2型糖尿病患者血漿褪黑素水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究△

萬偉偉 龍洋 劉宏卓 萬文萃

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，糖尿病患者中DR患病率高達(dá)51.3%，是工作年齡階段失明的主要原因[1-2]。目前現(xiàn)有的診治手段不能有效避免DR的進(jìn)展，早期篩查在DR的診治中具有重要的意義。生物標(biāo)志物現(xiàn)已被用于各種疾病的診斷和分類中，包括糖尿病和DR[3]。褪黑素是一種內(nèi)源性吲哚胺類物質(zhì)，由松果體和部分視網(wǎng)膜合成，具有抗氧化和抗凋亡作用，與多種代謝性疾病有關(guān)，對腦、心、肝等重要器官具有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在DR的治療中具有潛在的作用[4-5]。目前，國內(nèi)外有關(guān)血漿褪黑素濃度與DR相關(guān)性研究很少見。因此，本研究通過檢測2型糖尿病患者血漿中褪黑素濃度，旨在分析其與DR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用前瞻性病例對照研究。收集2020年5月至10月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院篩查糖尿病者300人。其中，體檢確認(rèn)無糖尿病者118人為對照組，確診為2型糖尿病并于眼科就診的182例患者為研究組。將研究組患者再分為無DR組(NDR組 57例)、非增生型DR組(NPDR組 64例)和增生型DR組(PDR組 61例)。2型糖尿病的診斷依據(jù)2019年美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association,ADA )標(biāo)準(zhǔn)[6]。根據(jù)眼底照相及裂隙燈檢查對DR進(jìn)行診斷和分類，依據(jù)2019年美國眼科學(xué)會《糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床指南》進(jìn)行分級。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)健康對照或2型糖尿病伴或不伴DR;(2)能夠配合科研活動;(3)研究前簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷為1型糖尿病;(2)精神障礙或嚴(yán)重睡眠障礙患者;(3)近2周口服褪黑素補充者。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：2020-KY-395)，所有受試者在研究前均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料與生化指標(biāo)獲取方法通過咨詢受試者獲得所有研究對象基本資料，如年齡、糖尿病病程、高血壓史、吸煙史、飲酒史等。根據(jù)體質(zhì)量計算每名研究對象體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。生化指標(biāo)：如甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血清總膽紅素(Tb)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、25羥基維生素D3[25(OH)VitD3]和甲狀旁腺激素(PTH)，從院內(nèi)檢查系統(tǒng)中提取。DR的診斷由兩名眼科專家結(jié)合眼底照相及眼底檢查進(jìn)行獨立診斷，并在進(jìn)一步分析前行一致性檢查。

1.2.2 血樣采集與褪黑素濃度檢測收集對照組、NDR組、NPDR、PDR組所有研究對象早晨800血液樣本2 mL，靜脈血標(biāo)本置于裝有乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中，置于冰上，4 ℃ 3000 r·min-1離心15 min獲得血漿標(biāo)本。使用前將所有血漿樣本放入凍存管(1.5 mL)，-80 ℃保存。為測定血漿中褪黑素的濃度，樣品采用人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Glory Science Co.， Ltd，TX，美國)進(jìn)行檢測。每個樣本檢查3次，取其平均值將用于最終的數(shù)據(jù)分析。分析評估兩組研究對象間基本資料的可比性，測量并記錄各組研究對象血漿褪黑素濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用配對t檢驗，三組以上差異檢測采用單因素方差分析。定性資料比較采用卡方檢驗。采用受試者特征曲線(ROC)檢驗相關(guān)指標(biāo)的有效性。Spearman分析褪黑素濃度與其他各檢測指標(biāo)的相關(guān)性，Logistic 回歸分析NPDR及PDR可能的危險因素。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及生化指標(biāo)比較各組研究對象間性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.947)；而對照組、NDR組、NPDR組、PDR組研究對象年齡比較，NPDR組、PDR組患者年齡均大于對照組(均為P<0.001)。各組研究對象間BMI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)，SBP、DBP和MAP差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)，而PDR組患者高血壓患病率較高。NDR組、NPDR組、PDR組患者糖尿病病程、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)含量比較，差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)。各組研究對象間TG、TC、LDL-C、HDL-C和PTH差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。此外，各組研究對象間Tb、hs-CRP、Hcy及25(OH)VitD3差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組一般資料及生化指標(biāo)比較

2.2 血漿褪黑素水平與DR的相關(guān)性分析對照組、NDR組、NPDR組及PDR組人員血漿褪黑素濃度分別為(72.83±16.25)ng·L-1、(60.38±13.43)ng·L-1、(44.48±10.30)ng·L-1和(44.69±8.95)ng·L-1，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比，NDR組患者血漿褪黑素濃度較低(P<0.001)。與NDR組相比，NPDR組和PDR組患者血漿褪黑素濃度較低(P< 0.001)。通過ROC曲線分析檢測血漿褪黑素濃度對DR的診斷作用，發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度可作為潛在的診斷DR的生物標(biāo)志物(AUC=0.893，P<0.001)，且cut off為0.685時敏感度為0.896、特異度為0.789(見圖1A)；通過分析NPDR組、PDR組、NDR組的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素水平對糖尿病患者中DR的診斷作用，cut off為0.593時敏感度為0.856、特異度為0.737(見圖1B)；與對照組相比可發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度對診斷DR患者具有很高的敏感度和特異度(見圖1C、D、E)。

圖1 各組血漿褪黑素水平及ROC曲線 A:NPDR組+PDR組 vs NDR組+對照組的ROC曲線，cut off為0.685時敏感度為0.896、特異度為0.789；B:NPDR組+PDR組 vs NDR組的ROC曲線，cut off=0.593時敏感度為0.856、特異度為0.737；C:NPDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.738時敏感度為0.891、特異度為0.847；D:PDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.773時敏感度為0.934、特異度為0.839；E:NPDR組+PDR組vs對照組的ROC曲線，cut off為0.751時敏感度為0.912,特異度為0.839。

2.3 DR患者生化指標(biāo)與NPDR/PDR風(fēng)險的相關(guān)性分析為了分析不同分期DR的生化指標(biāo)危險因素，本研究進(jìn)一步分析了FBG濃度、HbA1C含量、血清Tb、血漿褪黑素濃度、hs-CRP、Hcy、25(OH)VitD3、PTH與NPDR/PDR發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。結(jié)果顯示，較高的hs-CRP、FBG和較低的褪黑素濃度、25(OH)VitD3均與NPDR風(fēng)險增加相關(guān)(均為P<0.001)；在對PDR風(fēng)險檢測的進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)，較高的HbA1C含量、hs-CRP和較低的25(OH)VitD3是PDR的危險因素(均為P<0.001)(見表2)。

表2 生化指標(biāo)和NPDR/PDR風(fēng)險之間的多因素Logistic回歸分析

2.4 生化指標(biāo)與血漿褪黑素濃度的相關(guān)性血漿褪黑素濃度可作為DR診斷的特異性指標(biāo)，進(jìn)一步研究生化指標(biāo)與血漿褪黑素濃度之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，PTH與血漿褪黑素濃度無相關(guān)性(r=0.014,P=0.808)；FBG、HbA1C含量、hs-CRP和Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.464、-0.481、-0.663、-0.607,均為P<0.001)；血清Tb、25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度均呈顯著正相關(guān)(均為P<0.001)(見表3)。

表3 生化指標(biāo)與血漿褪黑素濃度的相關(guān)性

2.5 血清Tb和褪黑素濃度之間的關(guān)系基于血清Tb和褪黑素濃度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，在不同組別中對這一關(guān)系進(jìn)行了更深入研究，結(jié)果顯示：在所有受試者中，血清Tb和褪黑素濃度之間存在顯著的線性相關(guān)(R2=0.438，P<0.001)?？紤]到不同的DR分期，NPDR組和PDR組患者血清Tb與褪黑素濃度之間存在顯著相關(guān)性(R2=0.360、0.183，均為P<0.001)(見圖2)。

圖2 各組受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性關(guān)系 A:所有受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析;B:NPDR組患者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析;C:PDR組患者血清Tb與血漿褪黑素濃度的線性分析。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對照組與研究組對象間血漿褪黑素濃度不同，并且與對照組和NDR組相比，NPDR組和PDR組患者血漿褪黑素濃度明顯降低。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血漿褪黑素濃度對DR的診斷效果具有高度敏感性和特異性。因此可以認(rèn)為：血漿褪黑素可以作為DR的靈敏度較高的診斷標(biāo)志物。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，對照組和研究組受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。hs-CRP的增高和25(OH)VitD3的降低均與DR的進(jìn)展有關(guān)。各組研究對象間Hcy的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但與DR患病風(fēng)險的研究中無明顯的相關(guān)性。另外，PTH與DR的患病風(fēng)險無明顯的相關(guān)性。

生物標(biāo)志物在DR診斷中的價值越來越引起人們的重視，國內(nèi)有報道稱衰老標(biāo)記蛋白30的降低與DR的進(jìn)展有關(guān)，并可作為DR早期的干預(yù)靶點[7]。Platania等[8]的研究中一組miRNA被確定為DR的潛在診斷標(biāo)記物。有報道稱中國2型糖尿病患者的血清CA125水平與DR的存在和嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。以上研究為診斷DR生物標(biāo)志物的開發(fā)提供了可行性保障。褪黑素作為一種對哺乳動物生物節(jié)律起重要調(diào)節(jié)作用的激素被大家所熟知[10]。有研究表明，褪黑素具有重要的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步預(yù)防各種疾病，包括心血管疾病、神經(jīng)血管疾病和糖尿病，包括繼發(fā)于糖尿病的并發(fā)癥[11]。也有研究表明PDR患者褪黑素分泌減少[12]，因為褪黑素作為抗氧化劑/線粒體保護(hù)因子和炎癥因子，可能導(dǎo)致DR的進(jìn)展。本研究與此不一致的是，與對照組和NDR組相比，NPDR組患者血漿褪黑素濃度降低。這可能因為本研究的樣本量相比以上研究較大，ELISA檢測方法可能導(dǎo)致兩項研究結(jié)果差異。

本研究中所有受試者血清Tb與血漿褪黑素濃度呈顯著正相關(guān)。膽紅素是由血紅素分解代謝產(chǎn)生的，研究發(fā)現(xiàn)其對血管具有抗炎和抗氧化作用[13]。國內(nèi)有研究認(rèn)為[14]，在2型糖尿病患者中，女性的Tb水平與DR的患病風(fēng)險存在U形關(guān)系，而男性患者Tb水平與DR的患病風(fēng)險存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]。Zhu等[16]在一項基于1637位受試者的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，DR患者的血清Tb水平明顯低于2型糖尿病患者。還有學(xué)者認(rèn)為，較高水平的Tb對DR具有保護(hù)作用。膽紅素和褪黑素在DR的進(jìn)展中生理作用相似，這可能是二者之間呈正相關(guān)的原因。在血漿褪黑素濃度的Spearman分析中還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BG、HbA1C、hs-CRP、Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。國內(nèi)外有研究表明hs-CRP是一種主要由肝臟合成的蛋白質(zhì)，提示其是全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標(biāo)志物，可加速DR的進(jìn)展[17-18]。Hcy是一種血管損傷性氨基酸，可以充分反映血管病變情況，且與2型糖尿病患者血管病變有一定相關(guān)性[19-20]。Alcubierre等[21]研究發(fā)現(xiàn)，25(OH)VitD3濃度與DR相關(guān)，且濃度越低DR的進(jìn)展越嚴(yán)重。本研究結(jié)果與其相符，且進(jìn)一步證明了血漿褪黑素濃度是診斷DR的敏感指標(biāo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DR患者血漿褪黑素濃度降低，血漿褪黑素可作為診斷DR的敏感、特異指標(biāo)，血清Tb與褪黑素濃度呈顯著正相關(guān)，而hs-CRP、Hcy與血漿褪黑素濃度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而25(OH)VitD3與血漿褪黑素濃度呈正相關(guān)。本研究的局限性在于納入樣本量小和未進(jìn)行長期的隨訪。此外，褪黑素的分泌具有晝夜節(jié)律性，本研究中所有受試者只選擇了一個標(biāo)準(zhǔn)時間點，接下來的研究中我們將進(jìn)一步檢測更多的時間點，以利于測量褪黑素分泌的晝夜節(jié)律；同時進(jìn)行合理的研究設(shè)計并構(gòu)建動物模型，進(jìn)一步探究褪黑素對DR的保護(hù)作用及具體的分子機(jī)制。