miRNA-19對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究△

李珂 項(xiàng)奕

葡萄膜黑色素瘤(UM)發(fā)病率僅次于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，位居眼部腫瘤第二位[1]。 大多數(shù)UM患者在診斷時往往已處于晚期[2]。 在手術(shù)切除眼球治療后10年內(nèi)，近50%的UM患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，最常見的累及臟器是肝臟，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[3]。微小RNA(miRNA)是小RNA分子，長度一般在22 nt左右，miRNA可靶向作用于mRNA分子，沉默其表達(dá)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用[4]。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 參與UM的生物學(xué)過程，包括侵襲、轉(zhuǎn)移及分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[5-6]。miR-19基因位于3號染色體上，可調(diào)控淋巴瘤、乳腺癌、胃癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[7-8]。本研究探討UM細(xì)胞系中miR-19的表達(dá)及其對UM細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料UM細(xì)胞系SP6.5、M23及正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19均購自美國ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、Transwell小室、轉(zhuǎn)染系統(tǒng)LipofectamineTM3000均購自美國Invitrogen公司，一抗/絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、表皮生長因子受體(EGFR)、磷酸化表皮細(xì)胞生長因子受體(p-EGFR)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)及GAPDH均購自美國Cell signaling公司，羊抗兔二抗購自武漢博士德生物科技公司，miR-19 inhibitor及scramble序列均由北京碧云天生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組UM細(xì)胞系SP6.5、M23及正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19經(jīng)培養(yǎng)后，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染M23細(xì)胞并分成兩組：miR-19 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-19-inhibitor)、miR-19 NC組(轉(zhuǎn)染scramble),UM細(xì)胞系M23轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-19表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測根據(jù)Trizol 操作說明書，使用Trizol從細(xì)胞系中分離出總RNA。 按Invitrogen公司的Trizol reagent說明書將組織適當(dāng)均質(zhì)化以提高提取效率。 使用一步法PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒(TaKaRa，日本)對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用ABI 7500熒光定量-PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行定量分析，反應(yīng)條件:94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 2 min,共40個循環(huán)。 使用2-ΔΔCt方法以U6 作為內(nèi)參，檢測miR-19的相對表達(dá)水平。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力將miR-19 inhibitor組、miR-19 NC組細(xì)胞按每孔1×104個接種于96孔板,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后,每孔加入20 μL MTT溶液,在490 nm波長下測定光密度值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值繪制兩組細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將miR-19 inhibitor組、miR-19 NC組細(xì)胞經(jīng)Annexin V/PI雙染后制成單細(xì)胞懸液，Binding Buffer后重懸，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,將miR-19 inhibitor組、miR-19 NC組細(xì)胞培養(yǎng)至融合，用無菌吸引器槍頭劃線，并觀察培養(yǎng)0 h及48 h時兩組細(xì)胞的愈合情況，計(jì)算劃痕細(xì)胞面積和劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力miR-19 inhibitor組及miR-19 NC組各取2×103個細(xì)胞,接種于Transwell小室上室,經(jīng)培養(yǎng)后將小室膜下的穿膜細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛(10 g·L-1)固定后，再用結(jié)晶紫(2 g·L-1)染色，染色完成后計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)(200倍視野),膜下細(xì)胞數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.2.7 Western blot 檢測各組細(xì)胞EGFR/AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)Western blot 檢測EGFR/AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)，將miR-19 inhibitor組、miR-19 NC組細(xì)胞裂解測定蛋白濃度后，定量并上樣，經(jīng)濃縮膠和分離膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入AKT、p-AKT、EGFR、p-EGFR、mTOR、p-mTOR及GAPDH一抗，并于4 ℃條件下孵育過夜，漂洗3次后加入二抗，室溫孵育2 h后加入顯影劑并在顯影儀下顯影，計(jì)算各種目的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測結(jié)果qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19中miR-19 相對表達(dá)量為1.35±0.13，UM細(xì)胞系SP6.5與M23 miR-19相對表達(dá)量分別為8.35±0.73、9.35±0.43，SP6.5及M23細(xì)胞系miR-19相對表達(dá)量均高于ARPE-19細(xì)胞系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.2 MTT法檢測結(jié)果M23 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染后，miR-19 inhibitor組、miR-19 NC組細(xì)胞中miR-19表達(dá)量分別為1.05±0.33、8.05±0.64，miR-19 inhibitor組miR-19表達(dá)量低于miR-19 NC組(P<0.01)，提示細(xì)胞沉默成功。MTT法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h，miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組細(xì)胞光密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h，miR-19 inhibitor組細(xì)胞光密度值均低于miR-19 NC組(均為P<0.05)(圖1)。

圖1 MTT法檢測miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組細(xì)胞增殖 與miR-19 NC組比較，*P<0.05。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，miR-19 inhibitor組細(xì)胞凋亡率為(15.34±2.35)%，顯著高于miR-19 NC組細(xì)胞凋亡率 (8.23±0.72)%，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組細(xì)胞凋亡

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h,miR-19 inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率為(23.7±2.1)%,顯著低于miR-19 NC組細(xì)胞劃痕愈合率(68.9±5.1)%,兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組細(xì)胞遷移能力

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果miR-19 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)為 (45.1±3.9) 個,顯著少于miR-19 NC組侵襲細(xì)胞數(shù)(115.3±8.9) 個， 兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.6 Western blot檢測兩組EGFR/AKT/m-TOR信號通路蛋白的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-19 NC組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)量為1.02±0.02，顯著高于miR-19 inhibitor組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)量0.43±0.03，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-19 NC組細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)量為1.12±0.05，顯著高于miR-19 inhibitor組細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)量0.52±0.04，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-19 NC組細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)量為1.41±0.06，顯著高于miR-19 inhibitor組mTOR蛋白表達(dá)量0.63±0.05，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 Western blot檢測miR-19 inhibitor組與miR-19 NC組細(xì)胞中不同蛋白表達(dá)

3 討論

UM好發(fā)于40～60歲成人，早期癥狀隱匿，腫瘤增大后可出現(xiàn)視力下降和新生血管性青光眼[9]。UM發(fā)病率呈逐漸增加趨勢，總體發(fā)病率為30%，治療方式包括眼球摘除術(shù)、質(zhì)子照射和放射敷貼治療[10]。盡管如此，UM 易發(fā)生轉(zhuǎn)移，80%～90%的UM患者轉(zhuǎn)移至肝臟，增加患者治愈難度[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 參與UM發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等階段[12]。miR-155 在UM癌組織中表達(dá)水平升高，其高表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且在體外細(xì)胞系中上調(diào)miR-155 表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示[14]，miR-367 參與UM的進(jìn)展，同時體外培養(yǎng)癌細(xì)胞顯示其可通過激活磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移。可將UM患者分為高危和低風(fēng)險人群，且可很好地預(yù)測患者預(yù)后[15]。

miR-19 是最先在心血管中鑒定的RNA分子，最近發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，發(fā)揮類似原癌基因的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19相比，UM細(xì)胞系SP6.5和M23 中miR-19 表達(dá)上調(diào)。有研究報道在胃癌細(xì)胞系[14]和體外培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系[17]中均發(fā)現(xiàn)miR-19 表達(dá)上調(diào)，這與本研究結(jié)果相似，提示miR-19 發(fā)揮原癌基因的作用。當(dāng)M23細(xì)胞系中miR-19 表達(dá)水平被沉默后，可顯著抑制M23細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)凋亡，提示沉默miR-19表達(dá)可抑制UM細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

EGFR基因定位于人7號染色體上，是一種多功能跨膜糖蛋白，在多種腫瘤中被激活，發(fā)揮促進(jìn)增殖、抑制凋亡、促進(jìn)新生血管形成及提高腫瘤侵襲功能的作用[18]。EGFR在突變時會引起EGFR表達(dá)異常,PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/MAPK、STAT3 等為EGFR信號通路蛋白[18]。當(dāng)細(xì)胞外信號激活EGFR時，級聯(lián)激活并磷酸化下游的AKT，進(jìn)而激活mTOR信號分子，VEGF作為EGFR/AKT/mTOR信號通路的效應(yīng)分子，調(diào)控著腫瘤細(xì)胞增殖、生長及細(xì)胞周期[19]。另一方面，活化的 EGFR 磷酸化 AKT， 可作用于下游靶基因Caspase-9 并使其失活，并促進(jìn)抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞凋亡[20]。本研究沉默M23細(xì)胞中miR-19表達(dá)后下調(diào)EGFR、AKT及mTOR蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖被抑制，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與EGFR/AKT/mTOR信號通路被抑制有關(guān)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),M23細(xì)胞中沉默miR-19表達(dá)后，細(xì)胞遷移和侵襲能力受抑制，沉默miR-19表達(dá)發(fā)揮抑癌功能。最近有研究顯示[21]，在體外培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，上調(diào)miR-19表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲，與本研究結(jié)果一致。其機(jī)制可能與下調(diào)EGFR抑制VEGF表達(dá)，進(jìn)而抑制遷移及侵襲過程有關(guān)，具體的機(jī)制有待更進(jìn)一步研究。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)UM細(xì)胞中miR-19表達(dá)上調(diào)，敲低miR-19表達(dá)可抑制UM細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與EGFR/AKT/mTOR信號通路被抑制有關(guān)，miR-19 在UM中發(fā)揮促癌基因功能，有望成為UM診斷和預(yù)后的潛在生物靶標(biāo)。