miR-24對過氧化氫誘導的HLE-B3細胞凋亡的影響及其與線粒體Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途徑的關系△

閆利霞 黃曉 張鑫 鄭廣瑛

白內障是常見的眼科疾病，會導致嚴重的視力障礙[1]。白內障主要由人晶狀體上皮細胞氧化應激損傷以及細胞凋亡等病理改變引起[2-3]。微小RNA-24(miR-24)在白內障患者中高表達，能促進晶狀體上皮細胞凋亡，但其具體作用機制尚不完全清楚[4]。Jeong等[5]研究結果顯示，過表達miR-24對線粒體功能具有破壞作用，因此他們推測miR-24可能通過線粒體途徑影響晶狀體上皮細胞的凋亡過程。第二個線粒體衍生的胱天蛋白酶激活因子/低等電位點的凋亡抑制蛋白的直接結合蛋白(the second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI，Smac/Diablo)是一種線粒體促凋亡蛋白，其基因敲低能夠減弱過氧化氫(H2O2)誘導的晶狀體上皮細胞凋亡作用[6]，但這是否與miR-24存在關聯(lián)及其具體作用機制尚不清楚。本研究探討miR-24對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞凋亡的影響，分析其與線粒體Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途徑的關系，以期為臨床預防和治療白內障提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要實驗材料HLE-B3細胞(CRL-11421)來源于ATCC細胞庫， JC-1線粒體膜電位熒光探針購自北京索萊寶有限公司，H2O2購自南京化學試劑股份有限公司，miR-24 抑制劑、miR-24 NC試劑盒由廣州銳博生物技術有限公司設計。

1.1.2 主要實驗儀器CO2細胞培養(yǎng)箱、定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，酶標儀購自美國Bio-Tek公司，流式細胞儀(CytoFLEX)購自美國貝克曼公司，倒置熒光顯微鏡(FRD-4C)購自北京世紀科信科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HLE-B3細胞的培養(yǎng)將購買的HLE-B3細胞使用含有體積分數10%胎牛血清、10 g·L-1青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液重懸后，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度約為85%，傳代，收集3～5代對數生長期的細胞接種于96孔板、6孔板或24孔板，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞H2O2損傷模型的構建和細胞存活率計算分別用不同濃度(0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1和400 μmol·L-1)的H2O2處理1.2.1中培養(yǎng)的HLE-B3細胞24 h，每個濃度設置6個復孔。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱孵化2 h，測量450 nm處各孔光密度(D)值，計算細胞存活率，確定H2O2干擾濃度設置值。細胞存活率(%)=藥物處理組D值/不含藥物處理組D值×100%。

1.2.3 細胞分組及轉染實驗將HLE-B3細胞分為對照組、H2O2組、H2O2+miR-24 NC組和H2O2+miR-24 抑制劑組。先按照miR-24抑制劑、miR-24 NC試劑盒說明書分別轉染H2O2+miR-24抑制劑組和H2O2+miR-24 NC組細胞24 h，然后向H2O2組、H2O2+miR-24 NC組和H2O2+miR-24 抑制劑組HLE-B3細胞中加入200 μmol·L-1H2O2干預24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗，另將正常培養(yǎng)的HLE-B3細胞設置為對照組。

1.2.4 檢測各組HLE-B3細胞基因表達情況按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，逆轉錄得cDNA，取2 μL cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，條件如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火，延伸30 s，40個循環(huán)。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞miR-24相對表達量。miR-24和U6引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成(見表1)。

表1 miR-24和U6引物序列

1.2.5 各組細胞凋亡情況檢測各組HLE-B3細胞用預冷的PBS清洗2次，離心取沉淀，加入500 μL Binding Buffer重懸后，依次添加10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混勻并避光保存15 min，添加Binding Buffer至總量為2 mL，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.6 線粒體膜電位檢測吸除各組HLE-B3細胞培養(yǎng)液，添加1 mL JC-1染色工作液，置于培養(yǎng)箱孵育20 min，采用熒光探針JC-1法檢測線粒體膜電位變化情況(利用紅綠熒光強度比反映線粒體膜電位)。

1.2.7 采用線粒體提取實驗進行細胞質和線粒體分級按照線粒體提取試劑盒說明書步驟，將各組HLE-B3細胞用冰冷的PBS清洗后收集，添加預冷的Lysis Buffer重懸細胞，12 000 r·min-1離心30 min，收集上清液作為細胞質分級，沉淀作為線粒體分級，用于后續(xù)實驗。

1.2.8 線粒體和細胞質分級中Smac/Diablo蛋白表達采用蛋白免疫印跡法檢測各組HLE-B3細胞線粒體和細胞質分級中Smac/Diablo蛋白表達，分別向各組細胞線粒體分級中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取等量蛋白樣品，經SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1 h，加入一抗Smac/Diablo和β-actin(11000)，4 ℃過夜，加入二抗(15000)，曝光顯影并分析各條帶。按照上述方法提取各組細胞質分級中Smac/Diablo、XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0分析實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 H2O2濃度的確定采用CCK-8檢測不同濃度H2O2對HLE-B3細胞存活率的影響，50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1和400 μmol·L-1H2O2干預后的HLE-B3細胞存活率均低于0 μmol·L-1H2O2干預的細胞存活率，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；當H2O2濃度大于200 μmol·L-1時，細胞存活率均小于50 %，后續(xù)實驗以200 μmol·L-1作為最適H2O2濃度(見表2)。

表2 不同濃度H2O2對HLE-B3細胞存活率的影響

2.2 各組HLE-B3細胞miR-24表達情況實時熒光定量PCR檢測各組HLE-B3細胞miR-24表達情況結果顯示，對照組、H2O2組、H2O2+miR-24 NC組和H2O2+miR-24抑制劑組miR-24相對表達量分別為1.04±0.02、2.73±0.09、2.69±0.07和1.15±0.06；與對照組相比，H2O2組HLE-B3細胞中miR-24 表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+miR-24 NC組相比，H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞中miR-24表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，但H2O2組與H2O2+miR-24 NC組HLE-B3細胞中miR-24表達差異不大(P>0.05)。

2.3 各組HLE-B3細胞存活率和細胞凋亡率與對照組相比，H2O2組細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；與H2O2組和H2O2+miR-24 NC組相比，H2O2+miR-24抑制劑組細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，但H2O2組與H2O2+miR-24 NC組細胞存活率和細胞凋亡率差異不大(均為P>0.05)(見表3)。

表3 miR-24轉染對H2O2誘導下HLE-B3細胞存活率和細胞凋亡率的影響

2.4 各組HLE-B3細胞線粒體膜電位(紅綠熒光強度比)對照組、H2O2組、H2O2+miR-24 NC組和H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞紅綠熒光強度比分別為0.24±0.02、0.12±0.02、0.15±0.03、0.31±0.06。與對照組相比，H2O2組HLE-B3細胞紅綠熒光強度比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+miR-24 NC組相比，H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞紅綠熒光強度比升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，但H2O2組與H2O2+miR-24 NC組HLE-B3細胞紅綠熒光強度比變化不大，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 各組HLE-B3細胞Smac/Diablo、XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表達與對照組相比，H2O2組線粒體分級中Smac/Diablo蛋白及細胞質分級中XIAP蛋白表達降低，細胞質分級中Smac/Diablo、caspase-9和caspase-3蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；與H2O2組與H2O2+miR-24 NC組相比，H2O2+miR-24抑制劑組線粒體分級中Smac/Diablo蛋白及細胞質分級中XIAP蛋白表達升高，細胞質分級中Smac/Diablo、caspase-9和caspase-3蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，但H2O2組與H2O2+miR-24 NC組線粒體、細胞質分級中Smac/Diablo蛋白及細胞質分級中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表達變化均不大，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(見圖1和表4)。

圖1 各組HLE-B3細胞線粒體、細胞質分級中Smac/Diablo、XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表達電泳圖

表4 各組HLE-B3細胞線粒體、細胞質分級中Smac/Diablo及細胞質分級中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表達

3 討論

白內障的發(fā)展與年齡相關，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量[7]。H2O2是活性氧家族的非自由基成員，會使晶狀體上皮細胞產生不可逆凋亡，從而使患者晶狀體混濁甚至導致失明。因此H2O2可作為模擬白內障發(fā)生過程中晶狀體上皮細胞氧化損傷的理想誘導劑[8]。本研究以不同濃度H2O2誘導HLE-B3細胞氧化應激損傷，結果顯示當H2O2濃度超過200 μmol·L-1時，細胞損傷嚴重(大于50%)，不利于后續(xù)研究，因此本實驗選擇200 μmol·L-1H2O2作為HLE-B3細胞氧化應激損傷模型的最佳濃度。

細胞凋亡是多細胞生物發(fā)生的程序性死亡形式，在各種生理和病理事件中起關鍵作用[9]。miRNA作為癌基因或抑癌基因，能夠通過調節(jié)細胞凋亡過程參與疾病的發(fā)生發(fā)展[10-11]。Ge等[12]研究發(fā)現(xiàn)，上調miR-24表達能夠減輕膿毒癥引起的心肌細胞凋亡及心肌損傷；顏淵鴛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內皮細胞中，抑制miR-24表達能夠促進H2O2誘導的細胞增殖，降低細胞凋亡率。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2組HLE-B3細胞miR-24表達水平、細胞凋亡率均高于對照組，細胞存活率低于對照組，提示H2O2誘導后HLE-B3細胞中miR-24表達上升，這可能與細胞的增殖和凋亡有關。此外，H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞miR-24表達水平和細胞凋亡率低于H2O2組和H2O2+miR-24 NC組，細胞存活率則升高，提示下調miR-24表達能夠減輕H2O2誘導的HLE-B3細胞氧化應激損傷，進一步抑制細胞凋亡。白內障的發(fā)病機制與miRNA緊密相關，研究證實miR-24在白內障患者體內高表達，因此推測miR-24可能在預防和治療白內障中具有潛在作用[4,14]。

線粒體膜電位在細胞凋亡中起重要作用，電位降低是細胞發(fā)生早期凋亡的特異性指標之一[15]。Jeong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-24過表達破壞了線粒體功能，可能與胰島素抵抗有關。本研究結果顯示，H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞紅綠熒光強度比高于H2O2組和H2O2+miR-24 NC組，提示降低miR-24表達水平可能通過提高線粒體膜電位降低膜通透性，推測miR-24對HLE-B3細胞凋亡的影響可能與線粒體密切相關。Smac/Diablo是一種線粒體促凋亡蛋白，可以負調控凋亡抑制蛋白家族成員促進細胞凋亡[16]。XIAP是一種普遍存在的IAP，可以抑制線粒體凋亡途徑的起始蛋白caspase-9表達，又能夠干擾下游效應蛋白酶caspase-3活化，發(fā)揮抗凋亡作用[17]。Paul等[18]報道誘導細胞凋亡后Smac/Diablo被釋放至細胞質，中和了XIAP對胱天蛋白酶的抑制作用，從而加重細胞凋亡。本研究結果顯示，H2O2+miR-24抑制劑組HLE-B3細胞線粒體分級中Smac/Diablo和細胞質分級中XIAP蛋白表達高于H2O2組和H2O2+miR-24 NC組，細胞質分級中Smac/Diablo、caspase-9和caspase-3蛋白表達則降低，提示下調miR-24可能通過抑制Smac/Diablo向細胞質釋放，促進XIAP表達，抑制caspase-9和caspase-3活化，因此推測miR-24可能通過調控線粒體凋亡途徑，發(fā)揮對H2O2誘導損傷情況下HLE-B3細胞的保護作用。

綜上所述，miR-24可能通過抑制線粒體Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途徑，抑制H2O2誘導的HLE-B3細胞凋亡，推測miR-24可能是治療白內障的潛在有效靶標，這為白內障的臨床治療提供了新思路。