神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低[對(duì)照組(10.1±0.4)No./10μm,實(shí)驗(yàn)組(8.6±0.8)No./10μm,P<0.05],見圖4E、4F、4H;對(duì)樹突棘形態(tài)進(jìn)行的分析顯示,與對(duì)照組相比,基樹突成熟的樹突棘密度顯著降低[對(duì)照組(3.7±0.5)No./10μm,實(shí)驗(yàn)組(2.2±0.3)No./10μm,P<0.05],頂樹突成熟的樹突棘密度也顯著降低[對(duì)照組(4.9±0.5)No./10μm,sh-Spastin:(3.4±0.4)No./10μm,P<0.05],見圖4G、I。

    Figure 3.Spastin knockdown in hippocampus led to impaired spatial memory of the mice.A:flow chart of Morris water maze test;B:line graph of escape latency of mice;Cand G:tracks of mice swimming in probe and reversal probe stages;D,E,F(xiàn),H,I and J:target quadrant crossovers,target quadrant duration and velocity in probe and reversal probe stages.Mean±SEM.n=11-17.*P<0.05 vs control group.圖3 海馬區(qū)spastin敲減后小鼠空間記憶能力下降

    4 干擾海馬spastin的表達(dá)后突觸傳遞受損

    全細(xì)胞膜片鉗記錄mEPSC的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞mEPSC的振幅顯著降低[對(duì)照組(15.4±1.0)pA,實(shí)驗(yàn)組(8.4±0.5)pA,P<0.05],頻率亦顯著降低[對(duì)照組(1.3±0.1)Hz,實(shí)驗(yàn)組(0.5±0.1)Hz,P<0.05],見圖5A~C。全細(xì)胞膜片鉗記錄evoked EPSC的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,evoked EPSC的最大振幅顯著降低[對(duì)照組(806±28)pA,實(shí)驗(yàn)組(476±15)pA,P<0.05],見圖5D、E。PPR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間PPR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)照組1.72±0.12,實(shí)驗(yàn)組1.66±0.03,P>0.05),見圖5F、G。

    為了進(jìn)一步檢測突觸傳遞效能是否受損,我們在海馬切片上檢測了小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元的PS,以評(píng)估LTP是否受到影響。圖6A顯示了LTP檢測過程中PS記錄示意圖。高頻刺激后,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)均能被誘導(dǎo)產(chǎn)生LTP,實(shí)驗(yàn)組LTP的水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05),見圖6B、C;LTP初始階段(高頻刺激后0~10 min),實(shí)驗(yàn)組PS的幅度與對(duì)照組相比顯著降低[對(duì)照組(176±9)%,實(shí)驗(yàn)組(124±5)%,P<0.05];在LTP的維持階段(高頻刺激后30~40 min),PS的幅度也顯著降低[對(duì)照組(166±6)%,實(shí)驗(yàn)組(117±2)%,P<0.05],見圖6D。

    討 論

    本實(shí)驗(yàn)通過小鼠大腦立體定位注射spastin干擾病毒敲減海馬spastin的表達(dá),在不影響小鼠自身生長發(fā)育的情況下,分析神經(jīng)元樹突棘發(fā)育異常及其失功能是否參與認(rèn)知功能障礙。實(shí)驗(yàn)首先明確了海馬CA1區(qū)干擾spastin的表達(dá)后,可導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙,表現(xiàn)為海馬spastin敲減的小鼠對(duì)新事物的偏好降低,空間學(xué)習(xí)記憶能力下降;然后通過形態(tài)學(xué)分析檢測到海馬錐體細(xì)胞樹突棘缺失,同時(shí)成熟的樹突棘數(shù)量減少。進(jìn)一步用腦片電生理技術(shù)記錄到海馬的突觸傳遞功能發(fā)生障礙,從而明確了干擾spastin的表達(dá)系通過抑制突觸傳遞而介導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能障礙。

    編碼spastin蛋白的SPAST基因突變是導(dǎo)致HSP的重要原因[1-2],HSP患者主要表現(xiàn)為雙下肢的運(yùn)動(dòng)功能障礙,然而復(fù)雜型HSP除運(yùn)動(dòng)障礙外,往往還伴隨著認(rèn)知功能異常,如注意力、學(xué)習(xí)記憶能力下降等[4-5]。影像學(xué)的資料顯示,HSP患者大腦出現(xiàn)皮質(zhì)萎縮、白質(zhì)變薄和脫髓鞘等病變[14-16],提示SPAST基因突變通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙。SPAST全基因敲除的小鼠不僅表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙,而且工作記憶和聯(lián)想記憶受損[17],為了明確HSP認(rèn)知功能障礙是否由于與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)——海馬區(qū)域的失功能造成的,在本研究中我們特異性的干擾小鼠海馬區(qū)spastin的表達(dá),結(jié)果顯示spastin敲減的小鼠新舊物體的識(shí)別能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力均降低,從而明確了HSP認(rèn)知功能障礙受海馬區(qū)spastin功能的調(diào)控。

    Figure 5.Spastin knockdown in hippocampus inhibited the function of synapse.A:representative traces of mEPSC for 1 s and 10 s(left)and average traces of mEPSC(right);Band C:cumulative probability distribution plots of amplitude and inter-event intervals of mEPSC(the bar charts inside indicated amplitude and frequency of mEPSC;n=7-11);D and E:representative recording of evoked EPSCand input-output curves(n=7-9);F and G:representative recording of paired pulse ratio(PPR)and bar chart of PPR(n=6-8).Mean±SEM.*P<0.05 vs control group.圖5 海馬區(qū)spastin敲減后突觸功能受到抑制

    作為一種微管切割蛋白,spastin主要通過其AAA結(jié)構(gòu)域行使微管切割、釋放微管動(dòng)力末端的功能,從而改變神經(jīng)元突起的形成[6]。細(xì)胞水平的研究顯示,過表達(dá)spastin促進(jìn)突起分支的形成,提高樹突野的復(fù)雜性,而干擾spastin則抑制突起分支形成并降低樹突野的復(fù)雜性[18]。我們在體用病毒注射敲減小鼠海馬spastin后,并沒有觀察到樹突長度和分支的改變,而觀察到位于樹突表面的樹突棘的密度顯著降低,尤其是成熟樹突棘的密度降低最為顯著。樹突棘作為興奮性神經(jīng)元的突觸后組份,在突觸傳遞和可塑性中扮演著重要的角色。臨床上諸多神經(jīng)精神性疾病所致的認(rèn)知功能障礙,比如阿爾茨海默病、精神分裂癥、自閉癥和抑郁癥等[18-20],都集中體現(xiàn)在樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變上[21]。我們通過腦片電生理記錄到mEPSC幅度和頻率在spastin敲減后顯著降低,說明敲減spastin不僅造成了樹突棘結(jié)構(gòu)的改變也同時(shí)影響了樹突棘的功能。前期我們的研究也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)spastin可明顯增加離體培養(yǎng)神經(jīng)元mEPSC的頻率和幅度[18],這充分說明了spastin可通過改變樹突棘可塑性參與認(rèn)知功能的調(diào)控。此外,spastin改變樹突棘可塑性可能與AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),AMPA受體是樹突棘表面重要的離子型谷氨酸受體,介導(dǎo)了90%以上的興奮性突觸后電流,研究顯示spastin的MIT結(jié)構(gòu)域與AMPA受體亞單位存在直接相互作用,而且過表達(dá)spastin可促進(jìn)AMPA受體GluA2亞單位在樹突表面的表達(dá)[18]。雖然spastin主要功能是切割微管,然而其MIT結(jié)構(gòu)域還參與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的形成以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[22],提示spastin有可能通過促進(jìn)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)改變樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能,這有待我們后續(xù)進(jìn)一步的研究。

    Figure 6.Spastin knockdown inhibited CA3-CA1 LTP in hippocampus.A:schematic diagram of population spike(PS)recording;B:representative recordings of PSbefore(Pre)and after(Post)high-frequency stimulation(HFS);C:changes of PSamplitude(%of baseline)after a HFS,measured from control(7 cells,7 mice)or sh-Spastin(6 cells,6 mice)groups;D:PSamplitude(%of baseline)0 min to 10 min and 30 min to 40 min after HFS(n=10).Mean±SEM.*P<0.05 vs control group.圖6 敲減spastin后海馬區(qū)CA3-CA1突觸LTP被抑制

    突觸傳遞的LTP是反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的重要指標(biāo)[23],無論何種原因造成的樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變,需最終體現(xiàn)在突觸傳遞可塑性的變化上。我們實(shí)驗(yàn)中記錄的LTP的結(jié)果顯示,干擾spastin的表達(dá)后,誘導(dǎo)出的LTP的幅度較對(duì)照組顯著降低,說明敲減spastin后樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的改變進(jìn)一步造成了突觸傳遞效能的減弱,從而導(dǎo)致了小鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。

    綜合我們的結(jié)果,雖然spastin的主要功能是切割微管,然而缺失spastin改變了樹突棘的形態(tài)結(jié)構(gòu),而導(dǎo)致突觸傳遞功能受損,從而引起學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙,缺失spastin所致的突觸傳遞功能受損可能是HSP患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的原因。

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