黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響及其可能機(jī)制△

楊濤 柴盼盼 何啟紅 潘家鈺 彭正虹 康剛勁

在發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家，白內(nèi)障是糖尿病患者失明的主要原因之一[1]。糖尿病可能引起一系列并發(fā)癥，包括微循環(huán)異常和代謝紊亂等，在眼部可表現(xiàn)為白內(nèi)障，其原理在于高糖可能引起晶狀體代謝紊亂，從而誘發(fā)糖尿病性白內(nèi)障[2]。黃芩苷是從植物燈盞花中提取的黃酮類化合物，在中國(guó)廣泛用于治療心腦血管疾病[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)黃芩苷的系統(tǒng)研究表明，黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗缺血等多種藥理作用，同時(shí)對(duì)糖尿病、腫瘤、神經(jīng)變性、青光眼等多種疾病具有治療作用。氧化還原敏感信號(hào)系統(tǒng)Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (Keap1)-核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2 (Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)在應(yīng)激、炎癥、致癌和促凋亡條件下對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用[4-6]。本研究以人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3為研究對(duì)象，觀察黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是否有作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3(ATCC公司，美國(guó))，黃芩苷(成都曼斯特生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，CCK-8溶液(同仁化學(xué)研究所，日本)，F(xiàn)ITC-PI凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司，德國(guó))，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1抗體(Abcam公司，英國(guó))，Bax抗體(Proteintech中國(guó)公司)，GAPDH抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HLE-B3細(xì)胞培養(yǎng)于低糖(含5.6 mmol·L-1葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并及時(shí)傳代。

1.2.2 CCK-8法篩選黃芩苷最佳作用濃度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLE-B3細(xì)胞以1×104個(gè)·mL-1接種于96孔板中，同步化后，分別加入濃度為0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1的黃芩苷處理48 h，每濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。處理完成后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(D)值，計(jì)算各濃度黃芩苷處理后的細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞活力結(jié)果篩選出黃芩苷的最佳作用濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLE-B3細(xì)胞隨機(jī)分為3組，其中，正常組：用低糖DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞48 h；高糖組：先用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再用含200 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；黃芩苷組：用含5 μmol·L-1黃芩苷的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，再用含200 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力CCK-8法檢測(cè)正常組、高糖組、黃芩苷組細(xì)胞活力，具體操作步驟同1.2.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值記錄。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率分組處理后收集各組HLE-B3細(xì)胞，PBS清洗3次，胰蛋白酶消化，用含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后離心，棄上清，PBS重懸2次，重懸后分別離心，棄上清液，然后每組加入100 μL 1×binding buffer混勻，避光加入5 μL FITC染色液及5 μL碘化丙啶(PI)染色液再次混勻，避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀(Thermo公司，美國(guó))檢測(cè)，記錄各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)分組處理后收集各組HLE-B3細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Keap1的上游引物為5’- CCAATGCTGACACGAAGGAT -3’，下游引物為5’- ATACAGTTGTGCAGGACGCAG -3’，引物長(zhǎng)度為194 bp；Nrf2的上游引物為5’- CAGTCAGCGACGGAAAGAGTA -3’，下游引物為5’- CTGGGAGTAGTTGGCAGATCC -3’，引物長(zhǎng)度為196 bp；HO-1的上游引物為5’-GCCAGCAACAAAGTGCAAGA-3’，下游引物為5’-TAAGGACCCATCGGAGAAGC-3’，引物長(zhǎng)度為100 bp；NQO1的上游引物為5’-TGGTGGAGTCGGACCTCTATG-3’，下游引物為5’-CATGGCAGCGTAAGTGTAAGC-3’，引物長(zhǎng)度為287 bp；Bax的上游引物為5’-TCTGAGCAGATCATGAAGACAGG-3’，下游引物為5’-ATCCTCTGCAGCTCCATGTTAC-3’，引物長(zhǎng)度為191 bp；Bcl-2的上游引物為5’-AGGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3’，下游引物為5’-AGCCAGGAGAAATCAAACAGAG-3’，引物長(zhǎng)度為209 bp；GAPDH的上游引物為5’-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3’，下游引物為5’-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’，引物長(zhǎng)度為259 bp。采用2-ΔΔCt計(jì)算Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)分組處理后收集各組HLE-B3細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液(碧云天，中國(guó))在冰上提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Keap1(稀釋比例11000)、Nrf2(稀釋比例15000)、NQO1(稀釋比例110 000)、HO-1(稀釋比例12000)、Bax(稀釋比例11000)、Bcl-2(稀釋比例 11000)一抗4 ℃過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比例13000)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參分析各組細(xì)胞中各蛋白灰度值比值。

1.2.8 酶標(biāo)法檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD活力和MDA、GSH-Px含量實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。分組處理后收集各組HLE-B3細(xì)胞，棄上清后PBS清洗3次，胰蛋白酶消化，用含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后以1000 r·min-1的速度離心10 min，棄上清，PBS重懸1次，離心，棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入0.3 mL生理鹽水，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，超聲裂解，酶標(biāo)法檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD活力和MDA、GSH-Px含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組樣本均數(shù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法篩選黃芩苷最佳作用濃度結(jié)果CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示， 0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1的黃芩苷處理HLE-B3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力分別為(100.00±0.00)%、(126.86±0.04)%、(95.48±0.05)%、(91.12±0.05)%、(60.04±0.13)%、(42.36±0.0)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.52，P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，5 μmol·L-1黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力最強(qiáng)，與其他濃度黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);50 μmol·L-1、100 μmol·L-1黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力均明顯減弱，與其他濃度黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05);50 μmol·L-1與100 μmol·L-1黃芩苷處理后HLE-B3細(xì)胞活力相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？梢?，5 μmol·L-1黃芩苷作用48 h可顯著促進(jìn)HLE-B3細(xì)胞活力，隨著黃芩苷濃度升高，HLE-B3細(xì)胞活力逐漸下降。因此，本研究選擇5 μmol·L-1的黃芩苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞活力結(jié)果與正常組HLE-B3細(xì)胞活力(100.00±0.00)%相比，高糖組HLE-B3細(xì)胞活力明顯降低，為(73.52±1.71)%，兩組細(xì)胞活力相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.520，P=0.000)；黃芩苷組HLE-B3細(xì)胞活力為(92.36±3.61)%，較高糖組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.719，P=0.009)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞凋亡率結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組、高糖組、黃芩苷組細(xì)胞凋亡率分別為(7.93±0.22)%、(57.12±2.63)%、(42.09±1.04)%，組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=237.90，P=0.000)。兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組、黃芩苷組細(xì)胞凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.680、32.250，均為P=0.000)；與高糖組相比，黃芩苷組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.328，P=0.006)(見圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞的凋亡率 A:正常組；B:高糖組；C:黃芩苷組。

2.4 RT-PCR檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)結(jié)果正常組、高糖組、黃芩苷組間HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 2148.00、201.10、530.40、27.93、42.97、1069.00，均為P=0.000)。兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組Keap1、Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.050、14.040，均為P<0.01)，Nrf2、NQO1、Bcl-2、HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.050、47.790、48.390、7.063，均為P<0.01)；與高糖組相比，黃芩苷組Keap1、Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.494、24.100，均為P=0.000)，Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.175，P=0.000；t=2.924，P=0.002；t=4.076，P=0.015；t=2.943,P=0.012)(見表1)。

表1 各組HLE-B3細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 Western-blot檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)結(jié)果正常組、高糖組、黃芩苷組間HLE-B3細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、Bax、Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.62，P=0.017；F=38.52，P=0.000；F=2478.00，P=0.000；F=102.20，P=0.000；F=166.50，P=0.000；F=41.16，P=0.000)。兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組Keap1、Bax的蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.800，P=0.019；t=16.950，P=0.000)，Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.050，P=0.000；t=55.620，P=0.000；t=15.080，P=0.000；t=8.084，P=0.001)；與高糖組相比，黃芩苷組Keap1、Bax的蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.657，P=0.022；t=11.360，P=0.000)，Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.657，P=0.023；t=21.590，P=0.000；t=6.596，P=0.003；t=2.919，P=0.043)(見圖2)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)情況 與正常組相比，*P<0.05;與高糖組相比，#P<0.05。

2.6 酶標(biāo)法檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞中SOD活力和MDA、GSH-Px含量結(jié)果正常組、高糖組及黃芩苷組間HLE-B3細(xì)胞中SOD活力、GSH-Px含量、MDA含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組HLE-B3細(xì)胞中SOD活力、GSH-Px含量均降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.652、10.410、19.660，均為P<0.05)；與高糖組相比，黃芩苷組HLE-B3細(xì)胞中SOD活力、GSH-Px含量均升高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.300、7.448、14.620，均為P<0.05)(見表2)。

表2 各組HLE-B3細(xì)胞中SOD活力和GSH-Px、MDA含量

3 討論

晶狀體是人眼最重要的屈光介質(zhì)之一，生理狀態(tài)下為透明、無血管的組織，晶狀體大部分的代謝活動(dòng)能夠保護(hù)晶狀體蛋白和其他細(xì)胞成分免受氧化應(yīng)激的損傷[7]。隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展、年齡的增長(zhǎng)、物理化學(xué)損傷、炎癥等的刺激，晶狀體的正常代謝活動(dòng)及正常組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，逐漸由透明變?yōu)榛鞚?，進(jìn)而影響視力。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為主要有以下三種機(jī)制：非酶糖基化、氧化應(yīng)激和多元醇通路[8]?，F(xiàn)有的研究表明，白內(nèi)障的發(fā)生與氧化應(yīng)激、自由基損傷、晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡等有關(guān)[9-10]。氧化應(yīng)激被定義為自由基和活性代謝物的產(chǎn)生及其消除之間的不平衡[11]，這種不平衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而對(duì)整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生潛在的不利影響。有研究表明，人體中的氧化應(yīng)激狀況與血糖調(diào)節(jié)的損害相關(guān)，其也是糖尿病性白內(nèi)障的主要危險(xiǎn)因素[12]。高血糖可使氧自由基增加，破壞晶狀體本身所具有的抗氧化應(yīng)激機(jī)制和導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。高糖可誘發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果顯示，高糖干預(yù)后，HLE-B3細(xì)胞凋亡率明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD活力及GSH-Px含量均明顯下降，MDA含量上升。

黃芩苷能抑制肝細(xì)胞的凋亡[13]，減慢糖尿病腎病等并發(fā)癥的發(fā)展[14]，保護(hù)顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[15]，是治療炎癥、白內(nèi)障、糖尿病視網(wǎng)膜病變等的理想藥物[16]。近年來，黃芩苷在各種疾病中的應(yīng)用取得了很大的進(jìn)展，黃芩苷已被應(yīng)用于阿爾茨海默病、幽門螺桿菌感染、糖尿病的血管并發(fā)癥以及某些癌癥的治療中[17]，但在白內(nèi)障中的相關(guān)研究尚未見開展。本研究結(jié)果表明，5 μmol·L-1的黃芩苷可以減輕高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3的凋亡和氧化應(yīng)激，流式細(xì)胞術(shù)及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于高糖組，低濃度黃芩苷干預(yù)后HLE-B3細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bax mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；酶標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示，低濃度黃芩苷干預(yù)后HLE-B3細(xì)胞SOD活力及GSH-Px含量均較高糖組升高，MDA含量較高糖組降低。由此提示，低濃度黃芩苷可以通過抑制凋亡和氧化應(yīng)激來延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，低濃度黃芩苷對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3有保護(hù)作用，但隨著濃度增高，此種作用卻不再明顯。黃芩苷可以在不同的細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的作用，也有研究顯示，黃芩苷在同一種細(xì)胞中具有雙重作用。Zhu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的黃芩苷可以促進(jìn)血管中的上皮細(xì)胞增殖，而高濃度黃芩苷則通過誘導(dǎo)其凋亡來抑制血管生成；Lu等[18]研究顯示，低濃度黃芩苷可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收，而高濃度時(shí)則對(duì)破骨細(xì)胞的分化有抑制作用。由此我們推測(cè)，黃芩苷在人晶狀體上皮細(xì)胞中也可能具有雙重作用，但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

Keap1-Nrf2-ARE通路是對(duì)抗氧化應(yīng)激最有效的防御系統(tǒng)之一，它能調(diào)節(jié)許多抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。Nrf2是一種重要的核轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，Keap1是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)器，正常情況下，Keap1與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以復(fù)合物的形式相結(jié)合，Nrf2通過泛素化蛋白酶體途徑被泛素化而被降解[7]。超過細(xì)胞自由基清除系統(tǒng)能力的活性氧的超生理水平可以引起氧化應(yīng)激并激活促炎途徑[19]，為響應(yīng)氧化應(yīng)激，Nrf2從Keap1釋放到細(xì)胞核，并與一種小Maf蛋白(肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物)異源二聚化。該復(fù)合物激活了一系列抗氧化和細(xì)胞保護(hù)蛋白的ARE依賴基因表達(dá)[20]。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是一個(gè)綜合的氧化還原體系，可以通過多個(gè)途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡。Nrf2信號(hào)通路調(diào)控的抗氧化蛋白酶主要包括HO-1、過氧化物酶-1、SOD、GSH-Px和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)多種氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等都具有相關(guān)性[5-6]。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，Müller細(xì)胞呈Nrf2陽(yáng)性，且Keap1-Nrf2-ARE參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[21]；Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷顯著上調(diào) Nrf2信號(hào)通路及其下游基因表達(dá)，以對(duì)抗雞支原體誘導(dǎo)的雞胸腺細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡；另有研究顯示，黃芩苷可通過激活Nrf2/ho-1介導(dǎo)的HIF-1alpha-BNIP3通路，減輕缺氧引起的心肌細(xì)胞H9c2凋亡[23]；Meng等[24]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷通過Nrf2-HO-1信號(hào)通路對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免受脂多糖誘導(dǎo)的嚴(yán)重肺損傷；相關(guān)的其他研究有：黃芩苷通過激活Nrf2/HO-1通路來降低腎組織的氧化應(yīng)激，從而對(duì)抗心臟手術(shù)相關(guān)急性腎損傷[25]；黃芩苷在高血糖狀態(tài)下的內(nèi)皮保護(hù)作用可能部分歸因于其通過Akt-GSK3B-fyn介導(dǎo)的Nrf2激活下調(diào)活性氧和炎癥的作用[26]；黃芩苷通過激活TBI小鼠Akt-Nrf2通路，起到神經(jīng)保護(hù)作用[27]；黃芩苷通過阻斷Nrf2與Keap1的結(jié)合，誘導(dǎo)Nrf2磷酸化，激活Nrf2，從而減輕乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝毒性[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度黃芩苷可以使Keap1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Nrf2下游相關(guān)的NQO1、HO-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高。提示低濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上，黃芩苷可通過Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，但詳細(xì)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究為延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路。