CRISPR-Cas系統(tǒng)在微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

格日樂其木格, 牛振峰, 董丹, 張濤濤, 崢嶸

1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097

微生物種類繁多，與我們的生活密切相關(guān)，很多抗生素、免疫抑制劑、除草劑等醫(yī)療和農(nóng)業(yè)相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物都來源于微生物。同時(shí)，自然界還存在著一些有害微生物，如致病真菌、細(xì)菌、病毒等。CRISPR-Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-crispr associated proteins)的發(fā)展，促進(jìn)了微生物的基因功能和次級(jí)代謝產(chǎn)物的挖掘等方面的研究工作。除此之外，CRISPR-Cas系統(tǒng)也展現(xiàn)出核酸檢測(cè)應(yīng)用的潛力。本文主要從CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理、分類、微生物基因編輯和核酸檢測(cè)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，旨在為相關(guān)研究提供借鑒。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)概述

CRISPR-Cas系統(tǒng)就是細(xì)菌漫長(zhǎng)生活史中進(jìn)化出的一種具有免疫記憶的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用于抵制外源核酸及噬菌體的入侵[1]。該系統(tǒng)于1987年由日本科學(xué)家在大腸埃希菌(Escherichiacoli)中發(fā)現(xiàn)[2]。CRISPR基因座通常由許多間隔的重復(fù)序列與非重復(fù)的間隔序列(這些序列主要對(duì)應(yīng)于捕獲的病毒和質(zhì)粒序列片段)組成，并且通常與Cas基因(CRISPR相關(guān))相鄰(圖1)。Cas基因編碼一個(gè)大型的異質(zhì)蛋白質(zhì)家族，該家族攜帶典型的核酸酶、解旋酶、聚合酶和多核苷酸結(jié)合蛋白的功能域[3]。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

1.1 作用機(jī)理

CRISPR-Cas的免疫應(yīng)答主要包括三個(gè)階段:適應(yīng)、表達(dá)和干擾。在適應(yīng)階段，一種Cas蛋白復(fù)合物在識(shí)別出特定的前間隔序列鄰近基序(PAM)后結(jié)合到目標(biāo)DNA上，并分裂出目標(biāo)DNA的一部分，即前間隔序列。再將其整合到自身CRISPR序列中，使其成為新的間隔序列。人們還發(fā)現(xiàn)Cas1和Cas2這兩種高度保守的蛋白在這一階段中起著關(guān)鍵作用[2, 4]；在表達(dá)階段，CRISPR陣列通常被轉(zhuǎn)錄為一個(gè)單一的pre-CRISPR RNA(pre-crRNA)，隨后被Cas內(nèi)切酶(如Cas6)或非Cas蛋白(如RNaseⅢ)加工成更小、更成熟的CRISPR RNA(crRNA)[5]；在干擾階段，由成熟的crRNA與單個(gè)或多個(gè)Cas蛋白形成的復(fù)合物識(shí)別并裂解侵入核酸[6]。

1.2 分類

2011年Makarova等[7]通過對(duì)Cas蛋白序列和結(jié)構(gòu)的比較分析，將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為三種類型(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)以及未分類的系統(tǒng)(U型)。所有這些系統(tǒng)都包含兩個(gè)通用基因：Cas1和Cas2。Cas1編碼一種沒有序列特異性的金屬依賴性DNA酶DNAse，可將外源DNA(間隔序列)整合到CRISPR序列中。Cas2編碼一種金屬依賴性核糖核酸內(nèi)切酶，可能還參與間隔序列獲取階段。三種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成基因組各不相同，并且每種都有其獨(dú)特的特征基因來表征[8]。Ⅰ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的特征基因?yàn)镃as3，其包含HD磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域和DExH解旋酶結(jié)構(gòu)域[6]，該系統(tǒng)還可分為6種亞型(IA-IF)。Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為2種亞型，其特征基因是Cas9，該基因編碼一種含有HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域和 RuvC 核酸酶結(jié)構(gòu)域蛋白。Ⅰ型系統(tǒng)進(jìn)行防御時(shí)需要幾種蛋白質(zhì)來完成，而Ⅱ型系統(tǒng)僅需要Cas9核酸酶進(jìn)行防御[9]。最后一種Ⅲ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，其特征基因?yàn)镃as10(編碼一種結(jié)構(gòu)域與核酸聚合酶和核苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域同源的蛋白)，Ⅲ型系統(tǒng)也分為2種亞型(ⅢA，ⅢB)，而且兩個(gè)亞型靶向不同的核酸[6, 8]。

隨著新類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)不斷被發(fā)現(xiàn)，在2015年Makarova等再一次對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行了分類。根據(jù)Cas蛋白在干擾階段的體系結(jié)構(gòu)，將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類：1類(多蛋白效應(yīng)復(fù)合體)和2類(單蛋白效應(yīng)復(fù)合體)系統(tǒng)[10-11]。1類系統(tǒng)(包括類型Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ)存在于細(xì)菌和古細(xì)菌，2類系統(tǒng)(包括類型Ⅱ，Ⅴ和Ⅵ)幾乎完全限于細(xì)菌[5, 12]。其中Ⅳ、Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)的特征基因分別為Csf1、Cas12和Cas13[4, 10, 13]。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為2大類，6個(gè)類型，33個(gè)亞型(圖2)。由于2類系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，是目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR-Cas系統(tǒng)。

圖2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在微生物基因編輯中的應(yīng)用

2.1 真菌中CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

目前CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已應(yīng)用于多種真菌基因的功能研究中。早在2013年，DiCarlo等[14]首次利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)成功在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中敲除了細(xì)胞膜精氨酸透性酶CAN1基因，使單鏈及雙鏈靶基因斷裂效率分別提高至5和130倍，同源重組率接近100%。2017年劉倩等[15]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地在嗜熱真菌(Myceliophthorathermophila)和嗜熱毀絲霉(Myceliophthoraheterothallica)中進(jìn)行基因編輯，并對(duì)纖維素酶生產(chǎn)途徑中的4個(gè)基因(CRE-1、RES-1、GH1-1和ALP-1)同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的編輯。利用該系統(tǒng)產(chǎn)生了多個(gè)表現(xiàn)出明顯超纖維素酶生產(chǎn)的突變菌株，其分泌的蛋白質(zhì)和木質(zhì)纖維素酶活性顯著增加(分別達(dá)到野生型菌株的5和13倍)。但仍存在需要復(fù)雜的獨(dú)立表達(dá)盒來靶向多重基因組位點(diǎn)，以及有限數(shù)量的可用選擇性標(biāo)記基因等局限性。2019年，他們利用前期構(gòu)建的CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，建立了一種基于V型AsCas12a核酸酶的新型基因組編輯系統(tǒng)對(duì)絲狀真菌進(jìn)行基因編輯[16-17]。Cas12a核酸酶只需要一個(gè)Pol Ⅲ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)幾個(gè)小的crRNAs[18]?；谶@個(gè)特性CRISPR-Cas12a系統(tǒng)可以同時(shí)刪除或插入多個(gè)基因。他們還研發(fā)了一種標(biāo)記回收方法，并將其稱為CRISPR-Cas-assisted marker recycling technology(Camr technology)，通過CRISPR-Cas12a/Cas9系統(tǒng)去除標(biāo)記基因，實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記的回收和循環(huán)使用。再通過 Camr technology 系統(tǒng)對(duì)嗜熱毀絲霉基因組進(jìn)行了三輪轉(zhuǎn)化。最終共編輯了纖維素酶分泌途徑的9個(gè)關(guān)鍵靶基因和兩個(gè)選擇性標(biāo)記基因neo和bar，得到了蛋白質(zhì)產(chǎn)量和木質(zhì)纖維素酶活性分別比野生型高9和18.5倍的M9突變體[16-17]。成功解決了絲狀真菌中無法進(jìn)行多輪編輯的難題，也讓絲狀真菌中的多基因編輯變得更加簡(jiǎn)單高效。2020年劉倩等[19]再一次以嗜熱真菌為宿主，結(jié)合2A肽策略和CRISPR-Cas9技術(shù)異源表達(dá)MhglaA和egfp兩個(gè)基因，獲得了與野生菌株相比蛋白質(zhì)產(chǎn)量和淀粉酶活性分別提高約12.0和8.2倍的工程菌。實(shí)現(xiàn)了絲狀真菌中多個(gè)基因的異源共表達(dá)。上述幾種技術(shù)提高了嗜熱真菌的工業(yè)價(jià)值，也為絲狀真菌的基因編輯提供了新思路。

2.2 細(xì)菌中CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

2.2.1放線菌中的應(yīng)用放線菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，占土壤微生物群的13%～30%，是臨床藥物(如甲酸霉素、法沙霉素、2-烷基-4-羥基喹啉、紅霉素等[20-22])和工業(yè)天然產(chǎn)物的主要來源之一[23]。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的誕生給放線菌新的次生代謝產(chǎn)物挖掘工作帶來了助力工具。與傳統(tǒng)方法相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在放線菌中的應(yīng)用具有效率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。早在2015年研究人員在鏈霉菌中成功構(gòu)建了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)并在變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)等多種鏈霉菌中進(jìn)行了基因編輯[24-26]。2018年Tong等[27]開發(fā)了一個(gè)用于放線菌基因組編輯的高效CRISPR-Cas9工具包。該工具包包括sgRNA識(shí)別軟件、基因簇敲除系統(tǒng)、基因功能喪失研究系統(tǒng)、生成隨機(jī)大小刪除庫(kù)的系統(tǒng)和一個(gè)用于基因敲除的系統(tǒng)。該團(tuán)隊(duì)成功在StreptomycescoelicolorA3(2)和StreptomycescollinusTu 365中進(jìn)行基因編輯，證明了該工具包的實(shí)用性。雖然CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功用于放線菌遺傳操作，但由于DNA雙鏈斷裂(DSBs)而引起的基因組不穩(wěn)定和Cas9的(過)表達(dá)導(dǎo)致大量不必要的非靶效應(yīng)等問題仍然存在。

為了解決這些問題，他們又開發(fā)了單核苷酸分辨率基因組編輯系統(tǒng)(CRISPR-base editing system,CRISPR-BEST)，CRISPR-BEST與CRISPR-Cas9的區(qū)別在于不需要產(chǎn)生DSBs。針對(duì)sgRNA識(shí)別的目標(biāo)序列，CRISPR-cBEST(使用胞苷脫氨)可以有效地將C：G堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為T：A堿基對(duì)；CRISPR-aBEST(使用腺苷脫胺)可以將A：T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為G：C堿基對(duì)(圖3)。此外，該系統(tǒng)通過提供基于Csy4(還稱為I-F型CRISPR相關(guān)內(nèi)切核糖核酸酶Cas6；GenBank登錄號(hào)：PHP80843.1)的sgRNA處理系統(tǒng)來支持單個(gè)質(zhì)粒的多重編輯[28-29]。目前CRISPR-BEST已應(yīng)用于多種鏈霉菌中。然而，正確編輯突變體的篩選和質(zhì)粒消除的過程仍然是耗時(shí)費(fèi)力的。為了解決這個(gè)問題，Wang等[30]開發(fā)了一個(gè)基于兩個(gè)顯色報(bào)告系統(tǒng)(GusA和IdgS)的放線菌CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)促進(jìn)了陽(yáng)性克隆篩選和質(zhì)粒消除兩個(gè)過程，并在放線菌StreptomycescoelicolorM145和Verrucosisporasp.MS100137中完成了不同片段大小的基因敲除，證明這個(gè)系統(tǒng)是更快和更有效的基因編輯系統(tǒng)。

圖3 CRISPR-BEST系統(tǒng)的作用機(jī)制[29]

2.2.2其他細(xì)菌中的應(yīng)用CRISPR-Cas系統(tǒng)主要以兩種形式在細(xì)菌中進(jìn)行基因編輯：引入外源CRISPR-Cas系統(tǒng)和利用自身的CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯[31]。Walker等[9]分別用原生Ⅰ-B型系統(tǒng)和異源Ⅱ型GeoCas9系統(tǒng)對(duì)嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)進(jìn)行了基因編輯。并通過將兩種基因編輯系統(tǒng)與同源重組酶(Exo/Beta，來自Acidithiobacilluscaldus)結(jié)合起來，提升同源重組效率，從而提高編輯效率。Ⅰ-B型系統(tǒng)的編輯效率由原來的40%增加到71%，Ⅱ型GeoCas9系統(tǒng)的編輯效率由12.5%增加到94%。Suzuki等[32]構(gòu)建了一個(gè)適用于變形菌門(Proteobacteria)的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)。將來自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9基因引入到宿主范圍廣泛的質(zhì)粒pBBR1MCS-2中，構(gòu)建質(zhì)粒pBBR1-Cas9，應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)沙雷菌(Shewanellaoneidensis)MR-1的crp基因進(jìn)行了編輯。

假單胞菌(Pseudomonas)是一類具有重要生物醫(yī)學(xué)、生態(tài)和工業(yè)意義的革蘭氏陰性菌。Chen等[33]報(bào)道了利用CRISPR-Cas9和噬菌體λ-Red重組系統(tǒng)構(gòu)建的基因組編輯系統(tǒng)pCasPA/pACRISPR，該系統(tǒng)可以對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行有效的遺傳操作。他們還進(jìn)一步開發(fā)了一個(gè)堿基編輯系統(tǒng)pnCasPA-BEC，能夠高效地對(duì)多種假單胞菌進(jìn)行基因失活和點(diǎn)突變，如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)等。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

病原體是人類的一大威脅，它們?cè)谌蚍秶鷥?nèi)自由傳播。因此，迫切需要提高檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)效率，以便及早發(fā)現(xiàn)。其中分子診斷發(fā)揮了關(guān)鍵作用，核酸檢測(cè)是主要的分子診斷方法之一[34]。2019年末新冠疫情的爆發(fā)也提醒著人們，核酸檢測(cè)技術(shù)在疫情防控中起著重要作用。一個(gè)高效、便捷的核酸檢測(cè)技術(shù)可以為疫情防控爭(zhēng)取更多的時(shí)間。

因此，迫切需要一種具有高靈敏度和高特異性的核酸檢測(cè)方法。此前，張鋒研究團(tuán)隊(duì)和Jennifer Doudna研究團(tuán)隊(duì)分別利用Cas12a和Cas13在目標(biāo)序列的激活下非特異性切割ssDNA和RNA的特性開發(fā)了SHERLOCK[35](specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)、DETECTR[36](DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)兩種核酸檢測(cè)技術(shù)。這兩種核酸檢測(cè)技術(shù)可以用來檢測(cè)HPV(human papillomavirus，人乳頭瘤病毒)、Zika virus(寨卡病毒)、Dengue virus(登革熱病毒)等病毒[36-37]。同樣也可以檢測(cè)COVID-19 virus(新型冠狀病毒)，在疫情爆發(fā)之后，張鋒等根據(jù)新冠病毒全基因組序列研發(fā)了檢測(cè)COVID-19 virus的技術(shù)。他們針對(duì)COVID-19 virus設(shè)計(jì)了識(shí)別S基因和Orf1ab基因的兩個(gè)向?qū)NA(sgRNA)。這樣，一旦檢測(cè)樣本中含有COVID-19 virus，sgRNA就會(huì)引導(dǎo)Cas13核酸酶切割這兩個(gè)病毒基因，從而激活Cas13核酸酶非特異性切割報(bào)告基團(tuán)并可以在基因試紙上形成視覺可見的條帶[38-40](圖4)。將經(jīng)過處理的樣品滴在試紙上5 min之內(nèi)就可以看到結(jié)果，在試紙上出現(xiàn)兩個(gè)條帶說明結(jié)果為陽(yáng)性[39]。該方法結(jié)合重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)，能夠?qū)颖局泻哿康暮怂嵩诤銣貤l件下進(jìn)行大量擴(kuò)增，因此具有高靈敏度(10～100拷貝·μL-1即可檢測(cè)出)，從處理樣品到出結(jié)果全程不超過1 h且操作簡(jiǎn)便，如果該技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化并推向市場(chǎng)有望彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足[40]。

圖4 不同輸入濃度橫向流量讀出的示例圖像[39]

4 展望

CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展給微生物基因功能研究帶來了助力工具。近幾年CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)也在不斷更新，從最初的CRISPR-Cas9編輯技術(shù)到可以對(duì)絲狀真菌同時(shí)進(jìn)行多基因編輯的CRISPR-Cas12a，再到可以對(duì)鏈霉菌進(jìn)行堿基編輯避免了DNA雙鏈斷裂引起的基因組不穩(wěn)定性和Cas9蛋白過表達(dá)導(dǎo)致的非靶效應(yīng)等問題的CRISPR-BEST。CRISPR堿基編輯的誕生也更加豐富了微生物的遺傳操作“工具箱”。

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)因靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低為醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)目標(biāo)帶來了很大的便利，SHERLOCK已被用于細(xì)菌和病毒傳染病病原體的檢測(cè)和基因分型，包括區(qū)分單核苷酸變異和尋找抗生素耐藥基因[37]。我們可以利用SHERLOCK區(qū)分新冠病毒的變異毒株，早發(fā)現(xiàn)早隔離，防止新冠疫情大規(guī)模爆發(fā)。并且CRISPR-Cas核酸檢測(cè)技術(shù)還在不斷優(yōu)化，Melika等[41]認(rèn)為CRISPR-Cas13不僅可以用來檢測(cè)COVID-19 virus,還有治療COVID-19 virus引起的疾病的潛力。新冠疫情為科研人員敲響了警鐘，要不斷地探索發(fā)現(xiàn)才能在危難時(shí)刻迅速找到應(yīng)對(duì)之法。相信在不久的將來CRISPR-Cas系統(tǒng)還會(huì)應(yīng)用到更多的領(lǐng)域，給人類帶來更多的驚喜。